Home

Verordening (EG) n r. 440/2008 van de Commissie van 30 mei 2008 houdende vaststelling van testmethoden uit hoofde van Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH) (Voor de EER relevante tekst)

Verordening (EG) n r. 440/2008 van de Commissie van 30 mei 2008 houdende vaststelling van testmethoden uit hoofde van Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH) (Voor de EER relevante tekst)

2008R0440 — NL — 23.07.2012 — 003.001


Dit document vormt slechts een documentatiehulpmiddel en verschijnt buiten de verantwoordelijkheid van de instellingen

►B

VERORDENING (EG) Nr. 440/2008 VAN DE COMMISSIE

van 30 mei 2008

houdende vaststelling van testmethoden uit hoofde van Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH)

(Voor de EER relevante tekst)

(PB L 142, 31.5.2008, p.1)

Gewijzigd bij:




▼B

VERORDENING (EG) Nr. 440/2008 VAN DE COMMISSIE

van 30 mei 2008

houdende vaststelling van testmethoden uit hoofde van Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH)

(Voor de EER relevante tekst)



DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,

Gelet op Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad van 18 december 2006 inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH), tot oprichting van een Europees Agentschap voor chemische stoffen, houdende wijziging van Richtlijn 1999/45/EG en houdende intrekking van Verordening (EEG) nr. 793/93 van de Raad en Verordening (EG) nr. 1488/94 van de Commissie alsmede Richtlijn 76/769/EEG van de Raad en de Richtlijnen 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG en 2000/21/EG van de Commissie (1), en met name op artikel 13, lid 3,

Overwegende hetgeen volgt:

(1)

Krachtens Verordening (EG) nr. 1907/2006 dienen op communautair niveau testmethoden te worden vastgesteld voor de beproeving van stoffen indien een dergelijke beproeving vereist is om informatie over de intrinsieke eigenschappen van die stoffen te verkrijgen.

(2)

In bijlage V van Richtlijn 67/548/EEG van de Raad van 27 juni 1967 betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffen (2) zijn methoden vastgesteld voor de bepaling van de fysisch-chemische eigenschappen, de toxiciteit en de ecotoxiciteit van stoffen en preparaten. Bijlage V van Richtlijn 67/548/EEG is bij Richtlijn 2006/121/EG van het Europees Parlement en de Raad met ingang van 1 juni 2008 geschrapt.

(3)

De in bijlage V van Richtlijn 67/548/EEG vervatte testmethoden dienen in deze verordening te worden geïntegreerd.

(4)

Deze verordening sluit het gebruik van andere testmethoden niet uit, op voorwaarde dat het gebruik daarvan in overeenstemming is met artikel 13, lid 3, van Verordening (EG) nr. 1907/2006.

(5)

Bij de opzet van de testmethoden dient terdege rekening te worden gehouden met de beginselen van vervanging, vermindering en verfijning van het gebruik van dieren in procedures, met name wanneer passende gevalideerde methoden ter vervanging, vermindering of verfijning van dierproeven beschikbaar worden.

(6)

De bepalingen van deze verordening zijn in overeenstemming met het advies van het bij artikel 133 van Verordening (EG) nr. 1907/2006 ingestelde comité,

HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:



Artikel 1

De in het kader van Verordening (EG) nr. 1907/2006 toe te passen testmethoden zijn opgenomen in de bijlage van deze verordening.

Artikel 2

De Commissie herbeziet indien nodig de in deze verordening vervatte testmethoden met het oog op de vervanging, de vermindering of de verfijning van proeven op gewervelde dieren.

Artikel 3

Alle verwijzingen naar bijlage V van Richtlijn 67/548/EEG worden gelezen als verwijzingen naar deze verordening.

Artikel 4

Deze verordening treedt in werking op de dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publicatieblad van de Europese Unie.

Zij is van toepassing met ingang van 1 juni 2008.




BIJLAGE




DEEL A: METHODEN VOOR DE BEPALING VAN DE FYSISCH-CHEMISCHE EIGENSCHAPPEN

INHOUD

A.1.

SMELT-/VRIESTEMPERATUUR

A.2.

KOOKTEMPERATUUR

A.3.

RELATIEVE DICHTHEID

A.4.

DAMPSPANNING

A.5.

OPPERVLAKTESPANNING

A.6.

OPLOSBAARHEID IN WATER

A.8.

VERDELINGSCOËFFICIËNT

A.9.

VLAMPUNT

A.10.

ONTVLAMBAARHEID (VASTE STOFFEN)

A.11.

ONTVLAMBAARHEID (GASSEN)

A.12.

ONTVLAMBAARHEID (CONTACT MET WATER)

A.13.

PYROFORE EIGENSCHAPPEN VAN VASTE STOFFEN EN VLOEISTOFFEN

A.14.

EXPLOSIEGEVAAR

A.15.

ZELFONTBRANDINGSTEMPERATUUR (VLOEISTOFFEN EN GASSEN)

A.16.

RELATIEVE ZELFONTBRANDINGSTEMPERATUUR VAN VASTE STOFFEN

A.17.

OXIDERENDE EIGENSCHAPPEN (VASTE STOFFEN)

A.18.

AANTALGEMIDDELD MOLECUULGEWICHT EN MOLECUULGEWICHTSVERDELING VAN POLYMEREN

A.19.

GEHALTE VAN POLYMEREN AAN LAAGMOLECULAIRE BESTANDDELEN

A.20.

OPLOS/EXTRACTIEGEDRAG VAN POLYMEREN IN WATER

A.21.

OXIDERENDE EIGENSCHAPPEN (VLOEISTOFFEN)

A.22.

NAAR LENGTE GEWOGEN MEETKUNDIG GEMIDDELDE VAN DE DIAMETER VAN VEZELS

A.1. SMELT-/VRIESTEMPERATUUR

1. METHODE

De meeste van de beschreven methoden berusten op de testrichtlijnen van de OESO (1). De fundamentele principes worden besproken in de referenties (2) en (3).

1.1. INLEIDING

De hier beschreven methoden en toestellen dienen te worden toegepast voor de bepaling van de smelttemperatuur van stoffen, ongeacht de mate van zuiverheid ervan.

De keuze van de methode hangt af van de aard van de te onderzoeken stof. De beperkende factor zal dan ook worden bepaald door de vraag of de stof al dan niet gemakkelijk, moeilijk of helemaal niet kan worden verpulverd.

Voor sommige stoffen is de bepaling van de vries- of stoltemperatuur zinvoller; ook de normen voor deze bepaling werden in de methode opgenomen.

Indien, als gevolg van de specifieke eigenschappen van de stof, geen van de bovenstaande parameters eenvoudig kan worden gemeten, kan een vloeipunt geschikt zijn.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN

Onder smelttemperatuur wordt verstaan de temperatuur, waarbij de faseovergang van vaste naar vloeibare toestand optreedt bij normale atmosferische druk; deze temperatuur komt in het ideale geval overeen met de vriestemperatuur.

Aangezien de faseovergang bij veel stoffen over een temperatuurbereik plaatsvindt, wordt deze vaak omschreven als het smelttraject.

Smelttemperatuur en -traject worden steeds uitgedrukt in K.

t = T - 273,15

t

:

Celsius-temperatuur, graden Celsius ( oC)

T

:

thermodynamische temperatuur, Kelvin (K)

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om van tijd tot tijd de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methoden mogelijk te maken.

In de referenties worden enige ijkstoffen genoemd (4).

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEN

De temperatuur (het temperatuurbereik), waarbij fase-overgang van vaste naar vloeibare of van vloeibare naar vaste toestand plaatsvindt, wordt bepaald. In de praktijk betekent dit dat een monster van de te onderzoeken stof bij atmosferische druk wordt verwarmd/gekoeld en dat de temperatuur in het begin- en het eindstadium van het smelt-/vriesproces wordt bepaald. Vijf onderzoekmethoden worden beschreven, namelijk: de capillaire methode, de methode met de verhitte plaat, de methode voor bepaling van de vriestemperatuur, thermische-analysemethoden, alsmede de bepaling van het vloeipunt (zoals ontwikkeld voor minerale oliën).

In sommige gevallen kan het gemakkelijker zijn de vriestemperatuur te bepalen in plaats van de smelttemperatuur.

1.4.1. Capillaire methode

1.4.1.1. Toestellen ter bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een vloeistofbad

Een kleine hoeveelheid van de verpulverde stof wordt in een capillair gebracht en stevig aangedrukt. Het buisje wordt samen met een thermometer verwarmd, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de temperatuurstijging tijdens het eigenlijke smeltproces minder dan circa 1 K/min bedraagt. De temperatuur in het begin- en eindstadium van het smeltproces wordt bepaald.

1.4.1.2. Toestellen ter bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een metalen blok

Als omschreven in 1.4.1.1, met dit verschil dat het capillair en de thermometer in een verwarmd metalen blok zijn aangebracht en door openingen in het blok kunnen worden waargenomen.

1.4.1.3. Fotoceldetectie

Het monster in het capillair wordt automatisch verhit in een metalen cilinder. Een lichtbundel wordt, via openingen in de cilinder, door de stof heen op een nauwkeurig geijkte fotocel gericht. De optische eigenschappen van de meeste stoffen veranderen van ondoorschijnend naar doorschijnend bij het smelten. Zodra de lichtintensiteit die de fotocel bereikt toeneemt, zendt deze een stopsignaal naar de digitale meter die de temperatuur afleest van een thermometer met platinaweerstand in de verwarmingskamer. Deze methode leent zich niet voor toepassing op sommige sterk gekleurde stoffen.

1.4.2. Methode waarbij gebruik wordt gemaakt van een verhit oppervlak (hot stage)

1.4.2.1. De verhitte staaf volgens Kofler

De verhitte staaf volgens Kofler bestaat uit twee stukken metaal die een verschillend warmtegeleidingsvermogen bezitten en elektrisch worden verwarmd. De staaf is zo ontworpen dat de temperatuur nagenoeg lineair langs de lengte ervan varieert. De temperatuur van de verhitte staaf kan variëren van 283 K tot 573 K; de temperatuur wordt met een voor elke staaf afzonderlijk geijkt ruitertje (met wijzer) afgelezen. Om een smelttemperatuur te bepalen, wordt de stof in een dunne laag direct op het oppervlak van de verhitte staaf gebracht. Binnen enkele seconden ontstaat er een scherpe scheidingslijn tussen de vloeibare en de vaste fase. De wijzer wordt ingesteld op de scheidingslijn, waarna de temperatuur kan worden afgelezen.

1.4.2.2. Smeltpuntmicroscoop

Er bestaan verschillende verhitte platen voor microscopische smelttemperatuurbepaling waarbij met zeer kleine hoeveelheden materiaal kan worden gewerkt. Bij de meeste verhitte platen wordt de temperatuur gemeten met een gevoelig thermokoppel, maar bij sommige met een kwikthermometer. Een toestel voor microscopische bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een verhitte plaat bestaat meestal uit een verwarmingskamer met een metalen plaat waarop het monster op een voorwerpglaasje wordt geplaatst, in het midden van de metalen plaat is een opening aangebracht zodat deze het licht van de microscoop doorlaat. Tijdens het gebruik wordt, om lucht uit de verwarmingskamer te weren, deze met een glazen plaat afgesloten.

De verwarming van het monster wordt ingesteld met een regelweerstand. Voor zeer nauwkeurige metingen bij optisch anisotrope stoffen kan gebruik worden gemaakt van gepolariseerd licht.

1.4.2.3. De meniscusmethode

Deze methode wordt speciaal toegepast voor polyamiden.

Bepaling van de temperatuur, waarbij de verplaatsing van een meniscus van siliconenolie die tussen een verhit oppervlak (hot stage) en een dekglas, geplaatst op het te onderzoeken polyamidemonster, is ingesloten, visueel wordt waargenomen.

1.4.3. Methode voor de bepaling van de vriestemperatuur

Het monster wordt in een speciaal proefbuisje in een toestel geplaatst voor de bepaling van de vriestemperatuur. Tijdens de afkoeling wordt het monster voortdurend zachtjes geroerd en de temperatuur wordt regelmatig afgelezen en geregistreerd. Zodra de temperatuur gedurende enkele aflezingen constant blijft, wordt deze temperatuur (na correctie voor afwijking van de thermometer) geregistreerd als de vriestemperatuur.

Onderkoeling moet worden voorkomen door een evenwicht te bewaren tussen de vaste en de vloeibare fase.

1.4.4. Thermische analyse

1.4.4.1. Differentiële thermische analyse (DTA)

Met deze techniek wordt het verschil in temperatuur geregistreerd tussen de te onderzoeken stof en een referentiestof als functie van de temperatuur, wanneer beide stoffen aan hetzelfde gecontroleerde temperatuurprogramma worden blootgesteld. Als het monster een faseovergang doormaakt met verandering van enthalpie, zal deze verandering aangetoond worden door een endotherme (smelten) of exotherme (bevriezen) afwijking van de basislijn van de temperatuurregistratie.

1.4.4.2. Differentiële scanningcalorimetrie (DSC)

Deze techniek registreert het verschil tussen de energieopname van de te onderzoeken stof en een referentiestof als functie van de temperatuur, wanneer beide stoffen aan hetzelfde gecontroleerde temperatuurprogramma worden onderworpen. Deze energie is de energie die nodig is om dezelfde temperatuur voor beide stoffen te bereiken. Als het monster een faseovergang doormaakt met verandering van enthalpie, zal deze verandering aangetoond worden door een endotherme (smelten) of exotherme (bevriezen) afwijking van de basislijn van de warmtestroomregistratie.

1.4.5. Vloeipunt

Deze methode werd ontwikkeld voor minerale oliën en is bruikbaar voor olieachtige stoffen met lage smelttemperaturen.

Na voorafgaande verwarming wordt het monster afgekoeld met een specifieke snelheid en telkens, iedere 3 K, onderzocht op vloeikarakteristieken. De laagste temperatuur waarbij nog beweging van de vloeistof wordt gezien, wordt genoteerd als het vloeipunt.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

De toepasbaarheid en nauwkeurigheid van de verschillende methoden voor de bepaling van smelttemperaturen/smelttrajecten staat vermeld in de tabel.

TABEL: TOEPASBAARHEID VAN DE METHODEN



A. Capillaire methode

Meetmethode

Stoffen die kunnen verpulveren

Stoffen die niet vlot verpulveren

Temperatuurbereik

Geschatte nauwkeurigheid (1)

Bestaande norm

Smelttemperatuurtoestellen met vloeistofbad

Ja

Enkele

273 tot 573 K

± 0,3 K

JIS K 0064

Smelttemperatuurtoestellen met metalen blok

Ja

Enkele

293 tot > 573 K

± 0,5 K

ISO 1218 (E)

Fotoceldetectie

Ja

Verscheidene met toepassing van hulpapparatuur

253 tot 573 K

± 0,5 K

(1)Afhankelijk van het type instrument en de graad van zuiverheid van de stof.



B. Methode waarbij gebruik wordt gemaakt van een verhit oppervlak (hot stage) en methode voor de bepaling van de vriestemperatuur

Meetmethode

Stoffen die kunnen verpulveren

Stoffen die niet vlot verpulveren

Temperatuurbereik

Geschatte nauwkeurigheid (1)

Bestaande norm

Verhitte staaf volgens Kofler

Ja

Neen

283 tot > 573 K

± 1,0 K

ANSI/ASTM D 345176

Smeltpuntmicroscoop

Ja

Enkele

273 tot > 573 K

± 0,5 K

DIN 53736

Meniscusmethode

Neen

Specifiek voor polyamiden

293 tot > 573 K

± 0,5 K

ISO 1218 (E)

Vriestemperatuurmethode

Ja

Ja

223 tot 573 K

± 0,5 K

zoals BS 4695

(1)Afhankelijk van het type instrument en de graad van zuiverheid van de stof.



C. Thermische analyse

Meetmethode

Stoffen die kunnen verpulveren

Stoffen die niet vlot verpulveren

Temperatuurbereik

Geschatte nauwkeurigheid (1)

Bestaande norm

Differentiële thermische analyse

Ja

Ja

173 tot 1 273 K

tot 600 K ± 0,5 K tot 1 273 K ± 2,0 K

ASTM E 537-76

Differentiële scanningcalorimetrie

Ja

Ja

173 tot 1 273 K

tot 600 K ± 0,5 K tot 1 273 K ± 2,0 K

ASTM E 537-76

(1)Afhankelijk van het type instrument en de graad van zuiverheid van de stof.



D. Vloeipunt

Meetmethode

Stoffen die kunnen verpulveren

Stoffen die niet vlot verpulveren

Temperatuurbereik

Geschatte nauwkeurigheid (1)

Bestaande norm

Vloeipunt

Voor minerale oliën en olieachtige stoffen

Voor minerale oliën en olieachtige stoffen

223 tot 323 K.

± 3,0 K

ASTM D 97-66

(1)Afhankelijk van het type instrument en de graad van zuiverheid van de stof.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN

De aan te houden werkwijzen van bijna alle testmethoden staan beschreven in internationale en nationale normen (zie aanhangsel 1).

1.6.1. Methoden waarbij gebruik wordt gemaakt van een capillair

Bij een trage temperatuurstijging zullen verpulverde stoffen doorgaans volgens de in figuur 1 weergegeven stadia verlopen.

image

Tijdens de smelttemperatuurbepaling wordt de temperatuur in het begin- en eindstadium van het smeltproces geregistreerd.

1.6.1.1. Toestellen ter bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een vloeistofbad

In figuur 2 is een genormaliseerd glazen apparaat voor smelttemperatuurbepaling (JIS K 0064) afgebeeld. Alle specificaties zijn opgegeven in mm.

image

Er moet een geschikte badvloeistof bepaald worden. De keuze van de vloeistof is afhankelijk van de smelttemperatuur van de te onderzoeken stof, bijvoorbeeld vloeibare paraffine voor stoffen met een smelttemperatuur van maximaal 473 K, siliconenolie voor stoffen met een smelttemperatuur van maximaal 573 K.

Voor stoffen met een smelttemperatuur hoger dan 523 K kan een mengsel, bestaande uit drie delen zwavelzuur en twee delen kaliumsulfaat (naar massa), worden gebruikt. Passende voorzorgsmaatregelen dienen te worden genomen wanneer een dergelijk mengsel wordt gebruikt.

Er mag alleen gebruik worden gemaakt van thermometers die aan de eisen in de volgende of daarmee overeenkomende normen voldoen:

ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

De droge stof wordt verpulverd in een mortier en in een aan één uiteinde dichtgesmolten capillair gebracht en wel zo dat het niveau van de vulling, nadat de stof stevig is aangedrukt, circa 3 mm bedraagt. Teneinde een gelijkvormig aangedrukt monster te verkrijgen, laat men het capillair vanaf een hoogte van circa 700 mm door een glazen buis verticaal op een horlogeglas vallen.

Het gevulde capillaire buisje wordt in een bad geplaatst en wel zo dat het midden van de kwikbol van de thermometer het capillair ter hoogte van het monster aanraakt. Doorgaans wordt het capillair in het toestel gebracht bij ongeveer 10 K beneden de smelttemperatuur.

De badvloeistof wordt zodanig verwarmd dat de temperatuurstijging circa 3 K/min bedraagt. De vloeistof moet worden geroerd. Bij ongeveer 10 K beneden de verwachte smelttemperatuur wordt de snelheid van de temperatuurstijging ingesteld op ten hoogste 1 K/min.

De smelttemperatuur wordt als volgt berekend:

T = TD + 0,00016 (TD - TE) n

waarin:

T

=

de gecorrigeerde smelttemperatuur, uitgedrukt in K

TD

=

de van thermometer D afgelezen temperatuur, in K

TE

=

de van thermometer E afgelezen temperatuur, in K

n

=

het aantal schaalverdelingen van het kwikdraad op het uitstekende gedeelte van thermometer D.

1.6.1.2. Toestellen ter bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een metalen blok

De apparatuur bestaat uit:

—een cilindervormig metalen blok, waarvan het bovenste gedeelte hol is en een kamer vormt (zie figuur 3);

—een metalen stop met twee of meer openingen waarlangs buisjes in het metalen blok kunnen worden gebracht;

—een verwarmingssysteem voor het metalen blok, bijvoorbeeld een in het blok ingesloten elektrische weerstand;

—een regelbare weerstand voor de stroomtoevoer, indien van elektrische verwarming gebruik wordt gemaakt;

—in de zijwanden van de kamer, in rechte hoeken ten opzichte van elkaar, vier vensters van hittebestendig glas; voor één van deze vensters is een oculair aangebracht, waardoor het capillair kan worden waargenomen, de overige drie vensters worden gebruikt voor de verlichting van de kamer en inhoud daarvan;

—een aan één uiteinde gesloten capillair van hittebestendig glas (zie 1.6.1.1).

Zie de in 1.6.1.1 genoemde normen. Thermo-elektrische meetinstrumenten van vergelijkbare nauwkeurigheid kunnen ook worden gebruikt.

image

1.6.1.3. Fotoceldetectie

Apparatuur en werkwijze:

Het apparaat bestaat uit een metalen kamer met een geautomatiseerd verwarmingssysteem. Drie capillairen worden overeenkomstig 1.6.1.1 gevuld en in de oven geplaatst.

Er zijn verscheidene lineaire temperatuurstijgingen beschikbaar voor het ijken van het apparaat; de gewenste temperatuurstijging wordt elektrisch ingesteld met een van tevoren gekozen constante snelheid en heeft een lineair verloop. Recorders geven de werkelijke oventemperatuur en de temperatuur van de stof in het capillair aan.

1.6.2. Verwarmde oppervlakken (hot stages)

1.6.2.1. De verhitte staaf volgens Kofier

Zie aanhangsel.

1.6.2.2. Smeltpuntmicroscoop

Zie aanhangsel.

1.6.2.3. Meniscusmethode (polyamiden)

Zie aanhangsel.

De opwarmsnelheid bij temperaturen in de buurt van de smelttemperatuur moet minder zijn dan 1 K/min.

1.6.3. Methoden voor de vriestemperatuurbepaling

Zie aanhangsel.

1.6.4. Thermische analyse

1.6.4.1. Differentiële thermische analyse

Zie aanhangsel.

1.6.4.2. Differentiële scanningcalorimetrie

Zie aanhangsel.

1.6.5. Bepaling van het vloeipunt

Zie aanhangsel.

2. GEGEVENS

Soms is een thermometercorrectie noodzakelijk.

3. RAPPORTAGE

In het eindverslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—de gebruikte methode;

—de nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen) en, indien van toepassing, voorafgaande zuivering;

—een schatting van de nauwkeurigheid.

Het gemiddelde van ten minste twee metingen die binnen de geschatte nauwkeurigheidsgrenzen (zie tabellen) vallen, wordt gerapporteerd als smelttemperatuur,

Als het temperatuurverschil tussen het beginpunt en het eindpunt van het smelten binnen de nauwkeurigheidsgrenzen van de methode valt, wordt de temperatuur van het eindstadium genomen als de smelttemperatuur; zo niet, dan moeten beide temperaturen worden gerapporteerd.

Als ontleding of sublimatie van de onderzochte stof optreedt voordat de smelttemperatuur is bereikt, dient de temperatuur waarbij dit effect optreedt, te worden gerapporteerd.

Alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof, dienen te worden gerapporteerd.

4. LITERATUUR

(1)OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102 — Decision of the Council C(81) 30 Final.

(2)IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803-834.

(3)R. Weissberger ed.: Technique of organic chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter VII.

(4)IUPAC, Physicochemical Measurements: Catalogue of Reference Materials from National Laboratories, Pure and Applied Chemistry, 1976, Vol. 48, 505-515.

Aanhangsel

Voor aanvullende technische gegevens kunnen de volgende normen als voorbeeld worden geraadpleegd.

1. Capillaire methoden

1.1. Smelttemperatuurtoestellen met een vloeistofbad



ASTM E 324-69

Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals

BS 4634

Method for the determination of melting point and/or melting range

DIN 53181

Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren

JIS K 00-64

Testing methods for melting point of chemical products

1.2. Smelttemperatuurtoestellen met een metalen blok



DIN 53736

Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen

ISO 1218 (E)

Plastics — polyamides — determination of „melting point”

2. Hete oppervlakken

2.1. Verwarmde staaf volgens Kofler



ANSI/ASTM D 3451-76

Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings

2.2. Smeltpuntmicroscoop



DIN 53736

Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen

2.3. Meniscusmethode (polyamiden)



ISO 1218 (E)

Plastics — polyamides — determination of „melting point”

ANSI/ASTM D 2133-66

Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials

NF T 51-050

Résines de polyamides. Determination du „point de fusion”. Méthode du ménisque.

3. Methoden voor vriestemperatuurbepaling



BS 4633

Method for the determination of crystallizing point

BS 4695

Method for determination of melting point of petroleum wax (cooling curve)

DIN 51421

Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen

ISO 2207

Cires de pétrole: détermination de la température de figeage

DIN 53175

Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren

NF T 60-114

Point de fusion des paraffines

NF T 20-051

Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation)

ISO 1392

Method for the determination of the freezing point

4. Thermische analyse

4.1. Differentiële thermische analyse



ASTM E 537-76

Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

ASTM E 473-85

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

ASTM E 472-86

Standard practice for reporting thermoanalytical data

DIN 51005

Thermische Analyse, Begriffe

4.2. Differentiële scanningcalorimetrie



ASTM E 537-76

Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

ASTM E 473-85

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

ASTM E 472-86

Standard practice for reporting thermoanalytical data

DIN 51005

Thermische Analyse, Begriffe

5. Bepaling van het vloeipunt



NBN 52014

Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite — Monsterneming en ontleding van aardolieprodukten: Troebelingspunt en vloeipunt

ASTM D 97-66

Standard test method for pour point of petroleum oils

ISO 3016

Petroleum oils — Determination of pour point

A.2. KOOKTEMPERATUUR

1. METHODE

De meeste van de beschreven methoden berusten op de testrichtlijn van de OESO (1). De fundamentele principes worden besproken in de referenties (2) en (3).

1.1. INLEIDING

De hier beschreven methoden en toestellen kunnen worden toegepast op vloeistoffen en op bij lage temperatuur smeltende stoffen, welke beneden de kooktemperatuur geen chemische reactie ondergaan (bijvoorbeeld: auto-oxidatie, omlegging, ontleding, enz.). De methoden zijn van toepassing op zuivere en onzuivere vloeistoffen.

De meeste aandacht wordt gegeven aan de fotoceldetectiemethode en thermische analysemethode, omdat hiermee zowel smelt- als kooktemperaturen kunnen worden bepaald. Bovendien kunnen deze metingen worden geautomatiseerd.

Het voordeel van de dynamische methode is, dat deze ook kan worden toegepast voor de bepaling van de dampspanning en dat het niet nodig is de kooktemperatuur te corrigeren tot normale druk (101,325 kPa) omdat de normale druk tijdens de meting kan worden ingesteld met behulp van een manostaat.

Opmerkingen:

De invloed van verontreinigingen op de bepaling van de kooktemperatuur is sterk afhankelijk van de aard van de verontreiniging. Indien in het monster vluchtige verontreinigingen aanwezig zijn, die de resultaten zouden kunnen beïnvloeden, kan de stof worden gezuiverd.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN

De normale kooktemperatuur wordt gedefinieerd als de temperatuur waarbij de dampdruk van een vloeistof gelijk is aan 101,325 kPa.

Als de kooktemperatuur niet wordt gemeten bij normale atmosferische druk, kan de temperatuurafhankelijkheid van de dampdruk worden beschreven met de vergelijking van Clausius-Clapeyron:

image

p

=

de dampspanning van de stof in pascal (Pa)

ΔHv

=

de verdampingswarmte in J mol-1

R

=

de universele molaire gasconstante = 8,314 J mol-1 K-1

T

=

de thermodynamische temperatuur in K.

Bij vermelding van de kooktemperatuur moet de druk tijdens de meting worden opgegeven.

Herleidingen

Druk (eenheid: kPa)

100 kPa

=

1 bar = 0,1 MPa

(„bar” is nog toegestaan, doch het gebruik hiervan wordt niet aanbevolen).

133 Pa

=

1 mm Hg = 1 Torr

(de eenheden mm Hg en Torr zijn niet meer toegestaan).

1 atm

=

standaardatmosfeer = 101 325 Pa

(de eenheid „atm” is niet toegestaan).

Temperatuur (eenheid: K)

t = T - 273,15

t

:

Celsiustemperatuur, graden Celsius (oC)

T

:

thermodynamische temperatuur, kelvin (K)

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Referentiestoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren en om vergelijking met de resultaten van andere methoden mogelijk te maken.

Een aantal ijkstoffen is te vinden in de methoden die zijn opgenomen in het aanhangsel.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEN

Vijf methoden voor de bepaling van de kooktemperatuur (of kooktraject) berusten op de meting van de kooktemperatuur, twee andere op thermische analyse.

1.4.1. Bepaling met behulp van een ebullioscoop

De ebullioscoop is oorspronkelijk ontwikkeld voor de bepaling van het molecuulgewicht via de kooktemperatuurverhoging, doch leent zich ook voor nauwkeurige metingen van de kooktemperatuur. Een zeer eenvoudig toestel is beschreven in ASTM D 1120-72 (zie aanhangsel). De vloeistof wordt in dit toestel onder evenwichtscondities bij atmosferische druk verwarmd totdat zij kookt.

1.4.2. Dynamische methode

Bij deze methode meet men de condensatietemperatuur van de damp met behulp van een geschikte thermometer in de reflux tijdens het koken. De druk kan bij deze methode worden gevarieerd.

1.4.3. Destillatiemethode voor kooktemperatuur

Bij deze methode destilleert men de vloeistof en meet men de condensatietemperatuur van de damp, alsmede de hoeveelheid destillaat.

1.4.4. Methode volgens Siwoloboff

Bij deze methode verwarmt men het monster in een monsterbuisje, dat in een verwarmd vloeistofbad wordt gehouden. Een dichtgesmolten capillair met een luchtbel onderin wordt in het monsterbuisje gebracht.

1.4.5. Fotoceldetectie

Naar het beginsel volgens Siwoloboff worden de opstijgende bellen automatisch gemeten met een fotocel.

1.4.6. Differentiële thermische analyse

Met deze techniek wordt het verschil in temperatuur geregistreerd tussen de te onderzoeken stof en een referentiestof als functie van de temperatuur, wanneer beide stoffen aan hetzelfde gecontroleerde temperatuurprogramma worden blootgesteld. Als het monster een faseovergang doormaakt met verandering van enthalpie, zal deze verandering aangetoond worden door een endotherme afwijking (koken) van de basislijn van de temperatuurregistratie.

1.4.7. Differentiële scanningcalorimetrie

Deze techniek registreert het verschil tussen de energieopname van de te onderzoeken stof en een referentiestof als functie van de temperatuur, wanneer beide stoffen aan hetzelfde gecontroleerde temperatuurprogramma worden onderworpen. Deze energie is de energie die nodig is om dezelfde temperatuur voor beide stoffen te bereiken. Als het monster een faseovergang doormaakt met verandering van enthalpie zal deze verandering aangetoond worden door een endotherme afwijking (koken) van de basislijn van de warmtestroomregistratie.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

De toepasbaarheid en nauwkeurigheid van de verschillende methoden voor de bepaling van de kooktemperatuur/kooktraject staan vermeld in tabel 1.



Tabel 1

Vergelijking van de methoden

Meetmethode

Geschatte nauwkeurigheid

Bestaande norm

Ebullioscoop

± 1,4 K (tot 373 K) (1)(2)

± 2,5 K (tot 600 K) (1)(2)

ASTM D 1120-72 (1)

Dynamische methode

± 0,5 K (tot 600 K) (2)

Destillatiemethode (kooktraject)

± 0,5 K (tot 600 K)

ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71

Volgens Siwoloboff

± 2 K (tot 600 K) (2)

Fotoceldetectie

± 0,3 K (bij 373 K) (2)

Differentiële thermische analyse

± 0,5 K (tot 600 K)

± 2,0 K (tot 1 273 K)

ASTM E 537-76

Differentiële scanningcalorimetrie

± 0,5 K (tot 600 K)

± 2,0 K (tot 1 273 K)

ASTM E 537-76

(1)Deze nauwkeurigheid geldt alleen voor eenvoudige toestellen zoals bijvoorbeeld beschreven in ASTM D 1120-72; de nauwkeurigheid kan worden verbeterd met meer verfijnde versies van de ebullioscoop.

(2)Deze nauwkeurigheid geldt alleen voor zuivere stoffen. Het gebruik in andere omstandigheden moet verantwoord worden.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE METHODEN

De werkwijzen van een aantal testmethoden zijn beschreven in internationale en nationale normen (zie aanhangsel).

1.6.1. Ebullioscoop

Zie aanhangsel.

1.6.2. Dynamische methode

Zie testmethode A.4 voor de bepaling van de dampspanning.

De waargenomen kooktemperatuur bij een druk van 101,325 kPa wordt geregistreerd.

1.6.3. Destillatiemethode (kooktraject)

Zie aanhangsel.

1.6.4. Methode volgens Siwoloboff

Het monster wordt verwarmd in een smelttemperatuurtoestel in een monsterbuisje met een diameter van ongeveer 5 mm (figuur 1).

In figuur 1 staat een standaardapparaat voor de bepaling van de smelt- en kooktemperatuur (JIS K 0064) afgebeeld (glas, alle afmetingen in mm).

image

Een capillair (kookcapillair) dat op ongeveer 1 cm boven het ondereind is dichtgesmolten, wordt in het monsterbuisje gebracht. Het monsterbuisje wordt met de te onderzoeken stof gevuld, totdat het dichtgesmolten deel van het capillair zich onder het vloeistofoppervlak bevindt. Het monsterbuisje met het kookcapillair wordt met een elastiekje aan de thermometer bevestigd of met een zijstuk vastgezet (zie figuur 2).



Figuur 2

Beginsel volgens Siwoloboff

Figuur 3

Gewijzigd beginsel

image

image

De badvloeistof wordt gekozen aan de hand van de kooktemperatuur. Bij temperaturen tot 573 K kan siliconenolie worden gebruikt. Vloeibare paraffine mag slechts worden gebruikt bij temperaturen tot 473 K. De verwarming van het vloeistofbad moet zo geregeld zijn, dat de temperatuur aanvankelijk 3 K/min stijgt. Het vloeistofbad moet worden geroerd. Bij ongeveer 10 K beneden de verwachte kooktemperatuur moet de verwarming zo worden ingesteld dat de temperatuur met minder dan 1 K/min stijgt. Zodra de kooktemperatuur wordt bereikt, beginnen er snel belletjes uit het kookcapillair te komen.

De kooktemperatuur wordt bereikt wanneer, bij tijdelijke afkoeling, de bellenvorming stopt en de vloeistof plotseling in het capillair omhoog komt. De bijbehorende stand van de thermometer is de kooktemperatuur van de te onderzoeken stof.

Bij het gewijzigd beginsel (figuur 3) wordt de kooktemperatuur bepaald in een smelttemperatuurcapillair. Deze wordt uitgetrokken tot een fijne punt van ongeveer 2 cm lengte, waarin een geringe hoeveelheid van het monster wordt opgezogen. Het open einde van de fijne punt wordt dicht gesmolten, zodat er zich onderin een kleine luchtbel bevindt (a). Bij verwarming in het smelttemperatuur toestel (b) zet de luchtbel uit. De kooktemperatuur komt overeen met de temperatuur waarbij de prop van de te onderzoeken stof op het niveau van het vloeistofoppervlak komt (c).

1.6.5. Fotoceldetectie

Het monster wordt verwarmd in een capillair in een verwarmd metaalblok.

Via geschikte openingen in het blok wordt een lichtbundel door de stof heen op een zorgvuldig geijkte fotocel gericht.

Terwijl de temperatuur van het monster oploopt, komen er luchtbellen uit het kookcapillair. Wanneer de kooktemperatuur wordt bereikt, neemt het aantal bellen flink toe. Hierbij verandert de intensiteit van het licht dat op de cel valt, waardoor het apparaat wordt stilgezet dat de temperatuur afleest van een thermometer met platina weerstand die in het blok is gemonteerd.

Deze methode is bijzonder nuttig omdat hiermee ook bepalingen mogelijk zijn beneden kamertemperatuur tot 253,15 K (– 20 oC) zonder enige veranderingen in de apparatuur. Het instrument moet alleen in een koelbad worden geplaatst.

1.6.6. Thermische analyse

1.6.6.1. Differentiële thermische analyse

Zie aanhangsel.

1.6.6.2. Differentiële scanningcalorimetrie

Zie aanhangsel.

2. GEGEVENS

Bij kleine afwijkingen van de normale druk (max. ± 5 kPa) worden de kooktemperaturen genormaliseerd tot Tn met behulp van de volgende numerieke vergelijking van Sidney Young:

Tn = T + (fT x Δ p)

waarin:

Δ p

=

(101,325 - p), [let op het teken]

p

=

barometerstand in kPa,

fT

=

tempo waarin de kooktemperatuur verandert met de druk in K/kPa,

T

=

gemeten kooktemperatuur in K,

Tn

=

kooktemperatuur gecorrigeerd tot normale druk in K.

De temperatuurcorrectiefactoren fT en de vergelijkingen voor de benadering daarvan zijn opgenomen in de internationale en nationale normen die hierboven voor een groot aantal stoffen zijn genoemd.

Zo worden bijvoorbeeld in de methode DIN 53171 de volgende (bij benadering) correcties vermeld voor oplosmiddelen in verf (zie tabel 2).



Tabel 2:

Temperatuurcorrectiefactoren fT

Temperatuur T (K)

Correctiefactor fT (K/kPa)

323,15

0,26

348,15

0,28

373,15

0,31

398,15

0,33

423,15

0,35

448,15

0,37

473,15

0,39

498,15

0,41

523,15

0,44

548,15

0,45

573,15

0,47

3. RAPPORTAGE

In het eindverslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—de gebruikte methode;

—een nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen) en, indien van toepassing, voorafgaande zuivering;

—een schatting van de nauwkeurigheid.

Het gemiddelde van ten minste twee metingen die binnen de geschatte nauwkeurigheidsgrenzen (zie tabel 1) vallen, wordt genoteerd als kooktemperatuur.

De gemeten kooktemperaturen en hun gemiddelde moeten worden opgegeven, alsmede de druk(ken), waarbij de metingen zijn uitgevoerd, in kPa. De druk dient bij voorkeur dicht bij de normale atmosferische druk te liggen.

Alle gegevens en opmerkingen, die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof, dienen te worden gerapporteerd.

4. LITERATUUR

(1)OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103 — Decision of the Council C(81)30 Final.

(2)IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Burterworths, London, 1975, vol. II.

(3)R. Weissberger ed.: Technique of organic chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol.I, Part I, Chapter VIII.

Aanhangsel

Voor aanvullende technische gegevens kunnen de volgende normen als voorbeeld worden geraadpleegd:

1. Ebullioscoop



ASTM D 1120-72

Standard Test Method for Boiling Point of Engine Anti-freezes

2. Destillatieprocess (kooktraject)



ISO/R 918

Test Method for Distillation (Disrillation Yield and Distillation Range)

BS 4349/68

Method for determination of distillation of petroleum products

BS 4591/71

Method for the determination of distillation characteristics

DIN 53171

Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes

NF T 20-608

Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation

3. Differentiële thermische analyse en differentiële scanningcalorimetrie



ASTM E 537-76

Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

ASTM E 473-85

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

ASTM E 472-86

Standard practice for reporting thermoanalytical data

DIN 51005

Thermische Analyse: Begriffe

A.3. RELATIEVE DICHTHEID

1. METHODE

De beschreven methoden berusten op de testrichtlijn van de OESO (1). De fundamentele principes worden besproken in referentie (2).

1.1. INLEIDING

De hieronder beschreven methoden voor het bepalen van de relatieve dichtheid zijn van toepassing op vaste stoffen en op vloeistoffen, ongeacht de zuiverheid van deze stoffen. De verschillende methoden zijn vermeld in tabel 1.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN

De relatieve dichtheid, D20/4, van vaste stoffen of vloeistoffen is de verhouding tussen de massa van een volume te onderzoeken stof bij 20 oC en de massa van hetzelfde volume water bij 4 oC. De relatieve dichtheid heeft geen dimensie.

De dichtheid, p, van een stof is het quotiënt van de massa m en het volume v van deze stof.

De dichtheid, p, wordt uitgedrukt in kg/m3 (SI-eenheden).

1.3. REFERENTIESTOFFEN (1) (3)

Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methodes mogelijk te maken.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEN

Er worden vier soorten methoden gebruikt.

1.4.1. Methoden gebaseerd op de opwaartse kracht

1.4.1.1. Areometer (hydrometer voor vloeistoffen)

Voldoende nauwkeurige en snelle dichtheidsbepalingen kunnen worden uitgevoerd met drijvende areometers; het gedeelte van de areometer dat in de vloeistof zakt, is bepalend voor de dichtheid van de vloeistof en kan van een schaalverdeling worden afgelezen.

1.4.1.2. Hydrostatische balans (voor vloeistoffen en vaste stoffen)

Het gewichtsverschil van een monster, gemeten in lucht en in een geschikte vloeistof (bijvoorbeeld water), kan worden gebruikt om de dichtheid ervan te bepalen.

Voor vaste stoffen geldt de gemeten dichtheid slechts voor het bewuste monster. Voor het bepalen van de dichtheid van vloeistoffen wordt een voorwerp met volume v eerst in lucht en vervolgens in de testvloeistof gewogen.

1.4.1.3. Methode met ondergedompeld voorwerp (voor vloeistoffen) (4)

Bij deze methode wordt de dichtheid van een vloeistof bepaald aan de hand van het verschil tussen de resultaten van een weging van de vloeistof voor en na het onderdompelen van een voorwerp met bekend volume in de te onderzoeken vloeistof.

1.4.2. Methoden met de pyknometer

Voor vaste stoffen en vloeistoffen kunnen pyknometers van uiteenlopende vorm en met bekend volume worden gebruikt. De dichtheid wordt berekend uit het verschil in gewicht tussen de volle en de lege pyknometer en het bekende volume daarvan.

1.4.3. Vergelijkingspyknometer met lucht (voor vaste stoffen)

De dichtheid van een vaste stof in willekeurige vorm kan bij kamertemperatuur worden gemeten met behulp van een gasvergelijkingspyknometer. Het volume van een stof wordt in lucht of in een inert gas gemeten in een cilinder waarvan het variabele volume gekalibreerd is. Voor de berekening van de dichtheid wordt na meting van het volume een massameting verricht.

1.4.4. Oscillerende dichtheidsmeter (5) (6) (7)

De dichtheid van een vloeistof kan worden gemeten met behulp van een oscillerende dichtheidsmeter. Een mechanische oscillator in de vorm van een U-buis wordt in trilling gebracht bij de resonantiefrequentie van de oscillator die afhankelijk is van zijn massa. Bij het inbrengen van een monster verandert de resonantiefrequentie van de oscillator. Het apparaat moet worden geijkt met twee vloeistoffen van bekende dichtheid. Deze ijkstoffen moeten bij voorkeur zo worden gekozen dat de dichtheden ervan zich aan de uiteinden van het meetbereik bevinden.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

De toepasbaarheid van de verschillende methoden voor bepaling van de relatieve dichtheid staat vermeld in de tabel.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN

Normen, die als voorbeeld kunnen worden geraadpleegd voor aanvullende technische gegevens, zijn bijgevoegd in het aanhangsel.

De proeven moeten worden uitgevoerd bij 20 oC en ten minste in tweevoud.

2. GEGEVENS

Zie normen.

3. RAPPORTAGE

In het eindverslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—de gebruikte methode;

—een nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen) en, indien van toepassing, voorafgaande zuivering.

De relatieve dichtheid

image

dient te worden gerapporteerd zoals gedefinieerd onder 1.2, alsmede de fysische toestand van de onderzochte stof.

Alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof, dienen te worden gerapporteerd.



Tabel

Toepasbaarheid van de methoden

Meetmethode

Dichtheid

Maximale dynamische viscositeit

Bestaande norm

Vaste stof

Vloeistof

1.4.1.1. Areometer

Ja

5 Pa s

ISO 387,

ISO 649-2,

NF T 20-050

1.4.1.2. Hydrostatische balans

a) vaste stof

Ja

ISO 1183 (A)

b) vloeistof

Ja

5 Pa S

ISO 901 en 758

1.4.1.3. Methode met ondergedompeld voorwerp

Ja

20 Pa s

DIN 53217

1.4.2. Pyknometer

ISO 3507

a) vaste stof

Ja

ISO 1183 (B),

NF T 20-053

b) vloeistof

Ja

500 Pa s

ISO 758

1.4.3. Vergelijkingspyknometer met lucht

Ja

DIN 55990 deel 3,

DIN 53243

1.4.4. Oscillerende dichtheidsmeter

Ja

5 Pa s

4. LITERATUUR

(1)OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2)R. Weissberger ed., Technique of organic chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I.

(3)IUPAC, Recommended reference materials for realisation of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508.

(4)Wagenbreth, H., Die Tauchkugei zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm; 1979, Vol. 11, 427-430.

(5)Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297-302.

(6)Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen — Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726.

(7)Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.

Aanhangsel

Voor aanvullende technische gegevens kunnen de volgende normen als voorbeeld worden geraadpleegd:

1. Methoden gebaseerd op de opwaartse kracht

1.1. Areometer



DIN 12790, ISO 387

Areometer; algemene aanwijzingen

DIN 12791

Deel I: Dichtheidsareometers: constructie, instelling en gebruik

Deel II: Dichtheidsareometers: genormaliseerde maten, benaming

Deel III: Gebruik en test

ISO 649-2

Laboratoriumglaswerk: Dichtheidsareometers voor algemeen gebruik

NF T 20-050

Chemische producten voor industrieel gebruik — Bepaling van dichtheid van vloeistoffen — Areometermethode

DIN 12793

Laboratoriumglaswerk: areometers voor bepaling van het meetbereik

1.2. Hydrostatische balans



ISO 1183

Methode A: Methoden voor het bepalen van de dichtheid en relatieve dichtheid van kunststoffen met uitzondering van schuimplastics

NF T 20-049

Chemische producten voor industrieel gebruik — Bepaling van dichtheid van vaste stoffen uitgezonderd poeders en schuimproducten — Hydrostatische balansmethode

ASTM D 792

Soortelijk gewicht en dichtheid van kunststoffen door verplaatsing

DIN 53479

Proeven voor kunststoffen en elastomeren: bepaling van de dichtheid



ISO 901

ISO 758

DIN 51757

Proeven voor minerale oliën en verwante materialen: bepaling van de dichtheid

ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 en ASTM D 1481-62

ASTM D 1298

Dichtheid, soortelijk gewicht of API-gewicht van ruwe aardolie en vloeibare aardolieproducten met de areometermethode

BS 4714

Dichtheid, soortelijk gewicht of API-gewicht van ruwe aardolie en vloeibare aardolieproducten met de areometermethode

1.3. Methode met ondergedompeld voorwerp



DIN 53217

Proeven voor verf, vernis en soortgelijke producten; dichtheidsbepaling met de methode met ondergedompeld voorwerp

2. Pyknometermethoden

2.1. Voor vloeistoffen



ISO 3507

Pyknometers

ISO 758

Vloeibare chemische producten; bepaling van de dichtheid bij 20 oC

DIN 12797

Gay-Lussac pyknometer (voor niet-vluchtige vloeistoffen die niet al te visceus zijn)

DIN 12798

Lipkin pyknometer (voor vloeistoffen met een kinematische viscositeit van minder dan 100.10-6 m2 s-1 bij 15 oC)

DIN 12800

Sprengel pyknometer (voor vloeistoffen zoals in DIN 12798)

DIN 12801

Reischauer pyknometer (voor vloeistoffen met een kinematische viscositeit van minder dan 100.10-6 m2 s -1 bij 20 oC, vooral ook toepasbaar op koolwaterstoffen en oplossingen in water, alsmede op vloeistoffen met een hogere dampdruk, ongeveer 1 bar bij 90 oC)

DIN 12806

Hubbard pyknometer (voor alle soorten visceuze vloeistoffen met een niet al te hoge dampdruk, in het bijzonder voor verven, vernissen en bitumen)

DIN 12807

Bingham pyknometer (voor vloeistoffen zoals in DIN 12801)

DIN 12808

Jaulmes pyknometer (in het bijzonder voor mengsels van ethanol en water)

DIN 12809

Pyknometer met ingeslepen thermometer en capillaire zijbuis (voor vloeistoffen die niet al te visceus zijn)

DIN 53217

Proeven voor verven, vernissen en soortgelijke producten; bepaling van de dichtheid met behulp van een pyknometer

DIN 51757

Punt 7: Proeven voor minerale oliën en verwante materialen; bepaling van de dichtheid

ASTM D 297

Hoofdstuk 15: Rubberproducten — chemische analyse

ASTM D 2111

Methode C: Organische halogeenverbindingen

BS 4699

Methode voor het bepalen van soortelijk gewicht en dichtheid van aardolieproducten (met behulp van een bicapillaire pyknometer met schaalverdeling)

BS 5903

Methode voor het bepalen van de relatieve dichtheid en dichtheid van aardolieproducten met behulp van een pyknometer met capillaire stop

NF T 20-053

Chemische producten voor industrieel gebruik — Bepaling van dichtheid van vaste stoffen in poeders en vloeistoffen — Pyknometermethode

2.2. Voor vaste stoffen



ISO 1183

Methode B: Methode voor het bepalen van de dichtheid en relatieve dichtheid van kunststoffen, met uitzondering van schuimplastics

NF T 20-053

Chemische producten voor industrieel gebruik — Bepaling van dichtheid van vaste stoffen in poeder en vloeistoffen — Pyknometermethode

DIN 19683

Bepaling van de bodemdichtheid

3. Vergelijkingspyknometer met lucht



DIN 55990

Deel 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ahnlichen Beschichrungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte

DIN 53243

Anstrichstoffe; chlorhaltige Polymere; Prüfung

▼M1

A.4. DAMPSPANNING

1. METHODE

Deze methode is gelijkwaardig aan OESO TG 104 (2004).

1.1. INLEIDING

Deze herziene versie van methode A.4 (1) bevat een aanvullende meetmethode, Effusiemethode: isotherme thermogravimetrie, ontwikkeld voor stoffen met zeer lage spanningen (tot 10–10 Pa). Gezien de behoefte aan meetmethoden, met name voor het bepalen van de dampspanning van stoffen met lage dampspanning, zijn de overige meetmethoden van deze methode herzien met betrekking tot andere toepassingsbereiken.

Bij thermodynamisch evenwicht is de dampspanning van een zuivere stof alleen een functie van de temperatuur. De fundamentele principes worden besproken in de referenties (2) en (3).

Er bestaat geen meetmethode die voor alle mogelijke waarden van de dampspanning, van minder dan 10–10 tot 105 Pa, van toepassing is. Deze methode omvat acht meetmethoden voor de dampspanning, die toepasbaar zijn voor verschillende dampspanningsbereiken. Tabel 1 biedt een vergelijking van de toepasbaarheid en het meetbereik van de verschillende methoden. De meetmethoden kunnen alleen worden toegepast voor verbindingen die niet ontleden onder de testomstandigheden. In gevallen waarin de experimentele methoden om technische redenen niet kunnen worden toegepast kan de dampspanning ook worden geschat. Een aanbevolen schattingsmethode wordt beschreven in het aanhangsel.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN

De dampspanning van een stof wordt gedefinieerd als de verzadigingsdruk boven een vaste stof of vloeistof.

Voor de druk dient de SI-eenheid, de pascal (Pa), te worden gebruikt. Andere eenheden die in het verleden zijn gebruikt worden hieronder weergegeven, samen met hun herleidingsfactoren:



1 Torr

=

1 mm Hg

=

1,333 × 102 Pa

1 atmosfeer

=

1,013 × 105 Pa

1 bar

=

105 Pa

De SI-eenheid van temperatuur is de kelvin (K). De formule voor het herleiden van graden Celsius naar Kelvin is:

T = t + 273,15

Hierin is T de Kelvintemperatuur ofwel de thermodynamische temperatuur en t de Celsiustemperatuur.



Tabel 1

Meetmethode

Vaste stoffen

Vloeistoffen

Geschatte herhaalbaarheid

Geschatte reproduceerbaarheid

Aanbevolen bereik

Dynamische methode

Laag smeltpunt

Ja

tot 25 %

1-5 %

tot 25 %

1-5 %

103 Pa tot 2x103 Pa

2 × 103 Pa tot 105 Pa

Statische methode

Ja

Ja

5-10 %

5-10 %

10 Pa – 105 Pa

10–2 Pa tot 105 Pa (1)

Isoteniscoopmethode

Ja

Ja

5-10 %

5-10 %

102 Pa tot 105 Pa

Effusiemethode: dampspanningsbalans

Ja

Ja

5-20 %

tot 50 %

10–3 tot– 1 Pa

Effusiemethode: Knudsencel

Ja

Ja

10-30 %

10–10 tot 1 P

Effusiemethode: isotherme thermogravimetrie

Ja

Ja

5-30 %

tot 50 %

10–10 tot 1 Pa

Gasverzadigingsmethode

Ja

Ja

10-30 %

tot 50 %

10–10 tot 103 Pa

Draaienderotormethode

Ja

Ja

10-20 %

10–4 tot 0,5 Pa

(1)Bij gebruik van een capacitieve manometer.

1.3. PRINCIPE VAN DE TEST

Over het algemeen wordt de dampspanning bepaald bij verschillende temperaturen. Binnen een beperkt temperatuurbereik is de logaritme van de dampspanning van een zuivere stof omgekeerd evenredig met de thermodynamische temperatuur, volgens de vereenvoudigde vergelijking van Clausius-Clapeyron:

image

waarin:

p

=

de dampspanning van de stof in pascal (Pa)

ΔHv

=

de verdampingswarmte in J mol–1

R

=

de universele molaire gasconstante, 8,314 J mol–1 K–1

T

=

de thermodynamische temperatuur in K

1.4. REFERENTIESTOFFEN

Het is niet nodig om referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om van tijd tot tijd de werking van een methode te controleren en om vergelijkingen tussen resultaten van verschillende methoden mogelijk te maken.

1.5. BESCHRIJVING VAN DE METHODE

1.5.1. Dynamische methode (methode van Cottrell)

1.5.1.1. Principe

De dampspanning wordt bepaald door het meten van de kooktemperatuur van een stof bij verschillende ingestelde waarden van de druk tussen ongeveer 103 Pa en 105 Pa. Deze methode wordt ook aanbevolen voor het bepalen van de kooktemperatuur. Voor dat doel is de methode bruikbaar tot 600 K. De kooktemperatuur van vloeistoffen op een diepte van 3 tot 4 centimeter is ongeveer 0,1 °C hoger dan aan de oppervlakte, vanwege de hydrostatische druk van de vloeistofkolom. In de methode van Cottrell (4) wordt de thermometer in de damp boven de oppervlakte van de vloeistof geplaatst en wordt de kokende vloeistof voortdurend over de kwikbol van de thermometer geleid. De kwikbol wordt bedekt door een dunne vloeistoflaag die in evenwicht is met de damp bij atmosferische druk. Zo geeft de thermometer de echte kooktemperatuur aan, zonder meetfouten door oververhitting of hydrostatische druk. De oorspronkelijk door Cottrell gebruikte pomp is weergegeven in figuur 1. Buis A bevat de kokende vloeistof. Een platina draad B, die in de bodem is bevestigd, bevordert gelijkmatig koken. De zijbuis C leidt naar een condensor en de mantel D zorgt ervoor dat het koude condensaat niet bij de thermometer E kan komen. Als de vloeistof in A kookt, worden de in de trechter opgevangen bellen en vloeistof via de twee armen van de pomp F over de kwikbol van de thermometer geleid.



Figuur 1image

Figuur 2image

Cottrell-pomp (4)

A:Thermokoppel

B:Vacuümbuffervolume

C:Precisiemanometer

D:Vacuüm

E:Meetpunt

F:Verwarmingselement (ca. 150 W)

1.5.1.2. Apparatuur

In figuur 2 is een zeer nauwkeurig meetapparaat weergegeven, dat werkt volgens het Cottrell-principe. Het bestaat uit een buis met een kookgedeelte aan de benedenzijde, een koeler in het midden, en een uitgang en een flens aan de bovenzijde. De Cottrell-pomp wordt in het kookgedeelte geplaatst, dat wordt verwarmd door middel van een elektrisch verwarmingspatroon. De temperatuur wordt gemeten via een mantelthermokoppel of een weerstandsthermometer die bij de flens aan de bovenzijde naar binnen steekt. De uitgang wordt verbonden aan het drukregelingssysteem, dat bestaat uit een vacuümpomp, een buffervolume, een manostaat voor het inlaten van stikstof om de druk te regelen, en een manometer.

1.5.1.3. Werkwijze

De stof wordt in het kookgedeelte gebracht. Indien vaste stoffen niet als poeder beschikbaar zijn, kunnen er problemen ontstaan, maar deze kunnen soms worden opgelost door de koelwatermantel te verwarmen. De apparatuur wordt bij de flens afgesloten en de stof wordt ontgast.

Vervolgens wordt de laagst gewenste druk ingesteld en wordt het verwarmingssysteem aangezet. Tegelijkertijd wordt de temperatuurvoeler verbonden met een recorder.

Het evenwicht is bereikt, wanneer bij een constante druk een constante kooktemperatuur kan worden afgelezen. Wees voorzichtig om „stoten” tijdens het koken te voorkomen. Voorts moet volledige condensatie plaatsvinden op de koeler. Bij het bepalen van de dampspanning van bij lage temperatuur smeltende stoffen moet men voorkomen dat de condensor verstopt raakt.

Nadat dit evenwichtspunt is geregistreerd, wordt een hogere druk ingesteld. Dit proces wordt herhaald totdat een druk van 105 Pa is bereikt (ongeveer 5 tot 10 meetpunten in totaal). Ter controle moeten de evenwichtspunten nogmaals worden bepaald bij afnemende druk.

1.5.2. Statische methode

1.5.2.1. Principe

In de statische methode (5) wordt de dampspanning bij thermodynamisch evenwicht bepaald bij een ingestelde temperatuur. Deze methode is geschikt voor stoffen en vloeistoffen die uit meerdere componenten bestaan en vaste stoffen in het bereik van 10–1 tot 105 Pa en eveneens, mits behoedzaam uitgevoerd, in het bereik van 1 tot 10 Pa.

1.5.2.2. Apparatuur

De opstelling bestaat uit een thermostatisch bad (met een nauwkeurigheid van ± 0,2 K), een vat voor het monster dat verbonden is aan de vacuümleiding, een manometer en een drukregelingssysteem. De monsterruimte (figuur 3a) is verbonden aan de vacuümleiding via een kraan en een hulpmanometer (een U-buis met een geschikte manometervloeistof) die dient voor de nulpuntsinstelling. Afhankelijk van het drukbereik en het chemisch gedrag van de teststof zijn kwik, siliconenoliën en ftalaten geschikte manometervloeistoffen. Het gebruik van kwik dient echter om milieuredenen waar mogelijk te worden vermeden. De teststof mag niet merkbaar oplossen in of reageren met de vloeistof in de U-buis (figuur 3b). Voor de manometer kan kwik worden gebruikt in het bereik van normale drukken tot 102 Pa; siliconenvloeistoffen en ftalaten zijn geschikt voor drukken van 10 tot 102 Pa. Er bestaan ook andere drukmeters die gebruikt kunnen worden tot 102 Pa, en verwarmbare membraancapaciteitmanometers kunnen zelfs worden gebruikt bij drukken beneden 10–1 Pa. De temperatuur wordt aan de buitenkant van de monsterruimte of in het vat zelf gemeten.

1.5.2.3. Werkwijze

Vul bij gebruikmaking van de in figuur 3a beschreven opstelling de U-buis met de gewenste vloeistof, die moet zijn ontgast bij hogere temperatuur voordat tot aflezen wordt overgegaan. De teststof wordt in de opstelling gebracht en bij lagere temperatuur ontgast. In het geval van een meercomponentensysteem moet de temperatuur laag genoeg zijn om te verzekeren dat de samenstelling van het materiaal niet verandert. Een evenwichtstoestand kan sneller worden bereikt door te roeren. Het monster kan onderkoeld worden met vloeibare stikstof of droog ijs, waarbij condensatie van lucht of pompvloeistof moet worden vermeden. Met de kraan boven de monsterruimte in geopende stand wordt vervolgens de ingesloten lucht gedurende een aantal minuten uit de apparatuur gepompt. Zo nodig moet de ontgassing verschillende keren herhaald worden.



Figuur 3aimage

Figuur 3bimage

Als het monster verhit wordt met de kraan gesloten, stijgt de dampspanning. Dit verandert het evenwicht van de vloeistof in de U-buis. Om hiervoor te compenseren, wordt stikstof of lucht via de kraan in het toestel binnengelaten tot de vloeistof in de drukmeter weer bij nul staat. De hiervoor vereiste druk kan afgelezen worden bij kamertemperatuur op een manometer of op een instrument met hogere precisie. Deze druk komt overeen met de dampspanning van de stof bij die meettemperatuur. Bij gebruikmaking van de in figuur 3b weergegeven opstelling wordt de dampspanning direct afgelezen.

De dampspanning wordt bepaald met voldoende kleine temperatuurintervallen (ongeveer 5 tot 10 meetpunten in totaal) tot aan de gewenste maximumtemperatuur.

Ter controle moeten de metingen bij lage temperaturen herhaald worden. Als de waarden die verkregen worden bij de herhaalde metingen niet overeenkomen met de grafiek die is verkregen bij stijgende temperatuur, kan dit te wijten zijn aan een van de volgende situaties:

i)Het monster bevat nog altijd lucht (bijvoorbeeld stoffen met hoge viscositeit) of bij lage temperatuur kokende stoffen die vrijkomt/vrijkomen bij verwarming;

ii)De stof ondergaat een chemische reactie in het onderzochte temperatuurbereik (bijvoorbeeld afbraak, polymerisatie).

1.5.3. Isoteniscoopmethode

1.5.3.1. Principe

De isoteniscoop (6) is gebaseerd op het principe van de statische methode. Bij deze methode wordt een monster in een bol gebracht die op constante temperatuur wordt gehouden en die wordt verbonden met een manometer en een vacuümpomp. Verontreinigingen die vluchtiger zijn dan de te onderzoeken stof worden verwijderd door te ontgassen bij gereduceerde druk. De dampspanning van het monster bij de ingestelde temperatuur wordt in evenwicht gebracht met een bekende druk van een inert gas. De isoteniscoop is ontwikkeld om de dampspanning van bepaalde vloeibare koolwaterstoffen te meten, maar is eveneens geschikt voor onderzoek van vaste stoffen. Over het algemeen is de methode niet geschikt voor meercomponentensystemen. Bij monsters die niet-vluchtige verontreinigingen bevatten vertonen de resultaten slechts geringe meetfouten. Het aanbevolen meetbereik is 102 tot 105 Pa.

1.5.3.2. Apparatuur

Een voorbeeld van een meetinstrument is afgebeeld in figuur 4. Zie ASTM D 2879-86 (6) voor een volledige beschrijving.

1.5.3.3. Werkwijze

Voor vloeistoffen dient de stof zelf als vulvloeistof in de hulpmanometer. Een hoeveelheid vloeistof die voldoende is voor het vullen van de bol en de korte arm van de manometer, wordt in de isoteniscoop gebracht. De isoteniscoop wordt met het vacuümsysteem verbonden, leeggepompt en daarna gevuld met stikstof. Het leegmaken en doorspoelen van het systeem wordt tweemaal herhaald om de resterende zuurstof te verwijderen. De gevulde isoteniscoop wordt horizontaal gehouden zodat het monster zich in een dunne laag verspreidt over de monsterbol en de manometer. De druk in het systeem wordt gereduceerd tot 133 Pa en het monster wordt zachtjes verwarmd tot het juist kookt (verwijdering van opgeloste gassen). De isoteniscoop wordt dan zo gedraaid dat het monster terugloopt naar de bol en het de korte arm van de manometer vult. De druk wordt op 133 Pa gehouden. De uitgetrokken punt van de monsterbol wordt verwarmd met een kleine vlam, totdat de damp die uit het monster vrijkomt voldoende expandeert om een deel van het monster uit het bovenste gedeelte van de bol en de manometerarm te verplaatsen naar het manometergedeelte van de isoteniscoop en zo een met damp gevulde, stikstofvrije ruimte te creëren. Vervolgens wordt de isoteniscoop in een thermostatisch bad geplaatst, en de druk van de stikstof aangepast tot deze druk gelijk is aan de druk van het monster. Bij het evenwichtspunt is de dampspanning van de stikstof gelijk aan de dampspanning van de stof.

image

Voor vaste stoffen worden manometervloeistoffen zoals siliconenoliën of ftalaten gebruikt, afhankelijk van het druk- en temperatuurbereik. De ontgaste manometervloeistof wordt in de ronding van de lange arm van de isoteniscoop gebracht. Daarna wordt de te onderzoeken vaste stof in de bol gebracht en bij hogere temperatuur ontgast. Vervolgens wordt de isoteniscoop gekanteld zodat de manometervloeistof in de U-buis kan stromen.

1.5.4. Effusiemethode: dampspanningsbalans (7)

1.5.4.1. Principe

Een monster van een teststof wordt verwarmd in een kleine oven en in een vacuüm stolp gebracht. De oven wordt afgesloten met een deksel met kleine openingen van bekende diameter. De damp van de stof die door een van de openingen ontsnapt, wordt naar de balansschaal van een zeer gevoelige balans geleid, die ook is omgeven door een vacuüm stolp. In sommige ontwerpen wordt de balansschaal omgeven door een koelpot voor warmteafvoer naar buiten door middel van thermische geleiding en wordt deze door straling gekoeld zodat de ontsnappende damp erop condenseert. De impuls van de dampstroom werkt als kracht op de balansschaal. De dampspanning kan op twee manieren worden afgeleid: rechtstreeks uit de kracht op de balansschaal en tevens uit de verdampingssnelheid met behulp van de Hertz-Knudsen-vergelijking (2):

image

waarin:

G

=

verdampingssnelheid (kg s–1 m–2)

M

=

molaire massa (g mol–1)

T

=

temperatuur (K)

R

=

universele gasconstante (J mol–1 K–1)

p

=

dampspanning (Pa)

Het aanbevolen meetbereik is 10–3 tot 1 Pa.

1.5.4.2. Apparatuur

Het algemene principe van de opstelling is weergegeven in figuur 5.

image



A:

Grondplaat

F:

Koelpot en koelstaaf

B:

Instrument met bewegende spiraal

G:

Verdampingsoven

C:

Stolp

H:

Dewarvat met vloeibare stikstof

D:

Balans met balansschaal

I:

Temperatuurmeting van het monster

E:

Vacuüm meetinstrument

J:

Teststof

1.5.5. Effusiemethode: Knudsencel

1.5.5.1. Principe

Deze methode berust op de schatting van de massa van de hoeveelheid teststof die per tijdseenheid in de vorm van damp door een gekalibreerde micro-opening uit een Knudsencel (8) stroomt, in ultravacuüm toestand. De uitgestroomde dampmassa kan verkregen worden door bepaling van de afname van de massa van de cel of door condensatie van de damp bij lage temperatuur en bepaling van de hoeveelheid verdampte stof met behulp van chromatografie. De dampspanning wordt berekend door toepassing van de Hertz-Knudsen-vergelijking (zie paragraaf 1.5.4.1) met correctiefactoren die afhankelijk zijn van de parameters van de apparatuur (9). Het aanbevolen meetbereik is 10–10 tot 1 Pa (10)(11)(12)(13)(14).

1.5.5.2. Apparatuur

Het algemene principe van de opstelling is weergegeven in figuur 6.

image



1:

Verbinding naar vacuüm

7:

Deksel met schroefdraad

2:

Uitsparingen voor platina weerstandsthermometer of temperatuurmeting en -regeling

8:

Vleugelmoeren

3:

Deksel voor vacuümva

9:

Bouten

4:

O-ring

10:

Roestvrijstalen uitstroomcel

5:

Aluminium vacuümvat

11:

Verwarmingspatroon

6:

Onderdeel voor het plaatsen en verwijderen van de cellen

1.5.6. Effusiemethode: isotherme thermogravimetrie

1.5.6.1. Principe

Deze methode berust op bepaling van de verhoogde verdampingssnelheden voor de teststof bij hogere temperaturen en omgevingsdruk door middel van thermogravimetrie (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20). De verdampingssnelheden vT worden verkregen door de gekozen verbinding bloot te stellen aan een atmosfeer van langzaam stromend inert gas en bij bekende isotherme temperaturen T in Kelvin de gewichtsafname gedurende geschikte tijdsperioden te meten. De dampspanningen pT worden berekend uit de vT-waarden met behulp van het lineaire verband tussen de logaritme van de dampspanning en de logaritme van de verdampingssnelheid. Indien nodig kan worden geëxtrapoleerd tot temperaturen van 20 en 25 °C door log pT uit te zetten tegen 1/T. Deze methode is geschikt voor stoffen met dampspanningen tot 10–10 Pa (10–12 mbar) en met een zuiverheid die zo dicht mogelijk de 100 % benadert, teneinde een verkeerde interpretatie van de gemeten gewichtsafname te vermijden.

1.5.6.2. Apparatuur

Het algemene principe van de proefopstelling is weergegeven in figuur 7.

image

De verdampte teststofmoleculen worden meegevoerd in een stroom van droog stikstofgas. Deze strijkt langs het dragerplaatje, dat aan een microbalans in een thermostatisch geregelde ruimte hangt. Na het verlaten van deze ruimte wordt de gasstroom gezuiverd door een sorptiemiddel.

1.5.6.3. Werkwijze

De teststof wordt als homogene laag op het oppervlak van een geruwd glasplaatje aangebracht. Bij vaste stoffen wordt het plaatje gelijkmatig bevochtigd met een oplossing van de stof in een geschikt oplosmiddel en in een inerte atmosfeer gedroogd. Voor de meting wordt het dragerplaatje in een thermogravimetrisch analyseapparaat gehangen, waarna continu de gewichtsafname als functie van de tijd wordt gemeten.

De verdampingssnelheid vT bij een bepaalde temperatuur wordt berekend uit de gewichtsafname Δm van het dragerplaatje met behulp van de vergelijking

image

waarin F staat voor de oppervlakte van de teststoflaag, gewoonlijk de oppervlakte van het dragerplaatje, en t de tijd is waarin de massa met Δm afneemt.

De dampspanning pT wordt berekend op basis van het verband met de verdampingssnelheid vT:

Log pT = C + D log vT

waarin C en D constanten zijn die specifiek zijn voor de gebruikte proefopstelling en die afhangen van de diameter van de meetruimte en de stroomsnelheid van het stikstofgas. Deze constanten moeten eenmalig worden bepaald door een reeks verbindingen met bekende dampspanningen te meten en log pT uit te zetten tegen log vT (11)(21)(22).

Het verband tussen de dampspanning pT en de kelvintemperatuur T wordt gegeven door

Log pT = A + B 1/T

waarin A en B constanten zijn die worden verkregen door log pT uit te zetten tegen 1/T. Met behulp van deze vergelijking kan door extrapolatie de dampspanning voor iedere andere temperatuur worden verkregen.

1.5.7. Gasverzadigingsmethode (23)

1.5.7.1. Principe

Inert gas wordt bij kamertemperatuur en met een bekende stroomsnelheid door of over een monster van de teststof geleid. De stroomsnelheid moet laag genoeg zijn om de noodzakelijke verzadiging in de gasfase te verzekeren. De getransporteerde stof wordt opgevangen, over het algemeen met behulp van een sorptiemiddel, en aan kwantitatieve analyse onderworpen. Als een alternatief voor dampvallen met daarop volgende analyse kunnen in serie gezette analytische technieken zoals chromatografie worden gebruikt om de hoeveelheid getransporteerde stof te meten. De dampspanning wordt berekend met de aanname dat wordt voldaan aan de ideale gaswet en dat de totale druk van een gasmengsel gelijk is aan de som van de drukken van de componenten van het gasmengsel. De partiële druk van de teststof, met andere woorden de dampspanning, wordt berekend uit het bekende totale gasvolume en het gewicht van het getransporteerde materiaal.

De gasverzadigingsmethode is geschikt voor vaste en vloeibare stoffen en kan worden gebruikt voor dampspanningen tot 10–10 Pa (10)(11)(12)(13)(14). De methode is het betrouwbaarst voor dampspanningen beneden 103 Pa. Boven 103 Pa levert de methode over het algemeen een te hoge waarde voor de dampspanning op, waarschijnlijk als gevolg van aerosolvorming. Aangezien de metingen van de dampspanningen bij kamertemperatuur worden uitgevoerd hoeven de data niet te worden geëxtrapoleerd vanaf hoge temperaturen en wordt extrapolatie vanaf hoge temperaturen, dikwijls aanleiding tot ernstige meetfouten, vermeden.

1.5.7.2. Apparatuur

De methode vereist het gebruik van een thermostatisch geregeld vat. In de opzet in figuur 8 is een vat weergegeven met drie houders voor vaste monsters en drie houders voor vloeibare monsters, zodat zowel voor een vast als voor een vloeibaar monster een analyse in drievoud kan worden uitgevoerd. De temperatuur wordt constant gehouden ± 0,5 °C of beter.

image

Als dragergas wordt over het algemeen stikstof gebruikt, maar in een enkel geval kan een ander gas nodig zijn (24). Het dragergas moet droog zijn. De gasstroom wordt in 6 stromen gesplitst, geregeld met naaldventielen (opening ongeveer 0,79 mm), en stroomt het vat in door koperen buizen met een binnendiameter van 3,8 mm. Als zich een temperatuurevenwicht heeft ingesteld stroomt het gas door het monster en de sorptieval, waarna het het vat verlaat.

Vaste monsters worden geladen in glazen buisjes met een binnendiameter van 5 mm, met propjes glaswol aan weerszijden (zie figuur 9). In figuur 10 is een houder voor vloeibare monsters weergegeven en een sorptiesysteem. De best reproduceerbare methode om de dampspanning van vloeistoffen te meten is door de vloeistof aan te brengen op glasparels of op een inert sorptiemiddel als silica, en hiermee de houder te beladen. Als alternatief kan men het dragergas door een grof glasfrit leiden en het door een kolom van vloeibare teststof laten borrelen.



Figuur 9image

Figuur 10image

Het sorptiesysteem bevat een voor- en een nafilter. Bij heel lage dampspanningen worden slechts kleine hoeveelheden stof door het sorptiemiddel opgevangen en kan adsorptie aan de glaswol en de glazen buizen tussen monster en sorptiemiddel een aanzienlijk probleem vormen.

Met vast CO2 gekoelde dampvallen vormen een andere efficiënte manier om het verdampte materiaal te verzamelen. Ze geven geen tegendruk op de verzadigingskolom en bovendien laat het opgevangen materiaal zich gemakkelijk kwantitatief analyseren.

1.5.7.3. Werkwijze

De stroomsnelheid van het uitstromende dragergas wordt gemeten bij kamertemperatuur. De stroomsnelheid wordt gedurende het experiment regelmatig gecontroleerd om zeker te zijn van de nauwkeurigheid van de waarde voor het totale volume van het dragergas. Continue controle met een massastroommeter verdient de voorkeur. Verzadiging van de gasfase kan aanzienlijke contacttijden vergen en dus vrij lage gasstroomsnelheden (25).

Aan het einde van het experiment worden het voor- en het nafilter van het sorptiesysteem apart geanalyseerd. De verbinding op elk filter wordt gedesorbeerd door toevoeging van een oplosmiddel. De resulterende oplossingen worden aan kwantitatieve analyse onderworpen om de massa te bepalen die van elk filter is gedesorbeerd. De keuze van de analysemethode (alsmede de keuzen van het sorptiemiddel en het desorberende oplosmiddel) hangt af van de aard van de teststof. De desorptie-efficiëntie wordt bepaald door een bekende hoeveelheid van de monsterstof op het sorptiemiddel aan te brengen, desorptie uit te voeren en te analyseren hoeveel is teruggewonnen. Het is van belang dat de desorptie-efficiëntie wordt gecontroleerd op of nabij de monsterconcentratie onder testomstandigheden.

Om er zeker van te zijn dat het dragergas verzadigd is met de teststof worden drie verschillende gasstroomsnelheden gebruikt. Als de berekende dampspanning niet verandert afhankelijk van de stroomsnelheid wordt aangenomen dat het gas is verzadigd.

De dampspanning wordt berekend met behulp van de vergelijking:

image

waarin:

p

=

dampspanning (Pa)

W

=

massa van de verdampte teststof (g)

V

=

volume verzadigd gas (m3)

R

=

universele molaire gasconstante (J mol–1 K–1)

T

=

temperatuur (K)

M

=

molaire massa van de teststof (g mol–1).

De gemeten volumes moeten worden gecorrigeerd voor druk- en temperatuurverschillen tussen de stroomsnelheidsmeter en de verzadigingskolom.

1.5.8. Draaienderotormethode

1.5.8.1. Principe

Bij deze methode wordt gebruikgemaakt van een draaienderotorviscositeitsmeter, met als meetelement een kleine stalen kogel die zweeft in een magnetisch veld en die aan het draaien wordt gebracht door rotatie van de velden (26)(27)(28). De draaisnelheid kan worden bepaald met meetspoelen. Als de kogel een bepaalde draaisnelheid (gewoonlijk ongeveer 400 toeren per seconde) heeft bereikt, wordt de energietoevoer gestopt waardoor een vertraging van de draaisnelheid optreedt, die het gevolg is van de gaswrijving. De afname van de rotatiesnelheid wordt gemeten als functie van de tijd. De dampspanning wordt afgeleid uit de drukafhankelijke snelheidsafname van de stalen kogel. Het aanbevolen meetbereik is 10–4 tot 0,5 Pa.

1.5.8.2. Apparatuur

Een schematische tekening van de proefopstelling is afgebeeld in figuur 11. De meetkop wordt geplaatst in een van thermostaatregeling voorziene ruimte (geregeld op 0,1 °C). De monsterhouder wordt in een aparte van een thermostaatregeling voorziene ruimte (eveneens geregeld op 0,1 °C) gebracht. Om condensatie te voorkomen, worden alle andere onderdelen van de opstelling op een hogere temperatuur gehouden. Het hele toestel wordt verbonden aan een hoogvacuümsysteem.

image

2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE

2.1. GEGEVENS

In elk van de voorafgaande methoden moet de dampspanning ten minste bij twee temperaturen worden bepaald. Bepaling van de dampspanning bij drie of meer temperaturen in het bereik van 0 tot 50 °C verdient de voorkeur, aangezien men dan kan controleren of de dampspanningskromme lineair is. Bij de effusiemethode (Knudsencel en isotherme thermogravimetrie) en de gasverzadigingsmethode, wordt een temperatuurbereik voor de meting van 120 tot 150 °C aanbevolen in plaats van 0 tot 50 °C.

2.2. TESTVERSLAG

In het verslag moeten de volgende gegevens worden opgenomen:

—de gebruikte methode;

—de nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen) en indien van toepassing, voorafgaande zuivering;

—het vereiste minimumaantal van twee waarden voor de dampspanning en de bijbehorende temperaturen — bij voorkeur drie of meer — in het bereik van 0 tot 50 °C (of 120 tot 150 °C);

—ten minste één van de temperaturen dient 25 °C of lager te zijn, indien technisch mogelijk volgens de gekozen methode;

—alle ruwe gegevens;

—grafiek van log p tegen 1/T;

—geschatte waarde van de dampspanning bij 20 of 25 °C.

Indien een verandering (faseovergang, ontleding) wordt waargenomen, dienen de volgende gegevens te worden opgenomen:

—aard van de verandering;

—temperatuur waarbij de verandering optreedt bij atmosferische druk;

—dampspanning bij 10 °C respectievelijk 20 °C beneden de overgangstemperatuur en bij 10 °C respectievelijk 20 °C boven deze temperatuur (tenzij het een overgang is van vaste fase naar gasfase).

Alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof, dienen te worden gerapporteerd.

3. LITERATUUR

(1)Publicatieblad van de Europese Unie L 383 A, 26-47 (1992).

(2)Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, Le Neindre, B., en Vodar, B., Eds., Butterworths, London.

(3)Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York.

(4)Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., Van Nostrand Company, New York.

(5)NF T 20-048 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10–1 to 105 Pa — Static method.

(6)ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure — temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.

(7)NF T 20-047 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa — Vapour pressure balance method.

(8)Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593.

(9)Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. Thermodynamics 7, 1173.

(10)Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521-532.

(11)Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition (2000)

(12)Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determination of small vapour pressures determination of the vapour pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 22-28

(13)Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 269-278.

(14)Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117-122.

(15)Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137-147.

(16)Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974) 393-400.

(17)Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relationship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) 161-168.

(18)Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995) 27-31.

(19)Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermogravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction (SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300-310.

(20)Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87(12) (1998) 1512-20.

(21)Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 150 °C.

(22)Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002)

(23)40 CFR, 796. (1993). pp 148-153, Office of the Federal Register, Washington DC

(24)Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435.

(25)Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375.

(26)Messer G., Röhl, P., Grosse G., en Jitschin W. (1987). J. Vac. Sci. Technol. (A), 5(4), 2440.

(27)Comsa G., Fremerey J.K., en Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. Technol. 17(2), 642.

(28)Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.

Aanhangsel

Schattingsmethode

INLEIDING

De berekende waarden van de dampspanning kunnen als volgt worden gebruikt:

—om te bepalen welke van de experimentele methoden geschikt is;

—om een schatting of grenswaarde te verkrijgen, ingeval de experimentele methode om technische redenen niet toegepast kan worden.

SCHATTINGSMETHODE

De dampspanning van vloeistoffen en vaste stoffen kan worden geschat met behulp van de gewijzigde Correlatie van Watson (a). Het enige benodigde gegeven is de normale kooktemperatuur. De methode is toepasbaar in het drukbereik van 105 tot 10–5 Pa.

Uitgebreide informatie over deze methode wordt gegeven in het „Handbook of Chemical Property Estimation Methods” (b). Zie ook OECD Environmental Monograph No.67 (c).

BEREKENINGSMETHODE

De dampspanning wordt als volgt berekend:

image

waarin:

T

=

betreffende temperatuur

Tb

=

normaal kookpunt

Pvp

=

dampspanning bij temperatuur T

ΔHvb

=

verdampingswarmte

ΔZb

=

compressibiliteitscoëfficiënt (geschat op 0,97)

m

=

empirische factor afhankelijk van de fysische toestand bij de betreffende temperatuur

Voorts:

image

waarin KF een empirische factor is waarin de polariteit van de stof tot uitdrukking komt. KF-waarden voor verscheidene typen verbindingen worden opgesomd in referentie (b).

Dikwijls zijn gegevens beschikbaar waarin een kookpunt bij verlaagde druk wordt gegeven. In dergelijke gevallen wordt de dampspanning als volgt berekend:

image

waarin T1 staat voor het kookpunt bij de verlaagde druk P1.

VERSLAG

Bij gebruik van de schattingsmethode dient de berekening uitvoerig in het verslag te worden gedocumenteerd.

LITERATUUR

(a)Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398.

(b)Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill.

(c)OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assessment (1993).

▼B

A.5. OPPERVLAKTESPANNING

1. METHODE

De beschreven methoden berusten op de testrichtlijn van de OESO (1). De fundamentele principes worden besproken in referentie (2).

1.1. INLEIDING

De hier beschreven methoden zijn geschikt voor de bepaling van de oppervlaktespanning van waterige oplossingen.

Voor het uitvoeren van deze test is het nuttig om van tevoren te beschikken over gegevens inzake de oplosbaarheid in water, de structuur, de hydrolyseerbaarheid en de kritische concentraties voor de vorming van micellen.

De hieronder beschreven methoden zijn geschikt voor de meeste chemische stoffen, ongeacht de zuiverheid ervan.

Bepaling van de oppervlaktespanning met behulp van de ringspanningsmeter is alleen mogelijk voor waterige oplossingen met een dynamische viscositeit van minder dan ongeveer 200 mPa s.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN

De vrije-oppervlakte-enthalpie per oppervlakte-eenheid heet de oppervlaktespanning.

De oppervlaktespanning wordt uitgedrukt in

N/m (SI-eenheid) of in m

N/m (SI-subeenheid).

1 N/m = 103 dyne/cm

1 mN/m = 1 dyne/cm in het verouderde cgs-systeem.

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methoden mogelijk te maken.

Een aantal referentiestoffen met zeer uiteenlopende oppervlaktespanningen staan vermeld in referenties (1) en (3).

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEN

De methoden berusten op de meting van de maximale kracht die verticaal moet worden uitgeoefend op een beugel of een ring die het oppervlak van de te onderzoeken vloeistof in een meetbak raakt, om deze beugel of ring van dit oppervlak te scheiden, of op een plaat waarvan een rand het oppervlak raakt, om de vloeistoflaag die zich heeft gevormd op te trekken.

Stoffen die oplosbaar zijn in water met een concentratie van ten minste 1 mg/l worden getest in waterige oplossingen bij één concentratie.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

Deze methoden zijn nauwkeuriger dan waarschijnlijk voor milieubeoordelingsdoeleinden noodzakelijk is.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN

De stof wordt opgelost in gedestilleerd water. De concentratie van deze oplossing moet 90 % van die van een verzadigde oplossing in water bedragen. Indien deze concentratie de 1 g/l overschrijdt, wordt een oplossing van 1 g/l gebruikt voor de bepaling. Stoffen met een oplosbaarheid in water van minder dan 1 mg/l hoeven niet te worden onderzocht.

1.6.1. Plaatmethode

Zie ISO 304 en NF T 73-060 („Surface Active Agents — Determination of Surface Tension by Drawing up Liquid Films”).

1.6.2. Beugelmethode

Zie ISO 304 en NF T 73-060 („Surface Active Agents — Determination of Surface Tension by Drawing up Liquid Films”).

1.6.3. Ringmethode

Zie ISO 304 en NF T 73-060 („Surface Active Agents — Determination of Surface Tension by Drawing up Liquid Films”).

1.6.4. Geharmoniseerde ringmethode (OESO)

1.6.4.1. Apparatuur

In de handel verkrijgbare spanningsmeters kunnen voor deze metingen worden gebruikt. Zij bestaan uit:

—draaitafeltje;

—systeem voor het meten van de kracht;

—meetlichaam (ring);

—meetvat.

1.6.4.1.1. Draaitafeltje

Het draaitafeltje wordt gebruikt als draagvlak voor het meetvat met temperatuurregeling, waarin de te onderzoeken stof zich bevindt. Tezamen met het systeem voor het meten van de kracht is het draaitafeltje aan een rek gemonteerd.

1.6.4.1.2. Systeem voor het meten van de kracht

Het systeem voor het meten van de kracht (zie figuur) bevindt zich boven het draaitafeltje. De fout bij het meten van de kracht mag niet meer bedragen dan ± 10-6 N, hetgeen overeenkomt met een foutgrens van ± 0,1 mg in een massameting. De meetschaal van de in de handel verkrijgbare tensiometers is meestal geijkt in mN/m zodat de oppervlaktespanning met een nauwkeurigheid van 0,1 mN/m rechtstreeks in mN/m kan worden afgelezen.

1.6.4.1.3. Meetlichaam (ring)

De ring bestaat meestal uit een draad van platina-iridium met een dikte van ongeveer 0,4 mm en een gemiddelde omtrek van 60 mm. De ring wordt horizontaal opgehangen aan een metalen stift en een ophangsysteem om de verbinding met het krachtmeetsysteem tot stand te brengen (zie figuur).

(alle maten in mm)

image

1.6.4.1.4. Meetvat

Voor de te onderzoeken oplossing wordt een glazen meetvat met temperatuurregeling gebruikt. Het meetvat dient zo te zijn ontworpen dat tijdens de meting de temperatuur van de testvloeistof en de gasfase daarboven constant is en dat het monster niet kan verdampen. Ronde glazen bekers met een inwendige doorsnede van ten minste 45 mm zijn aanvaardbaar.

1.6.4.2. Voorbereiding van het apparaat

1.6.4.2.1. Schoonmaken

Glazen vaten dienen zorgvuldig te worden schoongemaakt. Zo nodig moeten zij worden gespoeld met heet chroomzuur en vervolgens met stroperig fosforzuur (83 tot 98 gewichtsprocent H3PO4), dan grondig gespoeld met leidingwater, uitgewassen met tweemaal gedestilleerd water tot een neutrale pH, en vervolgens gedroogd of omgespoeld met een gedeelte van de te onderzoeken vloeistof.

De ring wordt eerst zorgvuldig in water gespoeld ten einde wateroplosbare stoffen te verwijderen, daarna kort in chroomzuur gedompeld, in tweemaal gedestilleerd water gewassen tot een neutrale pH is bereikt en ten slotte kort verhit boven een methanolvlam.

NB:

Verontreinigende stoffen zoals siliconen die niet in chroomzuur of fosforzuur oplossen, dienen met een geschikt organisch oplosmiddel te worden verwijderd.

1.6.4.2.2. IJking van het apparaat

Bij de validering van het apparaat wordt het nulpunt gecontroleerd en zodanig ingesteld dat met de uitslag van de wijzer een nauwkeurige bepaling in mN/m mogelijk is.

Het apparaat wordt, bijvoorbeeld met behulp van een waterpas aan de onderzijde van de tensiometer, horizontaal opgesteld; hiertoe wordt gebruik gemaakt van de schroeven aan de onderzijde van het apparaat.

Na het aanbrengen van de ring aan het apparaat en alvorens deze in de vloeistof te dompelen wordt de wijzer van de tensiometer op nul gezet en wordt nagegaan of de ring evenwijdig aan het vloeistofoppervlak loopt. Hierbij kan het vloeistofoppervlak als spiegel worden gebruikt.

Het ijken kan op twee manieren geschieden:

a)Met behulp van een massa; hierbij worden ruiters met een bekende massa van 0,1 tot 1,0 g op de ring aangebracht; de ijkfactor Фa, waarmee alle afgelezen waarden moeten worden vermenigvuldigd, wordt bepaald met behulp van de volgende vergelijking (1):



image

(1)

waarin:

image

(mN/m)

m

=

massa van de ruiter (g)

g

=

versnelling door de zwaartekracht (981 cm s-2 op zeeniveau)

b

=

gemiddelde omtrek van de ring (in cm)

σa

=

uitslag van de tensiometer na het plaatsen van de ruiter op de ring (mN/m).

b)Met behulp van water; hierbij wordt gebruik gemaakt van zuiver water met een oppervlaktespanning van bijvoorbeeld 72,3 mN/m bij 23 oC; deze procedure verloopt weliswaar vlotter dan die met de ruiters, maar houdt steeds het gevaar in dat de oppervlaktespanning van het water onjuist is door de aanwezigheid van sporen oppervlakteactieve stoffen.

De ijkfactor, Фb, waarmee alle meetresultaten moeten worden vermenigvuldigd, wordt bepaald met behulp van de volgende vergelijking (2):



image

(2)

waarin:

σo

=

literatuurwaarde voor de oppervlaktespanning van water (mN/m),

σg

=

gemeten waarde voor de oppervlaktespanning van het water (mN/m) beide bij dezelfde temperatuur.

1.6.4.3. Bereiding van de monsters

De te onderzoeken stoffen worden tot de gewenste concentraties in water opgelost; er mogen geen onoplosbare stoffen in het water voorkomen.

De oplossing moet op constante temperatuur worden gehouden (± 0,5oC). Aangezien de oppervlaktespanning van een oplossing in het meetvat met de tijd verandert, moeten er op verschillende tijdstippen metingen worden verricht en moet van de resultaten een kromme worden uitgezet waaruit het verloop van de oppervlaktespanning als functie van de tijd blijkt. Zodra geen verdere wijzigingen meer worden waargenomen, is er een evenwichtstoestand bereikt.

Stof en gasvormige verontreinigingen beïnvloeden het resultaat van de meting. De meting dient derhalve te worden verricht onder een scherm.

1.6.5. Testomstandigheden

De metingen dienen plaats te vinden bij ongeveer 20 oC en de temperatuur dient op ± 0,5oC na constant te zijn.

1.6.6. Uitvoering van de proef

De te meten oplossingen dienen in het zorgvuldig schoongemaakte meervat te worden overgebracht waarbij schuimvorming wordt vermeden; vervolgens wordt het meetvat op de tafel van het testapparaat geplaatst. Het tafelblad met het meetvat wordt omhoog gebracht tot de ring is gedompeld onder het oppervlak van de te onderzoeken oplossing. Vervolgens laat men het tafelblad geleidelijk en regelmatig (met een snelheid van ongeveer 0,5 cm/min) zakken om de ring van het oppervlak vrij te maken, tot de maximale kracht is bereikt. De vloeistoflaag die aan de ring hangt, mag de ring niet loslaten. Na de meting wordt de ring weer onder het oppervlak gedompeld en wordt de meting herhaald tot een constante waarde voor de oppervlaktespanning is bereikt. Bij iedere bepaling dient de tijd, die verlopen is sinds het overbrengen van de vloeistof naar het meetvat, te worden genoteerd. De meter wordt afgelezen op het moment van de maximale kracht die vereist is om de ring van het oppervlak van de vloeistof los te trekken.

2. GEGEVENS

Ter berekening van de oppervlaktespanning wordt de van het apparaat afgelezen waarde in mN/m eerst vermenigvuldigd met de ijkfactor Фa of Фb (afhankelijk van de toegepaste ijkprocedure). Dit leidt tot een waarde die slechts bij benadering juist is en daarom nog verder moet worden gecorrigeerd.

Harkins en Jordan (4) hebben langs empirische weg correctiefactoren bepaald voor oppervlaktespanningen die met de ringmethode zijn gemeten; deze correctiefactoren zijn afhankelijk van de afmetingen van de ring, de dichtheid van de vloeistof en de oppervlaktespanning.

Het is tamelijk omslachtig om de correctiefactor voor iedere meting afzonderlijk met behulp van de tabellen van Harkins en Jordan te bepalen voor de berekening van de oppervlaktespanning; daarom kan voor waterige oplossingen gebruik worden gemaakt van een vereenvoudigde procedure waarbij de gecorrigeerde waarden voor de oppervlaktespanning rechtstreeks uit de volgende tabel worden afgelezen (tussenliggende waarden worden via interpolatie verkregen).



Tabel

Correctie van de gemeten oppervlaktespanning

Uitsluitend voor waterige oplossingen, p ≈ 1 g/cm3

R

= 9,55 mm (gemiddelde straal van de ring)

r

= 0,185 mm (straal van de draad van de ring)



Gemeten waarde

Gecorrigeerde waarde (mN/m)

(IJking met massa (zie 1.6.4.2.2 (a))

IJking met water (zie 1.6.4.2.2 (b))

20

16,9

18,1

22

18,7

20,1

24

20,6

22,1

26

22,4

24,1

28

24,3

26,1

30

26,2

28,1

32

28,1

30,1

34

29,9

32,1

36

31,8

34,1

38

33,7

36,1

40

35,6

38,2

42

37,6

40,3

44

39,5

42,3

46

41,4

44,4

48

43,4

46,5

50

45,3

48,6

52

47,3

50,7

54

49,3

52,8

56

51,2

54,9

58

53,2

57,0

60

55,2

59,1

62

57,2

61,3

64

59,2

63,4

66

61,2

65,5

68

63,2

67,7

70

65,2

69,9

72

67,2

72,0

74

69,2

76

71,2

78

73,2

Deze tabel werd opgesteld aan de hand van de correctie volgens Harkins en Jordan en overeenkomstig de DIN-normen (DIN 53914) voor water en waterige oplossingen (met een dichtheid van p = 1 g/cm3) en voor in de handel verkrijgbare ringen met afmetingen R = 9,55 mm (gemiddelde straal van de ring) en r = 0,185 mm (straal van de draad van de ring). De tabel geeft de gecorrigeerde waarden voor oppervlaktespanningsmetingen die werden uitgevoerd na ijking met massa of met water.

Volgens een alternatieve methode zonder voorafgaande ijking kan de oppervlaktespanning als volgt worden berekend:

image

waarin:

F

=

de kracht die op de dynamometer wordt afgelezen bij het breken van de film

R

=

de straal van de ring

f

=

de correctiefactor (1).

3. RAPPORTAGE

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFENEMINGEN

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—gebruikte testmethode;

—gebruikt type water of oplossing;

—nauwkeurige specificatie van de stoffen (beschrijving en verontreinigingen);

—meetresultaten: afgelezen oppervlaktespanning waarbij zowel de afzonderlijke resultaten als het rekenkundig gemiddelde daarvan moet worden vermeld, alsmede het gecorrigeerde gemiddelde (waarbij rekening is gehouden met de correctiefactór voor het apparaat en de correctietabel);

—concentratie van de oplossing;

—temperatuur bij de meting;

—ouderdom van de gebruikte oplossing, en met name de tijd tussen de bereiding en de meting van de oplossing;

—beschrijving van de tijdafhankelijkheid van de oppervlaktespanning, na het overbrengen van de oplossing in het meetvat;

—alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, en met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de stof.

3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN

Met het oog op het feit dat gedestilleerd water een oppervlaktespanning heeft van 72,75 mN/m bij 20 oC, dienen stoffen met een oppervlaktespanning van minder dan 60 mN/m, zoals gemeten met deze methode, beschouwd te worden als oppervlakteactieve stoffen.

4. LITERATUUR

(1)OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115 — Decision of the Council C(81) 30 Final.

(2)R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ. New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV.

(3)Pure Appl. Chem., 1976, Vol. 48, 511.

(4)Harkins, W. D., Jordan, H. F., J. Amer. Chem. Soc, 1930, Vol. 52, 1751.

A.6. OPLOSBAARHEID IN WATER

1. METHODE

De beschreven methoden berusten op de testrichtlijn van de OESO (1).

1.1. INLEIDING

Voor het uitvoeren van deze test is het nuttig om van tevoren te beschikken over gegevens inzake de structuurformule, de dampspanning, de dissociatieconstanten en de hydrolyse (als functie van de pH) van de stof.

Er bestaat niet één methode waarmee alle mogelijke waarden van de oplosbaarheid in water kunnen worden onderzocht.

De twee hieronder beschreven meetmethoden beslaan alle mogelijke waarden van de oplosbaarheid maar zijn niet van toepassing op vluchtige stoffen:

—de eerste methode wordt aangeduid als de „kolom-elutie”-methode en is van toepassing op chemisch zuivere stoffen met een geringe oplosbaarheid (< 10-2 g/l), welke stabiel zijn in water;

—de tweede methode wordt aangeduid als de „methode met de kolf” en is van toepassing op chemisch zuivere stoffen met een hogere oplosbaarheid (> 10-2 g/l), welke stabiel zijn in water.

De oplosbaarheid in water van de te onderzoeken stof kan aanzienlijk worden beïnvloed door de aanwezigheid van verontreinigingen.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN

De oplosbaarheid van een stof in water wordt opgegeven als de massaconcentratie van de stof in een verzadigde oplossing in water bij een gegeven temperatuur. De oplosbaarheid in water wordt uitgedrukt in eenheden massa per volume oplossing. De SI-eenheid is kg/m3 (g/l kan ook worden gebruikt).

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methodes mogelijk te maken.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEN

De hoeveelheid van het monster en de tijd die nodig zijn om de verzadigingswaarde te bereiken, moeten bij benadering worden bepaald in een eenvoudige inleidende test.

1.4.1. Kolom-elutie-methode

Deze methode is gebaseerd op de elutie van de te onderzoeken stof met water uit een microkolom welke is gevuld met een inert dragermateriaal zoals glasparels of zand, gedekt met een overmaat aan de te onderzoeken stof. De oplosbaarheid in water is bepaald zodra de massaconcentratie van het eluaat constant is. Dit blijkt uit een constante concentratiewaarde als functie van de tijd.

1.4.2. Methode met de kolf

Bij deze methode wordt de stof (vaste stoffen moeten worden fijngemaakt) opgelost in water bij een temperatuur die iets hoger is dan de testtemperatuur. Zodra verzadiging is bereikt wordt het mengsel afgekoeld en op de testtemperatuur gehouden, terwijl net zo lang wordt geroerd totdat er een evenwichtstoestand is bereikt. Als alternatief kan de meting rechtstreeks bij de testtemperatuur uitgevoerd worden, op voorwaarde dat men er, via geschikte monsternamen, zeker van is dat het verzadigingsevenwicht bereikt is. Vervolgens wordt de massaconcentratie van de stof in de waterige oplossing, welke geen onopgeloste deeltjes mag bevatten, bepaald aan de hand van een geschikte analysemethode.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

1.5.1. Herhaalbaarheid

Voor de kolom-elutie-methode kan < 30 % haalbaar zijn; voor de methode met de kolf dient < 15 % in acht te worden genomen.

1.5.2. Gevoeligheid

Deze is afhankelijk van de analysemethode, maar het is mogelijk massaconcentraties te bepalen tot een waarde van 10-6 g/l.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN

1.6.1. Testomstandigheden

De test wordt bij voorkeur uitgevoerd bij 20 oC ± 0,5oC. Als wordt verwacht dat de oplosbaarheid temperatuurafhankelijk is (> 3 % per oC), dan wordt nog bij twee andere temperaturen gemeten, die ten minste 10 oC boven, respectievelijk 10 oC onder de eerste temperatuur liggen. In dit geval dient de temperatuurregeling op ± 0,1oC nauwkeurig te zijn. De gekozen temperatuur moet in alle betrokken delen van de apparatuur constant worden gehouden.

1.6.2. Inleidende test

In een maatcylinder van 10 ml, voorzien van een glazen stop, wordt gedestilleerd water op kamertemperatuur toegevoegd aan ongeveer 0,1 g monster (vaste stoffen moeten worden fijngemaakt). Toenemende volumes gedestilleerd water worden stapsgewijze toegevoegd, volgens onderstaande tabel.



0,1 g opgeloste stof in „x” ml water

0,1

0,5

1

2

10

100

> 100

Oplosbaarheid bij benadering (g/l)

> 1 000

1 000-200

200-100

100-50

50-10

10-1

< 1

Nadat de aangegeven hoeveelheid water is toegevoegd, wordt het mengsel telkens gedurende tien minuten hard geschud en vervolgens visueel onderzocht op eventuele onopgeloste delen van het monster. Als het monster of delen ervan onopgelost zijn nadat nog 10 ml water is toegevoegd, dient het experiment te worden herhaald in een maatcilinder van 100 ml met grotere volumes water. De tijd die nodig is om een stof op te lossen kan bij lagere waarden van de oplosbaarheid aanzienlijk langer zijn (minimaal 24 uur dient in acht te worden genomen). De benaderde waarde van de oplosbaarheid is in de tabel vermeld onder de hoeveelheid water waarin het monster geheel wordt opgelost. Als de stof nog steeds onoplosbaar blijkt moet meer dan 24 uur gewacht worden (maximaal 96 uur), of dient verdere verdunning plaats te vinden om te bepalen of de kolom-elutie-methode dan wel de methode met de kolf moet worden gebruikt.

1.6.3. Kolom-elutie-methode

1.6.3.1. Dragermateriaal, oplosmiddel en eluens

Het dragermateriaal voor de kolom-elutie-methode moet inert zijn. Bruikbare materialen zijn bijvoorbeeld glasparel en zand. Voor het aanbrengen van de te onderzoeken stof op het dragermateriaal dient gebruik te worden gemaakt van een geschikt vluchtig en analytisch zuiver oplosmiddel. Als eluens dient water, dat tweemaal gedestilleerd is in glas- of kwartsapparatuur, te worden gebruikt.

Opmerking:

Er mag geen gebruik worden gemaakt van water dat rechtstreeks uit een organische ionenwisselaar komt.

1.6.3.2. Laden van het dragermateriaal

Ongeveer 600 mg dragermateriaal wordt afgewogen en overgebracht in een rondbodemkolf van 50 ml.

Een afgewogen hoeveelheid van de te onderzoeken stof wordt opgelost in het gekozen oplosmiddel. De juiste hoeveelheid van deze oplossing wordt bij het dragermateriaal gevoegd. Het oplosmiddel moet, bijvoorbeeld in een roterende verdamper, volledig worden verdampt. Bij onvolledige verwijdering van het oplosmiddel kan het dragermateriaal, ten gevolge van verdelingseffecten aan het oppervlak, later niet worden verzadigd met water.

Het laden van het dragermateriaal kan aanleiding geven tot problemen (onjuiste resultaten) als de te onderzoeken stof wordt afgezet als olie of in een andere kristalvorm. Dit probleem moet experimenteel worden onderzocht en de bijzonderheden moeten worden gerapporteerd.

Het beladen dragermateriaal wordt gedurende ongeveer twee uur bevochtigd in ongeveer 5 ml water, waarna de suspensie wordt aangebracht op de microkolom. Anderzijds kan men ook het droge, beladen dragermateriaal direct in de met water gevulde microkolom brengen, en daarna ongeveer twee uur wachten totdat een evenwichtstoestand is ontstaan.

De stof kan op twee verschillende manieren van het dragermateriaal worden geëlueerd:

—recirculatiepomp (zie figuur 1);

—voorraadfles (zie figuur 4).

1.6.3.3. Kolom-elutie-methode met recirculatiepomp

Een schema van het systeem is afgebeeld in figuur 1. In figuur 2 is een geschikte microkolom afgebeeld: elke maat is echter aanvaardbaar mits deze voldoet aan de criteria voor reproduceerbaarheid en gevoeligheid. De kolom moet aan de bovenzijde zijn voorzien van een reservoir voor ten minste vijf kolomvolumina water, en moet minimaal vijf monsters kunnen bevatten. Eventueel kunnen de afmetingen worden verminderd indien extra oplosmiddel wordt gebruikt ter vervanging van de eerste vijf kolomvolumina welke met verontreinigingen worden afgevoerd.

De kolom moet worden aangesloten op een recirculatiepomp waarmee een debiet van ongeveer 25 ml/uur kan worden ingesteld. De pomp wordt aangesloten door middel van polytetrafluorethyleen (PTFE) en/of glazen verbindingsstukken. De kolom en de pomp moeten zo worden opgesteld dat het mogelijk is om monsters te nemen van de uitstromende vloeistof en om het reservoir in evenwicht te houden met de atmosferische druk. Het kolommateriaal wordt ondersteund door een kleine (5 mm) prop glaswol waarmee ook deeltjes worden weggefilterd. Als recirculatiepomp kan bijvoorbeeld een peristaltische pomp of een membraanpomp worden gebruikt (er moet op worden toegezien dat aan de slangwand geen verontreiniging en/of adsorptie plaatsvindt).

De stroming door de kolom wordt op gang gebracht. Een debiet van ongeveer 25 ml/uur (dit komt overeen met ongeveer 10 kolomvolumina/uur voor de beschreven kolom) wordt aanbevolen. De eerste vijf kolomvolumina (minimaal) worden afgevoerd om wateroplosbare verontreinigingen te verwijderen. Vervolgens wordt de recirculatiepomp aan de onderzijde van de kolom aangesloten. De apparatuur blijft in werking totdat een evenwichtstoestand is bereikt; hiervoor geldt dat de concentraties in vijf opeenvolgende monsters niet meer dan ± 30 % mogen verschillen op aselecte wijze. Tussen de tijdstippen, waarop deze monsters worden genomen, moeten ten minste 10 kolomvolumina van het eluens passeren.

1.6.3.4. Kolom-elutie-methode met voorraadfles

Voorraadfles: voor aansluiting van de voorraadfles wordt gebruik gemaakt van een rond glazen slijpstuk en polytetrafluorethyleenslangen. Een debiet van ongeveer 25 ml/uur wordt aanbevolen. Er wordt een aantal opeenvolgende monsters van het eluaat genomen voor analyse volgens de gekozen methode.

In het middengebied van het eluaat, wanneer de concentraties constant zijn (± 30 %) in ten minste vijf opeenvolgende fracties, worden deze fracties gebruikt om de oplosbaarheid in water te bepalen.

In beide gevallen (circulatiepomp of voorraadfles) moet een tweede reeks metingen worden verricht waarbij het debiet de helft is van de aanvankelijke waarde. Als de resultaten van beide series metingen overeenstemmen, worden de testresultaten geaccepteerd. Als de oplosbaarheid bij het laagste debiet hoger blijkt, dan moet het halveren van het debiet worden voortgezet, totdat twee opeenvolgende series metingen dezelfde oplosbaarheid geven.

In beide gevallen (circulatiepomp of voorraadfles) moeten de monsters aan de hand van het Tyndall-effect (verstrooiing van licht) worden gecontroleerd op aanwezigheid van deeltjes in colloïdale toestand. De aanwezigheid van dergelijke deeltjes maakt de resultaten ongeldig, zodat de test moet worden herhaald nadat de filterwerking van de kolom is verbeterd.

De pH van elk monster moet worden geregistreerd. Er moet een tweede serie metingen worden uitgevoerd bij dezelfde temperatuur.

1.6.4. Methode met de kolf

1.6.4.1. Apparatuur

Voor de methode met de kolf is het volgende materiaal nodig:

—gangbaar laboratoriumglaswerk en -apparatuur;

—een apparaat om de oplossingen in beweging te brengen bij constante temperatuur;

—zo nodig voor emulsies een centrifuge (bij voorkeur met thermostaat);

—apparatuur voor analytische bepaling.

1.6.4.2. Meetprocedure

Aan de hand van de inleidende test wordt bepaald hoeveel materiaal nodig is om de gewenste hoeveelheid water te verzadigen. De benodigde hoeveelheid water hangt af van de analysemethode en van de oplosbaarheid. In drie van een glazen stop voorziene glazen vaten (bijvoorbeeld centrifugebuizen, kolven) wordt telkens ongeveer vijfmaal de aldus bepaalde hoeveelheid materiaal afgewogen. De gewenste hoeveelheid water wordt in elk vat gegoten, waarna de vaten goed worden afgesloten. De afgesloten vaten worden vervolgens bij een temperatuur van 30 oC in beweging gebracht. (Hiervoor wordt een schud- of roermachine gebruikt waarmee bij constante temperatuur kan worden gewerkt, bijvoorbeeld een magneetroerder in een waterbak met thermostaatregeling.) Na één dag wordt één van de vaten verwijderd, waarna onder af en toe roeren 24 uur wordt gewacht totdat bij de testtemperatuur een nieuwe evenwichtstoestand is ontstaan. Vervolgens wordt de inhoud van het vat gecentrifugeerd bij de testtemperatuur, waarna de concentratie van de teststof in de heldere waterige oplossing analytisch wordt bepaald. De beide andere kolven ondergaan dezelfde behandeling nadat zij gedurende twee respectievelijk drie dagen bij 30 oC zijn geëquilibreerd. Als de waarden voor de concentratie in ten minste de laatste twee vaten voldoen aan de vereiste reproduceerbaarheid, worden de testresultaten geaccepteerd. Als de resultaten van de vaten 1, 2 en 3 toenemende waarden geven, moet de hele test worden herhaald, waarbij langer wordt gewacht tot een evenwichtstoestand is ontstaan.

De meetprocedure kan ook worden uitgevoerd zonder voorverwarming bij 30 oC. Om de snelheid te kunnen schatten waarmee het verzadigingsevenwicht zich instelt, worden monsters genomen totdat blijkt dat verder roeren geen invloed meer heeft op de concentratie van de testoplossing.

De pH van elk monster moet worden geregistreerd.

1.6.5. Analyse

Hiervoor dient bij voorkeur een methode te worden toegepast waarmee verschillende stoffen kunnen worden onderscheiden, aangezien kleine hoeveelheden opgeloste verontreinigingen kunnen leiden tot grote fouten in de gemeten oplosbaarheid. Voorbeelden van zulke methoden zijn: gas- of vloeistofchromatografie, titratie, fotometrie, voltametrie.

2. GEGEVENS

2.1. KOLOM-ELUTIE-METHODE

Voor elke serie metingen moeten het gemiddelde en de standaardafwijking worden berekend van ten minste vijf opeenvolgende monsters, die op het verzadigingsniveau zijn genomen. De resultaten moeten worden opgegeven in eenheden massa per volume oplossing.

De gemiddelden van twee metingen met verschillend debiet moeten worden vergeleken en moeten een herhaalbaarheid beter dan 30 % hebben.

2.2. METHODE MET DE KOLF

Voor de drie kolven moeten de afzonderlijke resultaten worden vermeld en het gemiddelde van de als constant beschouwde resultaten (herhaalbaarheid beter dan 15 %) moet worden bepaald en opgegeven in eenheden massa per volume oplossing. Hiervoor kan het nodig zijn massa-eenheden om te rekenen naar volume-eenheden, waarbij rekening wordt gehouden met de dichtheid indien de oplosbaarheid zeer hoog is (> 100 g/l).

3. RAPPORTAGE

3.1. KOLOM-ELUTIE-METHODE

Het rapport dient zo mogelijk de volgende gegevens te bevatten:

—de resultaten van de inleidende test;

—nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen);

—de afzonderlijke concentraties, debieten en pH-waarden van elk monster;

—het gemiddelde en de standaardafwijking van ten minste vijf monsters uit elke serie die zijn genomen op het verzadigingsniveau;

—het gemiddelde van de twee opeenvolgende acceptabele series;

—de temperatuur van het water tijdens het verzadigingsproces;

—de toegepaste analysemethode;

—de aard van het toegepaste dragermateriaal;

—het laden van het dragermateriaal;

—het gebruikte oplosmiddel;

—elke gebleken chemische instabiliteit van de stof tijdens de test en de gebruikte methode;

—alle gegevens en opmerkingen, die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof.

3.2. METHODE MET DE KOLF

Het rapport dient zo mogelijk de volgende gegevens te bevatten:

—de resultaten van de inleidende test;

—nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen);

—de afzonderlijke analyses en het gemiddelde, indien meer dan één waarde werd bepaald, voor iedere kolf;

—de pH van elk monster;

—het gemiddelde van de waarden voor de verschillende kolven die onderling overeenstemden;

—de testtemperatuur;

—de toegepaste analysemethode;

—elke gebleken chemische instabiliteit van de stof tijdens de test en de gebruikte methode;

—alle gegevens en opmerkingen, die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof.

4. LITERATUUR

(1)OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105 — Decision of the Council C(81) 30 Final.

(2)NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method.

(3)NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method.

Aanhangsel

Figuur 1

Kolom-elutie-methode met recirculatiepomp

image

Figuur 2

Een voorbeeld van een microkolom

(alle afmetingen in mm)

image

Figuur 3

Een voorbeeld van een microkolom

(alle afmetingen in mm)

image

Figuur 4

Kolom-elutie-methode met voorraadfles

image

A.8. VERDELINGSCOËFFICIËNT

1. METHODE

De „schudfles”-methode berust op de testrichtlijn van de OESO (1).

1.1. INLEIDING

Voor het uitvoeren van deze test is het nuttig om van tevoren te beschikken over gegevens inzake de structuurformule, dissociatieconstante, oplosbaarheid in water, hydrolyse, oplosbaarheid in n-octanol en oppervlaktespanning van de stof.

Metingen van ioniseerbare stoffen dienen alleen te worden uitgevoerd met de niet-geïoniseerde vorm van de stof (vrij zuur of vrije base) verkregen met behulp van een geschikte buffer met een pH van minstens één pH-eenheid onder (vrij zuur) of boven (vrije base) de pK.

Deze testmethode omvat twee verschillende procedures: de schudflesmethode en de hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC). De eerste methode is toepasbaar wanneer de log Pow-waarde (zie verder voor definities) in het bereik van - 2 tot 4 valt, de tweede methode in het bereik van 0 tot 6. Alvorens een van beide experimentele procedures uit te voeren, dient eerst een voorlopige schatting van de verdelingscoëfficiënt te worden gemaakt.

De schudflesmethode is alleen van toepassing op chemisch zuivere stoffen die oplosbaar zijn in water en n-octanol. De methode is niet van toepassing op oppervlakteactieve stoffen (waarvoor een berekende waarde of een raming, gebaseerd op de individuele oplosbaarheid in n-octanol en water, moet worden gerapporteerd).

De HPLC-methode is niet toepasbaar op sterke zuren en basen, metaalcomplexen en oppervlakte-actieve stoffen die met het eluent kunnen reageren. Voor deze stoffen dient een berekende waarde of een raming, gebaseerd op de individuele oplosbaarheid in n -octanol en water, te worden gerapporteerd.

De HPLC-methode is minder gevoelig voor de aanwezigheid van verontreinigingen in de teststof dan de schudflesmethode. Desondanks kunnen verontreinigingen soms de interpretatie van de resultaten bemoeilijken omdat moeilijk kan worden bepaald welke piek bij welke stof hoort. Voor mengsels die een band zonder resolutie geven, moeten de boven- en ondergrens van log P worden gerapporteerd.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN

De verdelingscoëfficiënt (P) is gedefinieerd als de verhouding van de concentraties in evenwichtstoestand (Cj) van een opgeloste stof in een twee-fasensysteem bestaande uit twee niet-mengbare oplosmiddelen. Voor n-octanol en water:

image

De verdelingscoëfficiënt (P) is daarom het quotiënt van twee concentraties; gewoonlijk wordt deze waarde opgegeven als een logaritme met grondtal tien (log P).

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Schudflesmethode

Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methoden mogelijk te maken.

HPLC-methode

Om de gemeten HPLC-gegevens van een stof te kunnen correleren met de P-waarde, moet een ijklijn worden gemaakt van log P tegen de chromatografische gegevens, met behulp van minstens 6 referentiepunten. De gebruiker dient de geschikte referentiestoffen te kiezen. Zo mogelijk dient de Pow-waarde van minstens één referentiestof boven, en die van minstens één referentiestof onder de Pow van de teststof te liggen. Voor log P-waarden kleiner dan 4 kan bij de ijking worden uitgegaan van met de schudflesmethode verkregen gegevens. Voor log P-waarden groter dan 4 kan de ijking worden uitgevoerd met behulp van gevalideerde waarden uit de literatuur, op voorwaarde dat deze overeenkomen met de berekende waarden. Voor een grotere nauwkeurigheid verdient het de voorkeur om referentiestoffen te kiezen die qua structuur verwant zijn aan de te onderzoeken stof.

Er zijn uitgebreide lijsten beschikbaar met log Pow-waarden voor verschillende categorieën chemicaliën (2)(3). Als er geen gegevens over de verdelingscoëfficiēnt van structureel verwante stoffen beschikbaar zijn, mag een meer algemene ijking worden toegepast met andere ijkstoffen.

In aanhangsel 2 wordt een lijst van aanbevolen ijkstoffen en hun Pow-waarden gegeven.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

1.4.1. Schudflesmethode

Om een verdelingscoëfficiënt te kunnen bepalen, moet een evenwichtstoestand zijn bereikt tussen alle componenten van het systeem; de concentraties van de opgeloste stoffen moeten vervolgens in beide fasen worden bepaald. Uit de literatuur blijkt dat er voor dit probleem, dat wil zeggen het grondig mengen van beide fasen gevolgd door fasescheiding ten einde de evenwichtsconcentraties van de te onderzoeken stof te bepalen, verschillende technische oplossingen bestaan.

1.4.2. HPLC-methode

HPLC wordt uitgevoerd met analytische kolommen, gepakt met een in de handel verkrijgbare vaste fase, bestaande uit chemisch aan silica gebonden lange koolwaterstofketens (bijvoorbeeld C8, C18). Chemische stoffen die in deze kolommen geïnjecteerd worden, bewegen met verschillende snelheden door deze kolommen, wat een gevolg is van het verschil in verdeling tussen de mobiele fase en de stationaire koolwaterstoffase. Mengsels van stoffen worden geëlueerd in volgorde van waterafstotendheid, wateroplosbare stoffen het eerst en olieoplosbare stoffen het laatst, afhankelijk van hun koolwaterstof/water-verdelingscoëfficiënt. Op deze wijze kan de verhouding tussen de retentietijd in de (omgekeerde fase) kolom en de n-octanol/water-verdelingscoëfficiënt worden bepaald. De verdelingscoëfficiënt wordt afgeleid uit de capaciteitsfactor k, met de volgende formule:

image

waarin tR = retentietijd van de te onderzoeken stof, en t0 = gemiddelde tijd die een molecuul van het oplosmiddel nodig heeft om de kolom te passeren (dode tijd).

Kwantitatieve analysemethoden zijn niet vereist, alleen de elutietijd moet worden bepaald.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

1.5.1. Herhaalbaarheid

Om de nauwkeurigheid van de verdelingscoëfficiënt te garanderen moeten duplo-metingen worden verricht onder drie uiteenlopende testomstandigheden; hierbij kan zowel de hoeveelheid stof als de verhouding van de hoeveelheden oplosmiddel worden gevarieerd. De gevonden waarden van de verdelingscoëfficiënt moeten, uitgedrukt in gewone logaritmen, binnen een interval van ± 0,3 log-eenheden vallen.

Om de betrouwbaarheid van de meting te vergroten moeten duplo-metingen worden verricht. De log P-waarden, afgeleid uit de individuele metingen, moeten binnen een bereik van ± 0,1 log-eenheid liggen.

1.5.2. Gevoeligheid

Het meetbereik van de methode wordt bepaald door de detectiegrens van de analysemethode. Deze moet voldoende laag zijn om log Pow-waarden in het bereik van – 2 tot 4 te kunnen bepalen (onder speciale voorwaarden kan dit bereik uitgebreid worden tot een log Pow van 5), wanneer de concentratie van de opgeloste stof in geen van beide fasen hoger is dan 0,01 mol per liter.

Met de HPLC-methode kunnen verdelingscoëfficiënten worden bepaald in het log Pow-bereik van 0 tot 6.

Normaal gezien kan de verdelingscoëfficiënt van een mengsel worden geschat tot op ± 1 log-eenheid van de schudfleswaarde. Voorbeelden van correlaties kunnen worden teruggevonden in de literatuur (4, 5, 6, 7, 8). Grotere nauwkeurigheid kan meestal worden bereikt met behulp van correlatiekrommen gebaseerd op referentiemengsels met verwante structuur (9).

1.5.3. Specificiteit

De verdelingswet van Nernst geldt alleen voor verdunde oplossingen bij constante temperatuur, druk en pH. De wet geldt bovendien voor een zuivere stof die wordt verdeeld tussen twee zuivere oplosmiddelen. Indien in één of beide fasen tegelijkertijd verschillende opgeloste stoffen voorkomen, dan kan dit van invloed zijn op de resultaten.

Dissociatie of associatie van de opgeloste moleculen leidt tot afwijkingen van de verdelingswet van Nernst. Dergelijke afwijkingen blijken uit de concentratieafhankelijkheid van de verdelingscoëfficiënt.

Wegens het voorkomen van meervoudige evenwichtstoestanden mag deze test niet zonder correcties worden toegepast op ioniseerbare stoffen. Voor dergelijke stoffen dient het gebruik van bufferoplossingen in plaats van water te worden overwogen; de pH van de buffer dient ten minste 1 pH-eenheid te verschillen van de pKa van de stof en men dient rekening te houden met het belang van deze pH met betrekking tot het milieu.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.1. Inleidende schatting van de verdelingscoëfficiënt

De verdelingscoëfficiënt wordt bij voorkeur geschat aan de hand van een berekeningsmethode (zie aanhangsel 1) of, indien van toepassing, op basis van de oplosbaarheidsverhouding van de te onderzoeken stof in de zuivere oplosmiddelen (10).

1.6.2. Schudflesmethode

1.6.2.1. Voorbereiding

n-Octanol: de verdelingscoëfficiënt moet worden bepaald met analytisch zuiver oplosmiddel.

Water: er moet gebruik worden gemaakt van gedestilleerd of dubbel gedestilleerd water uit apparatuur van glas of kwarts. Voor ioniseerbare verbindingen dienen zo nodig bufferoplossingen in plaats van water te worden gebruikt.

Opmerking:

Er mag geen gebruik worden gemaakt van water dat rechtstreeks uit een ionenwisselaar komt.

1.6.2.1.1. Voorverzadiging van de oplosmiddelen

Alvorens een verdelingscoëfficiënt te bepalen, worden de fasen van het oplosmiddelsysteem onderling verzadigd door uitschudden bij de temperatuur van het experiment. Hiertoe is het handig om gedurende 24 uur twee grote voorraadflessen met analytisch zeer zuiver n-octanol, respectievelijk water, waaraan voldoende water respectievelijk n-octanol is toegevoegd, mechanisch te schudden en daarna te laten staan totdat de fasen zich afscheiden en een verzadigingstoestand is ontstaan.

1.6.2.1.2. Voorbereiding van de test

Het twee-fasensysteem moet het testvat bijna vullen. Aldus wordt vervluchtiging van de vloeistof voorkomen. De volumeverhouding en de benodigde hoeveelheid van de te onderzoeken stof worden bepaald door:

—de inleidende bepaling van de verdelingscoëfficiënt (zie 1.6.1);

—de minimale hoeveelheid van de te onderzoeken stof vereist voor de analyse;

—de beperking van de maximale concentratie in beide fasen tot 0,01 mol/l.

Er worden drie tests uitgevoerd: in de eerste test wordt gewerkt met de berekende volumeverhouding n-octanol/water; in de tweede test wordt deze verhouding gedeeld door twee, in de derde test wordt deze verhouding vermenigvuldigd met twee (bijvoorbeeld 1:1, 1:2, 2:1).

1.6.2.1.3. De te onderzoeken stof

Er wordt een voorraadoplossing bereid uit n-octanol voorverzadigd met water. De concentratie van deze voorraadoplossing moet nauwkeurig worden bepaald voor gebruik bij de bepaling van de verdelingscoëfficiënt. Deze oplossing moet onder stabiele omstandigheden bewaard worden.

1.6.2.2. Testomstandigheden

De testtemperatuur moet constant (± 1 oC) worden gehouden binnen een bereik van 20-25 oC.

1.6.2.3. Meetprocedure

1.6.2.3.1. Instelling van het verdelingsevenwicht

Voor de verschillende testomstandigheden moeten steeds twee testvaten worden gevuld met de vereiste, nauwkeurig bekende hoeveelheden van beide oplosmiddelen en de gewenste hoeveelheid voorraadoplossing.

Het volume van de n-octanol-fasen moet worden gemeten. De testvaten moeten in een schudmachine worden geplaatst of met de hand worden geschud. Aanbevolen wordt om, bij gebruik van een centrifugebuis, deze snel 180o te draaien om de transversale as, zodat de ingesloten lucht door de beide fasen omhoog beweegt. De ervaring heeft geleerd dat 50 van dergelijke bewegingen gewoonlijk voldoende zijn om het verdelingsevenwicht te bereiken. Om zeker te zijn wordt aangeraden om 100 bewegingen uit te voeren in 5 minuten.

1.6.2.3.2. Scheiding van de fasen

Indien noodzakelijk, moet het mengsel worden gecentrifugeerd om de fasen te scheiden. Dit moet worden gedaan in een laboratoriumcentrifuge bij kamertemperatuur; indien een centrifuge zonder temperatuurregeling wordt gebruikt, moeten de centrifugebuizen ten minste gedurende één uur op de testtemperatuur worden gehouden, zodat de evenwichtstoestand zich kan instellen voordat de analyse wordt uitgevoerd.

1.6.2.4. Analyse

Voor bepaling van de verdelingscoëfficiënt moet de concentratie van de te onderzoeken stof in beide fasen worden bepaald. Dit kan worden gedaan door onder de verschillende testomstandigheden uit alle buizen een monster van iedere fase te nemen en dit volgens de gekozen procedure te analyseren. De totale hoeveelheid van de te onderzoeken stof in beide fasen wordt berekend en vergeleken met de oorspronkelijke hoeveelheid toegevoegde stof.

Van de waterfase moet een monster worden genomen volgens een procedure waardoor zo min mogelijk sporen n-octanol worden meegenomen: voor de bemonstering van de waterfase kan een glazen injectiespuit met verwisselbare naald worden gebruikt. De injectiespuit moet van tevoren gedeeltelijk worden gevuld met lucht. De lucht moet zachtjes worden uitgedreven terwijl de naald door de n-octanol-fase wordt gestoken. De benodigde hoeveelheid van de waterfase wordt in de injectiespuit gezogen. De spuit wordt snel uit de oplossing gehaald, waarna de naald wordt losgemaakt. De inhoud van de injectiespuit kan nu worden gebruikt als monster van de waterfase. De concentratie in de twee afzonderlijke fasen dient bij voorkeur te worden bepaald met behulp van een analysemethode waarmee verschillende stoffen kunnen worden onderscheiden. Enkele voorbeelden van geschikte analysenmethoden zijn:

—fotometrische methoden;

—gaschromatografie;

—hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC).

1.6.3. HPLC-methode

1.6.3.1. Voorbereiding

Benodigd is een vloeistofchromatograaf, uitgerust met een niet-pulserende pomp en een geschikte detectie-in-richting. Het gebruik van een injectieventiel met injectielussen wordt aangeraden. Aangezien de aanwezigheid van polaire groepen in de stationaire fase het juiste gedrag van de HPLC-kolom ernstig kan beïnvloeden, dient deze een zo klein mogelijk percentage polaire groepen te bevatten (11). Men kan gebruik maken van in de handel verkrijgbare, met microdeeltjes gevulde, omgekeerde fasepakkingen of van voorgepakte kolommen. Tussen het injectiesysteem en de analytische kolom kan een voorkolom worden geïnstalleerd.

Methanol en water, beide van HPLC-kwaliteit, worden gebruikt als elutiemiddel, dat voor gebruik wordt ontgast. Isokratische elutie dient te worden toegepast. Men moet methanol/water-verhoudingen met minimaal 25 % watergehalte gebruiken, normaliter neemt men een 3:1 (v/v) methanol/watermengsel om verbindingen met een log P van 6 binnen het uur te elueren, bij een stroomsnelheid van 1 ml/minuut. Voor verbindingen met een hoge log P kan het noodzakelijk zijn om de elutietijd te verkorten (evenals voor de referentiestoffen) door de polariteit van de mobiele fase of de kolomlengte te verminderen.

Stoffen met een zeer lage oplosbaarheid in n-octanol geven met de HPLC-methode veelal abnormaal lage log Pow-waarden; de pieken van dergelijke stoffen vallen soms samen met het oplosmiddelfront. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat het verdelingsproces te traag verloopt om het evenwicht te bereiken binnen de tijdsduur die normaal voor een HPLC-scheiding nodig is. Het kan dan nuttig zijn om de stroomsnelheid en/of de methanol/water-verhouding te verlagen ten einde een betrouwbare waarde te verkrijgen.

Test- en referentiestoffen moeten in voldoende concentratie oplosbaar zijn in de mobiele fase om detectie mogelijk te maken. Alleen in uitzonderingsgevallen mogen additieven in het methanol/water-mengsel worden gebruikt, daar toevoegingen de eigenschappen van de kolom veranderen. Voor chromatogrammen met additieven is het verplicht een aparte kolom van hetzelfde type te gebruiken. Als methanol/water niet voldoet, mogen andere organisch-oplosmiddel/water-mengsels worden gebruikt, bijvoorbeeld ethanol/water of acetonitril/water.

De pH van het eluent is kritisch voor ioniseerbare stoffen. Hij moet in het juiste pH-bereik van de kolom liggen, gewoonlijk tussen 2 en 8. Bufferen wordt aangeraden. Voorzichtigheid dient in acht te worden genomen om neerslag van zout en achteruitgang van de kolom te voorkomen, hetgeen optreedt met sommige organische fase/buffer-mengsels. HPLC-metingen met stationaire fasen op basis van silica boven pH 8 worden afgeraden omdat het gebruik van een alkalische mobiele fase kan leiden rot een snelle achteruitgang van de kolomeigenschappen.

De referentiestoffen dienen zo zuiver mogelijk te zijn. Verbindingen voor test- of ijkdoeleinden worden, indien mogelijk, opgelost in de mobiele fase.

De temperatuur gedurende de metingen mag niet meer variëren dan ± 2 K.

1.6.3.2. Meting

De dode tijd t0 kan bepaald worden met of wel een homologe serie (bijvoorbeeld n-alkylmethylketonen) of wel organische stoffen die niet worden tegengehouden (bijvoorbeeld thioureum of formamide). Ter berekening van de dode tijd t0 met een homologe serie moet een set van ten minste 7 stoffen uit dezelfde serie worden geïnjecteerd en moeten de respectieve retentietijden worden bepaald. De ruwe retentietijden tr(nc + 1) worden uitgezet als functie van tr(nc), en het snijpunt a en de helling b van de regressievergelijking:

tr(nc + 1) = a + btr (nc)

worden bepaald (nc = aantal koolstofatomen). De dode tijd t0 wordt dan gegeven door:

t0 = a/(1 - b)

De volgende stap bestaat uit het construeren van een correlatiekromme van log k-waarden tegen log P voor geschikte referentiestoffen. In de praktijk wordt een set van 5 tot 10 standaard-referentiestoffen, met een log P-waarde rond het te verwachten bereik, tegelijkertijd geïnjecteerd en worden de retentietijden bepaald, bij voorkeur met een recorder/integrator die is verbonden met het detectiesysteem. De corresponderende logaritmen van de capaciteitsfactoren, log k, worden berekend en uitgezet als functie van log P, bepaald met de schudflesmethode. De ijking wordt uitgevoerd met regelmatige tussenpozen, minstens eenmaal per dag, zodat rekening kan worden gehouden met mogelijke veranderingen in het gedrag van de kolom.

De teststof wordt in een zo klein mogelijke hoeveelheid van de mobiele fase geïnjecteerd. De retentietijd wordt bepaald (in duplo), om zo de capaciteitsfactor k te kunnen berekenen. Uit de correlatiegrafiek van de ijkstoffen kan de verdelingscoëfficiënt van de teststof worden geïnterpoleerd. Voor zeer lage en zeer hoge verdelingscoëfficiënten is extrapolatie noodzakelijk. In deze gevallen dient men extra aandacht te besteden aan de betrouwbaarheidsgrenzen van de regressielijn.

2. GEGEVENS

Schudflesmethode

De betrouwbaarheid van de gevonden waarden voor P kan worden onderzocht door de gemiddelden van de duplo-bepalingen te vergelijken met het totale gemiddelde.

3. RAPPORTAGE

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen);

—indien de methoden niet toepasbaar zijn (bijvoorbeeld oppervlakteactieve stoffen), dient een berekende waarde of een schatting gebaseerd op de individuele oplosbaarheid in n-octanol en water te worden opgegeven;

—alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof.

Voor de schudflesmethode:

—het resultaat van de inleidende schatting, indien van toepassing;

—testtemperatuur;

—gegevens over de analytische procedures voor bepaling van de concentraties;

—tijd en snelheid van centrifugeren, indien van toepassing;

—de gemeten concentraties in beide fasen voor elke bepaling (dit betekent dat in totaal 12 concentraties worden vermeld);

—het gewicht van de onderzochte stof, het volume van elke fase in elk testvat en de berekende totale hoeveelheid van de onderzochte stof in elke fase bij evenwicht;

—de berekende waarden van de verdelingscoëfficiënt (P) en het gemiddelde voor iedere groep testomstandigheden, evenals het gemiddelde van alle metingen; indien er aanwijzingen zijn dat de verdelingscoëfficiënt afhankelijk is van de concentratie, dient dit te worden vermeld in het testrapport;

—de standaardafwijking van de afzonderlijke P-waarden ten opzichte van het gemiddelde;

—de logaritme (grondtal 10) van de P-waarde gemiddeld over alle metingen;

—de theoretisch berekende waarde van Pow, wanneer deze is bepaald of wanneer de gemeten waarde groter is dan 104;

—pH van het gebruikte water en van de waterfase tijdens het experiment;

—indien bufferoplossingen worden gebruikt, de redenen voor het gebruik van bufferoplossingen in plaats van water, samenstelling, concentratie en pH van de bufferoplossingen, pH van de waterige fase vóór en na het experiment.

Voor de HPLC-methode:

—het resultaat van de inleidende schatting, indien van toepassing;

—test- en referentiestoffen, en de zuiverheid;

—testtemperatuur;

—de pH waarbij de bepaling wordt uitgevoerd;

—details van de analytische en de voorkolom, de mobiele fase en de detectiemethode;

—retentiegegevens en log P-waarden uit de literatuur voor de bij de ijking gebruikte referentiestoffen;

—details van de gevonden regressielijn (log k tegen log P);

—gemiddelde retentiegegevens en de geïnterpoleerde log P-waarde voor de teststof;

—beschrijving van de apparatuur en de werkomstandigheden;

—elutieprofielen;

—de hoeveelheden test- en referentiestoffen die in de kolom zijn gebracht;

—dode tijd en hoe hij gemeten werd.

4. LITERATUUR

(1)OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107 — Decision of the Council C(81) 30 Final.

(2)C. Hansch en A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(3)Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir.) — Available from Pomona College Medicina! Chemistry Project, 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.

(4)L. Renberg, G. Sundström en K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683.

(5)H. Ellgehausen, C. D'Hondt en R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219.

(6)B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.

(7)W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.

(8)J.E. Haky en A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675.

(9)S. Fujisawa en E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787.

(10)O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumspraxis (edited by E. Müller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1958), Band I/1, 223-339.

(11)R.F. Rekker en H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479.

(12)A. Leo, C. Hansch en D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

(13)R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977.

(14)NF T 20-043 (AFNOR) (Sept. 1985). Chemical products for industrial use — Determination of partition coefficient — Flask shaking method.

(15)CV. Eadsforth en P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1 459.

(16)A. Leo, C. Hansch en D. Elkins, Chem. Rev, 1971, vol. 71, 525.

(17)C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani en E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1 207.

(18)W.B. Neely, D.R. Branson en G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1 113.

(19)D.S. Brown en E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382.

(20)J.K. Seydel en K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979.

(21)R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984.

(22)Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel, 1978.

(23)N.S. Nirrlees, S.j. Noulton, C.T. Murphy en P.J. Taylor, j. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.

Aanhangsel 1

Berekenings-/schattingsmethoden

INLEIDING

Een algemene inleiding tot berekeningsmethoden, gegevens en voorbeelden worden gegeven in het „Handbook of Chemical Property Estimation Methods” (a).

Berekende waarden voor Pow kunnen worden gebruikt:

—om te beslissen welke van de experimentele methoden het meest geschikt is (schudflesbereik: log Pow: – 2 tot 4, HPLC-bereik: log Pow: 0 tot 6);

—om de geschikte testvoorwaarden te kunnen kiezen (bijvoorbeeld referentiestoffen voor de HPLC-methode, n-octanol/water-volumeverhoudingen voor de schudflesmethode);

—ter controle voor het laboratorium zelf van eventuele fouten in het experiment;

—om een Pow-schatting te leveren in die gevallen waar de experimentele methoden om technische redenen niet kunnen worden toegepast.

SCHATTINGSMETHODE

Inleidende schatting van de verdelingscoëfficiënt

De waarde van de verdelingscoëfficiënt kan geschat worden met behulp van de oplosbaarheid van de teststof in zuivere oplosmiddelen. Hiervoor geldt:

image

BEREKENINGSMETHODEN

Principe van de berekeningsmethoden

Alle berekeningsmethoden zijn gebaseerd op de formele fragmentatie van het molecuul in geschikte substructuren, waarvoor betrouwbare log Pow-fragmentconstanten bekend zijn. De log Pow van het volledige molecuul wordt dan berekend als de som van de afzonderlijke waarden van de overeenkomstige fragmenten, plus de som van de correctietermen voor intramoleculaire wisselwerkingen.

Lijsten van fragmentconstanten en correctietermen zijn te vinden in de literatuur (b)(c)(d)(e). Sommige hiervan worden regelmatig bijgewerkt (b).

Kwaliteitscriteria

Over het algemeen vermindert de betrouwbaarheid van een berekeningsmethode met het toenemen van de complexiteit van de onderzochte stof. Voor eenvoudige moleculen met laag molecuulgewicht en slechts één of twee functionele groepen kan een afwijking van 0,1 tot 0,3 log Pow-eenheden worden verwacht tussen de resultaten van de verschillende fragmentatiemethoden en de gemeten waarde. Voor meer complexe moleculen kan de fout groter zijn. Dit is afhankelijk van de betrouwbaarheid en beschikbaarheid van fragmentconstanten, alsmede van het vermogen om intramoleculaire wisselwerkingen (bijvoorbeeld waterstofbruggen) te herkennen en het juiste gebruik van de correctietermen (minder problematisch met de computersoftware CLOGP-3) (b). In geval van ioniserende verbindingen is het belangrijk de lading of de mate van ionisatie juist in te schatten.

Berekeningsprocedures

De oorspronkelijke hydrofobesubstitutieconstante π, geïntroduceerd door Fujita et al. (f), wordt gedefinieerd als:

πx = log Pow (PhX) - log Pow (PhH)

waarin Pow (PhX) de verdelingscoëfficiënt van een aromatisch derivaat is, en Pow (PhH) die van de oorspronkelijke verbinding,

(bijvoorbeeld πCI = log Pow (C6H5C1) - log Pow (C6H6) = 2,84 - 2,13 = 0,71).

Volgens zijn definitie is de Л-methode voornamelijk toepasbaar op aromatische substitutie. De Л-waarden van een groot aantal substitutiegroepen zijn in tabellen terug te vinden (b)(c)(d). Deze worden gebruikt voor de berekening van log Pow van aromatische moleculen of substructuren.

Volgens Rekker (g) wordt de log Pow-waarde als volgt berekend:

image

waarin fi de moleculaire fragmentconstante voorstelt en ai de frequentie van het voorkomen ervan in het onderzochte molecuul. De correctietermen kunnen worden uitgedrukt als een integraal veelvoud van eén enkele constante cm (de zogenaamde „magische” constante). De fragmentconstanten fi en cm werden bepaald uit een lijst van 1 054 experimentele Pow waarden (825 stoffen) met behulp van meervoudige regressieanalyse (c)(h). De bepaling van de interactietermen wordt uitgevoerd volgens vaste regels beschreven in de literatuur (e)(h)(i).

Volgens Hansch en Leo (c) wordt de log Pow-waarde berekend uit:

image

waarin fi de moleculaire fragmentconstante voorstelt, Fj de correctietermen en ai en bj het overeenkomstige aantal keren dat ze voorkomen. Afgeleid uit experimentele Pow-waarden werd door „trial and error” een lijst gemaakt van atoom- en groepsfragmentwaarden evenals een lijst van correctietermen Fj (de zogenaamde „factoren”). De correctietermen zijn geclassificeerd in verschillende categorieën (a)(c). Omdat het vrij ingewikkeld en tijdrovend is rekening te houden met alle regels en correctietermen, werden softwarepakketten ontwikkeld (b).

De berekening van log Pow van complexe moleculen kan aanzienlijk verbeterd worden, indien het molecuul wordt opgesplitst in grotere substructuren waarvoor betrouwbare log Pow-waarden beschikbaar zijn, hetzij uit tabellen (b)(c) of uit eigen metingen. Zulke fragmenten (bijvoorbeeld heterocyclische structuren, antrachinon, azobenzeen) kunnen dan worden gecombineerd met de Л-waarden volgens Hansch of met de fragmentconstanten volgens Rekker of Leo.

Opmerkingen

i)De berekeningsmethoden kunnen slechts worden toegepast op gedeeltelijk of volledig geïoniseerde stoffen wanneer de mogelijkheid bestaat om de nodige correctiefactoren in de berekening te verwerken.

ii)Als het bestaan van intramoleculaire waterstofbruggen kan worden aangenomen, moeten de overeenkomstige correctietermen (ongeveer + 0,6 tot + 1,0 log Pow-eenheden) bij het resultaat worden opgeteld (a). Aanwijzingen voor de aanwezigheid van waterstofbruggen kunnen worden verkregen uit ruimtelijke modellen of spectroscopische gegevens over het molecuul.

iii)Als verschillende tautomere vormen mogelijk zijn, dient de meest waarschijnlijke vorm gebruikt te worden voor de berekening.

iv)De herzieningen van lijsten met fragmentconstanten dienen zorgvuldig gevolgd te worden.

Rapport

Bij het gebruik van berekenings-/schattingsmethoden dient het testrapport zo mogelijk de volgende gegevens te bevatten:

—beschrijving van de stof (mengsel, verontreinigingen, enz.);

—aanwijzingen over mogelijke intramoleculaire waterstofbruggen, dissociatie, lading en alle andere ongewone effecten (bijvoorbeeld tautomerie);

—beschrijving van de berekeningsmethode;

—identificatie of leverancier van de database;

—bijzonderheden in de keuze van de fragmenten;

—uitgebreide documentatie van de berekening.

LITERATUUR

(a)W.J. Lyman, W.F. Reehl en D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

(b)Pomona College, Medicinal Chemistry Project. Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(c)C. Hansch en A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(d)A. Leo, C. Hansch en D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

(e)R.F. Rekker en H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther., 1979, vol. 14, 479.

(f)T. Fujita, J. Iwasa en C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc, 1964, vol. 86, 5175.

(g)R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, vol. 1, Elsevier, New York, 1977.

(h)C.V. Eadsforth en P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.

(i)R.A. Scherrer, ACS — American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, 225.

Aanhangsel 2

Aanbevolen referentiestoffen voor de HPLC-methode



Nr.

Referentiestof

log Pow

pKa

1

2-Butanon

0,3

2

4-Acetylpyridine

0,5

3

Aniline

0,9

4

Aceetanilide

1,0

5

Benzylalcohol

1,1

6

p-Methoxyfenol

1,3

pKa = 10,26

7

Fenoxyazijnzuur

1,4

pKa = 3,12

8

Fenol

1,5

pKa = 9,92

9

2,4-Dinitrofenol

1,5

pKa = 3,96

10

Benzonitril

1,6

11

Fenylacetonitril

1,6

12

4-Methylbenzylalcohol

1,6

13

Acetofenon

1,7

14

2-Nitrofenol

1,8

pKa = 7,17

15

3-Nitrobenzoëzuur

1,8

pKa = 3,47

16

4-Chlooraniline

1,8

pKa = 4,15

17

Nirrobenzeen

1,9

18

Cinnamylalcohol

1,9

19

Benzoëzuur

1,9

pKa = 4,19

20

p-Kresol

1,9

pKa = 10,17

21

Kaneelzuur

2,1

pKa = 3,89 cis 4,44 trans

22

Anisool

2,1

23

Methylbenzoaat

2,1

24

Benzeen

2,1

25

3-Methylbenzoëzuur

2,4

pKa = 4,27

26

4-Chloorfenol

2,4

pKa = 9,1

27

Trichloorethyleen

2,4

28

Atrazine

2,6

29

Ethylbenzoaat

2,6

30

2,6-Dichloorbenzonitril

2,6

31

3-Chloorbenzoëzuur

2,7

pKa = 3,82

32

Tolueen

2,7

33

1-Naftol

2,7

pKa = 9,34

34

2,3-Dichlooraniline

2,8

35

Chloorbenzeen

2,8

36

Allylfenylether

2,9

37

Broombenzeen

3,0

38

Ethylbenzeen

3,2

39

Benzofenon

3,2

40

p-Fenylfenol

3,2

pKa = 9,54

41

Thymol

3,3

42

1,4-Dichloorbenzeen

3,4

43

Difenylamine

3,4

pKa = 0,79

44

Naftaleen

3,6

45

Fenylbenzoaat

3,6

46

Isopropylbenzeen

3,7

47

2,4,6-Trichloorfenol

3,7

pKa = 6

48

Bifenyl

4,0

49

Benzylbenzoaat

4,0

50

2,4-Dinitro-6-sec-butylfenol

4,1

51

1,2,4-Trichloorbenzeen

4,2

52

Dodecaancarbonzuur

4,2

53

Difenylether

4,2

54

n-Burylbenzeen

4,5

55

Fenanthreen

4,5

56

Fluorantheen

4,7

57

Dibenzyl

4,8

58

2,6-Difenylpyridine

4,9

59

Trifenylamine

5,7

60

DDT

6,2

Andere referentiestoffen met lage log Pow

1

Nicotinezuur

- 0,07

A.9. VLAMPUNT

1. METHODE

1.1. INLEIDING

Alvorens de test uit te voeren is het nuttig te beschikken over oriënterende gegevens inzake de brandbaarheid van de stof. De testprocedure is van toepassing op vloeistoffen waarvan de dampen door een ontstekingsbron tot ontbranding kunnen worden gebracht. De hier beschreven testmethoden zijn alleen betrouwbaar indien de gemeten waarde van het vlampunt binnen een bereik ligt zoals in de afzonderlijke methoden is aangegeven.

Bij het selecteren van de te gebruiken methode dient rekening te worden gehouden met mogelijke chemische reacties tussen de teststof en het monstervat.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN

Het vlampunt is de laagste temperatuur, gecorrigeerd tot een druk van 101,325 kPa, waarbij een vloeistof onder de beschreven omstandigheden zodanig verdampt, dat in het testvat een brandbaar mengsel van lucht en damp wordt gevormd.

Eenheden: oC

t = T - 273,15

(t in oC en T in K).

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof referentiestoffen te gebruiken. Referentiestoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om regelmatig de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methoden mogelijk te maken.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

De stof wordt in een testvat gebracht en verwarmd of gekoeld tot de testtemperatuur volgens de procedure beschreven bij de afzonderlijke testmethode. Ontstekingspogingen worden uitgevoerd om te zien of het monster al dan niet tot ontbranding kan worden gebracht bij de testtemperatuur.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

1.5.1. Reproduceerbaarheid

De reproduceerbaarheid varieert met de gemeten waarde van het vlampunt en met de gebruikte testmethode; maximaal 2 oC.

1.5.2. Gevoeligheid

De gevoeligheid is afhankelijk van de gebruikte testmethode.

1.5.3. Toepasbaarheid

De toepasbaarheid van een aantal testmethoden blijft beperkt tot bepaalde vlampuntsbereiken en afhankelijk van stofeigenschappen (bijvoorbeeld hoge viscositeit).

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.1. Voorbereidingen

Een monster van de te onderzoeken stof wordt in een testapparaat overeenkomstig 1.6.3.1, respectievelijk 1.6.3.2, gebracht.

Uit veiligheidsoverwegingen wordt aangeraden voor energetische of giftige stoffen een methode waarbij slechts een klein monstervolume (circa 2 cm3) nodig is, toe te passen.

1.6.2. Testomstandigheden

Het apparaat dient, voor zover de veiligheid dit toelaat, op een tochtvrije plaats te worden opgesteld.

1.6.3. Uitvoering van de test

1.6.3.1. Evenwichtsmethode

Zie ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523 en ISO 3679.

1.6.3.2. Niet-evenwichtsmethode

Zie BS 2000-170, NF M 07-011 en NF T 66-009.

Zie EN 57, DIN 51755, deel 1 (voor temperaturen van 5 tot 65 oC) DIN 51755, deel 2 (voor temperaturen lager dan 5 oC), NF M 07-036.

Zie ASTM D 56.

Zie ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34 en NF M 07-019.

Indien het vlampunt, bepaald volgens een van de niet-evenwichtsmethoden onder 1.6.3.2, de volgende waarden blijkt te hebben: 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC, 55 ± 2 oC, dient dit te worden bevestigd volgens een evenwichtsmethode met gebruik van dezelfde apparatuur.

Alleen de methoden waarmee de temperatuur van het vlampunt kan worden bepaald, komen in aanmerking voor gebruik ten behoeve van een kennisgeving.

Voor de bepaling van het vlampunt van visceuze vloeistoffen (verven, lijmen, e.d.) die oplosmiddelen bevatten, mag uitsluitend gebruik worden gemaakt van apparatuur en testmethoden die geschikt zijn voor bepaling van het vlampunt van visceuze vloeistoffen.

Zie ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523 en DIN 53213, deel 1.

2.GEGEVENS

3. RAPPORTAGE

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—nauwkeurige beschrijving van de stof (beschrijving en verontreinigingen);

—de gebruikte testmethode alsmede eventuele wijzigingen;

—de resultaten en alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten.

4. LITERATUUR

Geen.

A.10. ONTVLAMBAARHEID (VASTE STOFFEN)

1. METHODE

1.1. INLEIDING

Alvorens de test uit te voeren is het nuttig te beschikken over oriënterende gegevens inzake potentieel explosieve eigenschappen van de stof.

Deze test dient alleen te worden toegepast op stoffen in poeder-, korrel- of pastavorm.

Alleen stoffen waarvan de brandsnelheid hoger is dan een bepaalde drempelwaarde, worden als licht ontvlambaar beschouwd. Daarom worden niet alle stoffen die kunnen worden ontstoken, maar alleen die stoffen die snel branden of waarvan het brandgedrag buitengewoon gevaarlijk is, inbegrepen.

Het is buitengewoon gevaarlijk indien een smeulproces zich voortplant door een metaalpoeder, vanwege de moeilijkheid om het vuur te doven. Daarom dienen metaalpoeders als licht ontvlambaar te worden beschouwd, als de smeulhaard zich binnen een zekere tijd door de gehele massa kan voortplanten.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN

Brandtijd in seconden.

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Niet gekozen.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

Van de stof wordt een ononderbroken rups of poederlijn met een lengte van ongeveer 250 mm gevormd waarop een oriënterende proef wordt uitgevoerd om te bepalen of, na ontsteken van het monster met behulp van een gasvlam, de vlam of het smeulproces zich voortplant. Als het vlamfront/smeulproces zich binnen een bepaalde tijdsduur over 200 mm van de sliert voortplant, dient een volledig testprogramma te worden uitgevoerd om de brandsnelheid vast te stellen.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

Niet gegeven.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.1. Oriënterende proef

Van de stof wordt een ononderbroken rups of poederlijn van ongeveer 250 mm lengte, 20 mm breedte en 10 mm hoogte gevormd op een onbrandbare, niet-poreuze en slecht warmtegeleidende grondplaat. Een hete vlam van een gasbrander (minimale diameter 5 mm) wordt gedurende maximaal 2 minuten bij één uiteinde van de rups gehouden totdat het poeder ontbrandt (5 minuten voor metaalpoeders of metaallegeringen). Men dient er op te letten of de ontbranding zich binnen 4 minuten (of 40 minuten bij metaalpoeders) voortplant over 200 mm van de poederrups. Indien de stof niet ontbrandt of indien de vlam of het smeulproces zich niet binnen 4 minuten (of 40 minuten bij metaalpoeders) voortplant over 200 mm poederrups dient de stof niet als licht ontvlambaar te worden beschouwd en behoeft geen verder onderzoek te worden uitgevoerd. Als het brandproces zich in minder dan 4 minuten, of minder dan 40 minuten bij metaalpoeders, voortplant over 200 mm van de poederrups dient de procedure zoals hieronder beschreven (punt 1.6.2. en volgende) te worden uitgevoerd.

1.6.2. Brandsnelheidstest

1.6.2.1. Voorbereidingen

Poeder of korrelvormige stoffen worden ingebracht (niet aandrukken) in een mal met een lengte van 250 mm en een driehoekige doorsnede met een inwendige hoogte van 10 mm en een inwendige breedte van 20 mm. Om de zijkanten te begrenzen zijn aan beide kanten van de mal in de lengterichting twee metalen platen gemonteerd die 2 mm uitsteken boven de rand van de driehoekige doorsnede (zie figuur). Vervolgens laat men de mal driemaal van een hoogte van 2 cm op een massief oppervlak vallen. Indien nodig wordt de mal bijgevuld. Vervolgens worden de zijplaten verwijderd en wordt de overtollige stof met een stevig blad weggeveegd. Een onbrandbare, niet-poreuze en slecht warmtegeleidende plaat wordt bovenop de mal gelegd, het apparaat wordt omgekeerd, waarna de mal wordt verwijderd.

Pastavormige stoffen worden op een onbrandbare, niet-poreuze en slecht warmtegeleidende plaat aangebracht in de vorm van een rups met een lengte van 250 mm en een doorsnede van ongeveer 1 cm2.

1.6.2.2. Testomstandigheden

Bij een vochtgevoelige stof dient de test zo snel als mogelijk na het verwijderen van de verpakking te worden uitgevoerd.

1.6.2.3. Uitvoering van de test

De rups wordt in een zuurkast geplaatst in een richting loodrecht op de richting van de trek.

De luchtsnelheid moet voldoende zijn om te verhinderen dat verbrandingsgassen naar de laboratoriumruimte ontsnappen; de luchtsnelheid mag gedurende de test niet veranderd worden. De apparatuur moet worden omgeven door een vochtscherm.

Met de hete vlam van een gasbrander (minimale diameter 5 mm) wordt de rups aan één kant ontstoken. Nadat de rups over een lengte van 80 mm heeft gebrand, wordt de brandsnelheid over de volgende 100 mm gemeten.

De test, waarbij steeds een schone koude plaat wordt gebruikt, wordt zesmaal uitgevoerd, tenzij eerder een positief resultaat wordt verkregen.

2. GEGEVENS

Voor de beoordeling zijn de brandduur in de oriënterende proef (1.6.1) en de kortste brandduur uit de hoogstens zes testen (1.6.2.3) van belang.

3. RAPPORTAGE

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—een nauwkeurige specificatie van de stof (beschrijving en verontreinigingen);

—een beschrijving van de fysische toestand en het vochtgehalte van de onderzochte stof;

—de resultaten van de oriënterende test en, indien uitgevoerd, de brandsnelheidstest;

—alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten.

3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN

Poedervormige, korrelvormige of pastavormige stoffen worden als licht ontvlambaar beschouwd indien in één van de tests uitgevoerd volgens 1.6.2 de brandduur minder dan 45 seconden bedraagt. Poeders van metalen of metaallegeringen worden als licht ontvlambaar beschouwd, indien zij kunnen worden ontstoken en indien de vlam of reactiezone zich binnen 10 minuten over het gehele monster uitbreidt.

4. LITERATUUR

(1) NF T 20-042, (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

Aanhangsel

Figuur

Mal en toebehoren om een rups van de te onderzoeken stof te vormen

(Afmetingen in mm)

image

A.11. ONTVLAMBAARHEID (GASSEN)

1. METHODE

1.1. INLEIDING

Met deze methode kan worden vastgesteld of mengsels van gassen en lucht bij kamertemperatuur (ongeveer 20 oC) en atmosferische druk brandbaar zijn, en zo ja, binnen welk concentratiebereik. Mengsels met toenemende concentraties van het te onderzoeken gas in lucht worden blootgesteld aan een elektrische vonk, waarna wordt vastgesteld of ontbranding plaatsvindt.

1.2. DEFINITIE EN EENHEDEN

De maat voor de brandbaarheid is het bereik van de concentratiewaarden tussen de onderste en bovenste ontploffingsgrens. De onder- en bovenexplosiegrenzen worden gevormd door de uiterste concentraties van het brandbare gas in lucht waarbij een vlam zich niet voortplant.

1.3. REFERENTIESTOF

Niet gegeven.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

De concentratie van het gas in de lucht wordt stap voor stap opgevoerd, waarbij het mengsel in iedere stap wordt blootgesteld aan een elektrische vonk.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

Niet gegeven.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.1. Apparatuur

Het testvat is een staande glazen cilinder met een inwendige diameter van minimaal 50 mm en een hoogte van minimaal 300 mm. De ontstekingselektroden bevinden zich op een onderlinge afstand van 3 tot 5 mm en worden 60 mm boven de cilinderbodem geplaatst. De cilinder is voorzien van een overdrukventiel. Het apparaat moet worden afgeschermd om schade bij een eventuele ontploffing te beperken.

Als ontstekingsbron wordt gebruik gemaakt van een staande inductievonk met een duur van 0,5 sec, opgewekt door een hoogspanningstransformator met een uitgangsspanning van 10 tot 15 kV (maximaal ingangsvermogen 300 W). Een voorbeeld van een geschikt apparaat wordt gegeven in referentie (2).

1.6.2. Testomstandigheden

De test moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20 oC).

1.6.3. Uitvoering van de test

Met behulp van doseerpompen wordt een bekende concentratie van het gas in lucht naar de glazen cilinder geleid. Het mengsel wordt blootgesteld aan een vonk en er wordt vastgesteld of er zich vanaf de ontstekingsbron al dan niet een vlam ontwikkelt die zich zelfstandig voortplant. De gasconcentratie wordt in stappen van 1 % vol opgevoerd, totdat ontbranding zoals boven bedoeld, plaatsvindt.

Als de chemische structuur van het gas erop wijst dat het niet ontvlambaar is en de samenstelling van het stoïchiometrische mengsel met lucht berekend kan worden, dienen alleen de mengsels in het bereik van 10 % beneden tot 10 % boven de stoïchiometrische samenstelling getest te worden in stappen van 1 %.

2. GEGEVENS

Het enige gegeven van belang voor bepaling van deze eigenschap is het optreden van een vlam die zich zelfstandig voortplant.

3. RAPPORTAGE

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—een nauwkeurige specificatie van de stof (beschrijving en verontreinigingen);

—een beschrijving van de gebruikte apparatuur inclusief de afmetingen;

—de temperatuur waarbij de test werd uitgevoerd;

—de onderzochte concentraties en de verkregen resultaten;

—het resultaat van de test: niet ontvlambaar of licht ontvlambaar gas. Indien geconcludeerd wordt dat het gas niet ontvlambaar is, moet het concentratiebereik waarover het gas in stappen van 1 % onderzocht werd, vermeld worden;

—alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten.

4. LITERATUUR

(1)NF T 20-041, (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.

(2)W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. Redeker en H. Schacke. Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech., 1984, vol. 56, 2, blz. 126-127.

A.12. ONTVLAMBAARHEID (CONTACT MET WATER)

1. METHODE

1.1. INLEIDING

Deze testmethode kan worden gebruikt om vast te stellen of de reactie van een stof met water of vochtige lucht leidt tot het vrijkomen van een gevaarlijke hoeveelheid van één of meer eventueel licht ontvlambare gassen.

De testmethode kan zowel op vaste als op vloeibare stoffen worden toegepast. Deze methode is niet van toepassing op stoffen die in aanraking met lucht spontaan ontbranden.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN

Licht ontvlambaar: Stoffen die bij aanraking met water of vochtige lucht licht ontvlambare gassen produceren met een minimum ontwikkelingshoeveelheid van 1 liter per kg stof per uur.

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

De stof wordt volgens de hieronder beschreven getrapte volgorde getest; als bij één van de stappen ontbranding optreedt, is verder onderzoek overbodig. Als bekend is dat de te onderzoeken stof niet heftig reageert met water kan worden verdergegaan met stap 4 (1.3.4).

1.3.1. Stap 1

De te onderzoeken stof wordt in een buis met gedistilleerd water op 20 oC gebracht en er wordt nagegaan of het vrijgekomen gas ontbrandt.

1.3.2. Stap 2

De te onderzoeken stof wordt gebracht op een filtreerpapier dat in een schotel met gedistilleerd water van 20 oC drijft, en er wordt nagegaan of het vrijkomende gas ontbrandt. Het filtreerpapier dient alleen om de stof op één plaats te houden, waardoor de kans op ontbranding toeneemt.

1.3.3. Stap 3

Van de te onderzoeken stof wordt een hoopje van ongeveer 2 cm hoog en 3 cm doorsnede gemaakt. Hierop worden een paar druppels water gebracht en er wordt nagegaan of het vrijkomende gas ontbrandt.

1.3.4. Stap 4

De te onderzoeken stof wordt met gedistilleerd water van 20 oC gemengd en de snelheid van gasontwikkeling wordt ieder uur gemeten gedurende een periode van 7 uur. Als de snelheid van de gasontwikkeling onregelmatig is of toeneemt tegen het eind van de periode van 7 uur, moet de duur van de meting tot maximaal 5 dagen worden verlengd. De test kan worden gestaakt zodra een snelheid hoger dan 1 liter/kg per uur wordt gemeten.

1.4. REFERENTIESTOF

Niet gegeven.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

Niet gegeven.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE METHODEN

1.6.1. Stap 1

1.6.1.1. Testomstandigheden

De proef wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20 oC).

1.6.1.2. Uitvoering van de test

Een kleine hoeveelheid (ongeveer 2 mm doorsnede) van de te onderzoeken stof wordt in een bak met gedistilleerd water gebracht. Genoteerd wordt i) of er gas ontwijkt en ii) of het gas spontaan ontbrandt. Indien ontbranding van het gas plaatsvindt, is verder onderzoek van de stof niet nodig, omdat de stof dan als gevaarlijk wordt beschouwd.

1.6.2. Stap 2

1.6.2.1. Apparatuur

Een filtreerpapier laat men plat op het oppervlak van een hoeveelheid gedistilleerd water drijven in een geschikt vat, bijvoorbeeld een verdampingsschotel met een doorsnede van 100 mm.

1.6.2.2. Testomstandigheden

De proef wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20 oC).

1.6.2.3. Uitvoering van de test

Een kleine hoeveelheid van de te onderzoeken stof (ongeveer 2 mm doorsnede) wordt midden op het filtreerpapier gebracht. Genoteerd wordt i) of er gas ontwijkt en ii) of het gas spontaan ontbrandt. Indien ontbranding van het gas plaatsvindt, is verder onderzoek van de stof niet nodig, omdat de stof dan als gevaarlijk wordt beschouwd.

1.6.3. Stap 3

1.6.3.1. Testomstandigheden

De proef wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20 oC).

1.6.3.2. Uitvoering van de test

Van de te onderzoeken stof wordt een hoopje van ongeveer 2 cm hoogte en 3 cm doorsnede gemaakt met een kuiltje bovenin. In het kuiltje worden een paar druppels water gebracht en genoteerd wordt i) of er gas ontwijkt en ii) of het gas spontaan ontbrandt. Indien ontbranding van het gas plaatsvindt, is verder onderzoek van de stof niet nodig, omdat de stof dan als gevaarlijk wordt beschouwd.

1.6.4. Stap 4

1.6.4.1. Apparatuur

De apparatuur wordt opgesteld als in de figuur.

1.6.4.2. Testomstandigheden

Kijk of het vat van de te onderzoeken stof poeder bevat bestaande uit deeltjes van minder dan 500 μm diameter. Indien meer dan 1 gewichtsprocent van de stof poedervormig is of indien het monster brokkelig is, wordt de stof in zijn geheel vóór de test tot poeder gemalen; op deze manier wordt rekening gehouden met mogelijke verkleining van de deeltjesgrootte tijdens opslag en verwerking van de stof. In alle andere gevallen wordt de stof onderzocht zoals ze werd verkregen. De test moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20 oC) en atmosferische druk.

1.6.4.3. Uitvoering van de test

10 tot 20 ml water wordt in de druppeltrechter van het apparaat gebracht en 10 g van de te onderzoeken stof wordt afgewogen in de erlenmeyerkolf. Het volume van het vrijkomende gas kan op elke geschikte wijze worden gemeten. De kraan van de druppeltrechter wordt geopend zodat het water in de erlenmeyerkolf komt, en een chronometer gestart. De hoeveelheid vrijkomend gas wordt ieder uur gemeten gedurende een periode van 7 uur. Als tijdens deze periode het vrijkomen van gas onregelmatig verloopt, of als aan het eind van de periode de hoeveelheid vrijkomend gas toeneemt moeten de metingen voortgezet worden tot maximaal 5 dagen. Indien de gasontwikkelingssnelheid, tijdens de metingen, op welk ogenblik dan ook, meer dan 1 liter per kg stof en per uur bedraagt, kan het onderzoek gestaakt worden. De test moet in triplo worden uitgevoerd.

Indien de chemische identiteit van het gas niet bekend is, dient het te worden geanalyseerd. Indien het gas licht ontvlambare componenten bevat en niet bekend is of het totale mengsel licht ontvlambaar is, moet een mengsel van dezelfde samenstelling worden bereid en getest volgens methode A.11.

2. GEGEVENS

De onderzochte stof wordt als gevaarlijk beschouwd indien:

—spontane ontbranding plaatsvindt bij één van de stappen tijdens de testprocedure;

—of

—een ontvlambaar gas vrijkomt met een grotere snelheid groter dan 1 liter per kg van de te onderzoeken stof per uur.

3. RAPPORTAGE

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—een nauwkeurige specificatie van de stof (beschrijving en verontreinigingen);

—gegevens over eventuele voorbehandeling van de onderzochte stof;

—de resultaten van de tests (stappen 1, 2, 3 en 4);

—de chemische identiteit van het vrijgekomen gas;

—de snelheid waarmee het gas vrijkomt als stap 4 (1.6.4) wordt uitgevoerd;

—alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor interpretatie van de resultaten.

4. LITERATUUR

(1)Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, tests and criteria, 1990, United Nations, New York.

(2)NF T 20-040, (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

Aanhangsel

Figuur

Apparatuur

image

A.13. PYROFORE EIGENSCHAPPEN VAN VASTE STOFFEN EN VLOEISTOFFEN

1. METHODE

1.1. INLEIDING

De testprocedure is van toepassing op vaste en vloeibare stoffen, die spontaan kunnen ontbranden kort nadat ze bij kamertemperatuur (ongeveer 20 oC) in aanraking zijn gekomen met lucht.

Deze testprocedure is niet van toepassing op stoffen die bij kamertemperatuur eerst na uren- of dagenlange blootstelling aan lucht spontaan ontbranden of die op hogere temperatuur moeten worden gebracht om tot zelfontbranding te komen.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN

Stoffen worden als pyrofoor beschouwd als ze ontbranden of verkoling veroorzaken onder de omstandigheden zoals beschreven onder 1.6.

Voor de zelfontvlambaarheid van vloeistoffen kan ook een test nodig zijn volgens methode A.15: Zelfontbrandingstemperatuur (vloeistoffen en gassen).

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Niet gegeven.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

De stof, vast of vloeibaar, wordt op een inerte drager gebracht en gedurende 5 minuten bij omgevingstemperatuur in aanraking gebracht met lucht. Indien vloeistoffen niet ontbranden moeten ze geabsorbeerd worden op filterpapier en gedurende 5 minuten bij omgevingstemperatuur (ongeveer 20 oC) worden blootgesteld aan lucht. Als een vaste of vloeibare stof ontbrandt, of een vloeistof het filterpapier doet ontbranden of verkolen, wordt de stof beschouwd als pyrofoor.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

Reproduceerbaarheid: gezien het belang met betrekking tot veiligheid is één enkel positief resultaat voldoende om de stof als pyrofoor te beschouwen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.1. Apparatuur

Een porseleinen bakje van ongeveer 10 cm doorsnede wordt bij kamertemperatuur (ongeveer 20 oC) tot een hoogte van ongeveer 5 mm gevuld met diatomeeënaarde.

Opmerking:

Diatomeeënaarde of een vergelijkbare en gangbare inerte stof wordt representatief geacht voor aarde waarmee gemorste stoffen in geval van een ongeluk in aanraking kunnen komen.

Droog filterpapier is vereist om vloeistoffen te onderzoeken die niet ontbranden na aanraking met lucht wanneer ze in aanraking zijn met een inerte drager.

1.6.2. Uitvoering van de test

a) Poedervormige vaste stoffen

1 tot 2 cm3 van de te onderzoeken, poedervormige stof wordt vanaf ongeveer 1 m hoogte op een niet-brandbaar oppervlak gestrooid; nagegaan wordt of de stof tijdens het vallen, of binnen 5 minuten na het neerkomen, ontbrandt.

De proef wordt 6 keer uitgevoerd tenzij ontbranding optreedt.

b) Vloeistoffen

Ongeveer 5 cm3 van de te onderzoeken vloeistof wordt in het porseleinen bakje gegoten en nagegaan wordt of de stof binnen 5 minuten ontbrandt.

Als geen ontbranding optreedt tijdens de zes proeven, voer dan de volgende tests uit:

Een hoeveelheid van 0,5 ml van de te onderzoeken stof wordt met behulp van een injectiespuit op een gekarteld filterpapiertje gebracht en er wordt nagegaan of ontbranding of verkoling van het filterpapier optreedt binnen vijf minuten nadat de vloeistof werd aangebracht. De test wordt driemaal uitgevoerd, tenzij ontbranding of verkoling optreedt.

2. GEGEVENS

2.1. BEWERKING VAN DE RESULTATEN

Het onderzoek mag worden gestaakt zodra een positief resultaat optreedt in één van de tests.

2.2. BEOORDELING

Indien de stof ontbrandt binnen vijf minuten na opbrengen op een inerte drager en blootstelling aan de lucht, of indien een vloeistof een filterpapiertje verkoolt of doet ontbranden binnen vijf minuten na opbrengen en blootstelling aan de lucht, wordt de stof beschouwd als zijnde pyrofoor.

3. RAPPORTAGE

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—een nauwkeurige specificatie van de stof (beschrijving en verontreinigingen);

—de resultaten van de tests;

—iedere bijkomende opmerking betreffende de interpretatie van de resultaten.

4. LITERATUUR

(1)NF T 20-039, (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.

(2)Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.

A.14. EXPLOSIEGEVAAR

1. METHODE

1.1. INLEIDING

De methode omvat een testschema om vast te stellen of een pasta explosiegevaar oplevert wanneer de stof aan een vlam (thermische gevoeligheid) of aan een schok of wrijving (mechanische gevoeligheid) wordt blootgesteld, alsmede of een vloeistof explosiegevaar oplevert wanneer de stof aan een vlam of aan een schok wordt blootgesteld.

De methode bestaat uit drie delen:

a)een test voor de thermische gevoeligheid (1);

b)een test voor de mechanische gevoeligheid bij schokken (1);

c)een test voor de mechanische gevoeligheid bij wrijving (1).

De methode levert gegevens op waarmee de kans op ontstaan van een explosie door bepaalde veel voorkomende stimuli kan worden beoordeeld. De methode is niet bedoeld om vast te stellen of een stof onder om het even welke omstandigheden kan exploderen.

De methode is geschikt om te bepalen of een stof explosiegevaar oplevert (thermische en mechanische gevoeligheid) onder omstandigheden zoals beschreven in de richtlijn. De methode is gebaseerd op een aantal soorten apparaten die internationaal op grote schaal worden gebruikt (1) en die doorgaans zinvolle resultaten geven. Erkend wordt dat de methode geen definitief uitsluitsel geeft. Andere apparatuur dan beschreven, mag worden gebruikt op voorwaarde dat deze internationaal erkend is en dat de resultaten afdoende getoetst kunnen worden aan de resultaten met de beschreven apparatuur.

De proeven hoeven niet te worden uitgevoerd indien uit de beschikbare thermodynamische gegevens (vormingswarmte, ontledingswarmte) en/of afwezigheid van bepaalde reactieve groepen (2) in de structuurformule met afdoende zekerheid kan worden vastgesteld dat de stof niet snel kan ontleden onder productie van gassen of warmte (dat wil zeggen: het materiaal vertegenwoordigt geen enkel explosiegevaar). Een test op mechanische gevoeligheid voor wrijving is niet vereist voor vloeistoffen.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN

Als explosief worden gedefinieerd: stoffen die door de werking van een vlam kunnen ontploffen of die gevoelig zijn voor schokken en wrijving in de beschreven apparatuur (of die mechanisch gevoeliger zijn dan 1,3-dinitrobenzeen in andere apparatuur).

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Technisch, kristallijn 1,3-dinitrobenzeen gezeefd door 0,5 mm maaswijdte, voor de wrijvings- en schok-methode.

Perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine (RDX, hexogeen, cycloniet — CAS 121-82-4), geherkristalliseerd uit waterig cyclohexanon, nat gezeefd door een 250 μm zeef en op een 150 μm zeef en gedroogd bij 103 ± 2 oC (gedurende 4 uur) voor de tweede reeks wrijvings- en schoktests.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

Tot vaststelling van veilige omstandigheden voor het uitvoeren van de drie gevoeligheidstests zijn oriënterende proeven noodzakelijk.

1.4.1. Oriënterende proef (3)

Om veiligheidsredenen worden voor het uitvoeren van de gevoeligheidsbeproevingen zeer kleine monsters (ongeveer 10 mg) van de stof zonder afsluiting verwarmd in een gasvlam, blootgesteld aan schokken in een geschikt apparaat, en aan wrijving door middel van een hamer tegen een aambeeld of door middel van elk ander wrijvingstoestel. Het doel is vast te stellen of de stof zo gevoelig en explosiegevaarlijk is dat de voorgeschreven gevoeligheidstests, vooral die van thermische gevoeligheid, moeten worden uitgevoerd met speciale voorzorgen om aldus te voorkomen dat de onderzoeker gewond kan raken.

1.4.2. Thermische gevoeligheid

Bij deze methode wordt de stof verwarmd in een stalen buis, afgesloten door afsluitplaten met openingen van verschillende doorsnede, om vast te stellen of de stof bij thermische belasting en goed gedefinieerde opsluiting kan ontploffen.

1.4.3. Mechanische gevoeligheid (schok)

Bij deze methode wordt de stof aan een schok, veroorzaakt door een bepaalde massa vallend vanaf een bepaalde hoogte, onderworpen.

1.4.4. Mechanische gevoeligheid (wrijving)

Bij deze methode wordt de vaste stof of pasta onder bepaalde omstandigheden van belasting en relatieve beweging onderworpen aan wrijving russen standaardoppervlakken.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

Niet gegeven.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN

1.6.1. Thermische gevoeligheid (werking van een vlam)

1.6.1.1. Apparatuur

Het apparaat bestaat uit een stalen buis, bestemd voor éénmalig gebruik, voorzien van een herbruikbare afsluitinrichting (figuur 1), die in een verwarmings- en beschermingstoestel wordt geplaatst. Elke buis is diep getrokken uit plaatstaal (zie aanhangsel) en heeft een inwendige doorsnede van 24 mm, een lengte van 75 mm en een wanddikte van 0,5 mm. Aan het open einde is de buis van een flens voorzien om afsluiting met de afsluitinrichting mogelijk te maken. De afsluitinrichting bestaat uit een drukbestendige ronde afsluitplaat met een gat in het midden, die met behulp van een tweedelige schroefverbinding (moer en kraag met schroefdraad) stevig op de buis wordt bevestigd. De moer en de kraag zijn gemaakt van chroommangaanstaal (zie aanhangsel) dat tot 800 oC vonkvrij is. De afsluitplaten zijn 6 mm dik en gemaakt van hittebestendig staal (zie aanhangsel), en zijn verkrijgbaar in een reeks verschillende openingsmaten.

1.6.1.2. Testomstandigheden

Normaal wordt de stof getest zoals hij verkregen werd, alhoewel het in sommige gevallen noodzakelijk kan zijn om de stof te testen na verpulvering, bijvoorbeeld indien hij geperst, gegoten of op andere wijze verdicht is.

Voor vaste stoffen wordt de hoeveelheid voor elke test te gebruiken materiaal bepaald met behulp van een twee-staps vulprocedure. Een gewogen buis wordt gevuld met 9 cm3 van de stof, waarna deze wordt aangedrukt met een kracht van 80 N verdeeld over de hele doorsnede van de buis. Om veiligheidsredenen of in gevallen waar de fysische vorm van het monster kan veranderen onder druk, mogen andere vulmethoden worden gebruikt; aandrukken is bijvoorbeeld niet geschikt als de stof zeer wrijvingsgevoelig is. Als de stof samendrukbaar is wordt meer materiaal bijgevoegd en aangeperst met 80 N totdat de buis gevuld is tot op 55 mm van de bovenkant. De massa van de stof die gebruikt wordt om de buis te vullen tot op het niveau van 55 mm wordt bepaald, vervolgens worden nog twee porties met deze massa, en elk aangedrukt met een kracht van 80 N, ingebracht. Daarna wordt het materiaal of wel bijgevuld of wel verwijderd en aangedrukt totdat de buis gevuld is tot op een hoogte van 15 mm van de bovenkant. Een tweede stap in de vulprocedure wordt uitgevoerd met een aangedrukte massa die een derde bedraagt van de totale hoeveelheid die in de eerste poging werd bepaald. Er worden nog twee van deze hoeveelheden toegevoegd en elk onder 80 N aangedrukt, waarna het niveau van de stof wordt aangepast tot op 15 mm van de bovenkant door materiaal naar behoefte toe te voegen of weg te halen. Voor elke beproeving wordt nu de hoeveelheid vaste stof gebruikt, die in de tweede vulprocedure is vastgesteld, waarbij het vullen wordt uitgevoerd met drie gelijke porties die achtereenvolgens worden samengeperst tot 9 cm3 met de daartoe benodigde kracht (het samenpersen kan worden vereenvoudigd met behulp van tussenringen).

Vloeistoffen en gels worden in de buis gebracht tot op een hoogte van 60 mm, waarbij zorg dient te worden gedragen dat bij het vullen met gel geen luchtbellen ontstaan. De buis wordt in de kraag geschoven, de juiste afsluitplaat wordt opgelegd en de moer wordt op de kraag geschroefd na het aanbrengen van een beetje smeermiddel op basis van molybdeendisulfide. Het is van essentieel belang te controleren dat er geen materiaal achterblijft tussen de moer, de plaat, en de schroefdraad.

De verwarming geschiedt met behulp van propaan uit een industriële cilinder voorzien van een drukregelaar (60 tot 70 mbar), dat via een meter door een verdeelstuk evenredig verdeeld wordt over vier branders (hetgeen visueel te controleren is aan de vlammen uit de branders). De branders worden rond de beproevingsruimte geplaatst zoals aangegeven in figuur 1. De vier branders hebben een gezamenlijk verbruik van ongeveer 3,2 liter propaan per minuut. Andere stookgassen of branders mogen gebruikt worden, maar de opwarmsnelheid moet verlopen zoals in figuur 3 aangegeven. Voor alle apparatuur dient de opwarmsnelheid periodiek gecontroleerd te worden met behulp van met diburylftalaat gevulde buizen zoals in figuur 3 is aangeduid.

1.6.1.3. Uitvoering van de proeven

Elke test wordt uitgevoerd totdat ofwel de buis gefragmenteerd is of de buis gedurende vijf minuten is verhit. Als de test resulteert in fragmentatie van de buis in drie of meer stukken, die soms nog aan elkaar zijn verbonden door smalle metaalstrookjes zoals geïllustreerd in figuur 2, wordt het resultaat beoordeeld als een opgetreden explosie. Een testresultaat, waarbij minder of geen fragmenten ontstaan, wordt beschouwd als niet explosief.

Een reeks van drie proeven met een afsluitplaat met een opening van 6,0 mm doorsnede wordt uitgevoerd en, als geen explosies optreden, een tweede reeks van drie proeven met een afsluitplaat met een opening van 2,0 mm. Indien een explosie plaatsvindt in een van de twee proefreeksen, kunnen verdere tests achterwege blijven.

1.6.1.4. Beoordeling

Het testresultaat wordt als positief beschouwd als er een explosie plaatsvindt in een van bovenstaande testreeksen.

1.6.2. Mechanische gevoeligheid (schok)

1.6.2.1. Apparatuur (figuur 4)

De belangrijkste onderdelen van een doorsnee valhamerapparaat zijn een gietstalen blok met voet, aambeeld, kolom, geleiders, valgewichten, een ontkoppelinrichting en een monsterhouder. Op het stalen blok van 230 mm lengte × 250 mm breedte × 200 mm hoogte met een gegoten voet van 450 mm lengte × 450 mm breedte × 60 mm hoogte, zit het stalen aambeeld van 100 mm doorsnede × 70 mm hoogte vastgeschroefd. Aan de achterkant van het stalen blok is de houder geschroefd waarin de kolom, bestaande uit een naadloze getrokken stalen buis, is bevestigd. Vier schroeven verankeren het apparaat aan een massief betonnen blok van 60 × 60 × 60 cm in een zodanige positie dat de geleiderbalken volkomen verticaal staan en het valgewicht vrij kan vallen. Gewichten van 5 en 10 kg massief staal kunnen worden gebruikt. Het slagoppervlak van de gewichten bestaat uit getemperd staal, HRC 60 tot 63, met een minimumdoorsnede van 25 mm.

Het te onderzoeken monster wordt gevat in een schokbeproevingsvat dat bestaat uit twee massieve, in het verlengde boven elkaar liggende stalen cilinders omhuld door een holle stalen geleidecilinder. De massief stalen cilinders hebben een doorsnede van 10 (- 0,003; - 0,005) mm en een hoogte van 10 mm, gepolijste oppervlakken, afgeronde zijvlakken (rondingsstraal 0,5 mm) en een hardheid van HRC 58 tot 65. De holle cilinder heeft een uitwendige diameter van 16 mm, een gepolijste binnenkant met een doorsnede van 10 (+ 0,005; + 0,010) mm en een hoogte van 13 mm. Het beproevingsvat wordt vastgezet op een stalen tussenaambeeld (26 mm doorsnede en 26 mm hoogte) en wordt gecentreerd door een ring met perforaties via welke de explosiegassen kunnen worden afgevoerd.

1.6.2.2. Testomstandigheden

Het monstervolume dient 40 mm3 te bedragen of overeen te komen met het vulvolume in een alternatief apparaat. Vaste stoffen dienen in droge toestand te worden onderzocht en worden als volgt voorbewerkt:

a)poedervormige stoffen worden gezeefd (maaswijdte 0,5 mm); alles wat de zeef doorlaat, wordt voor de test gebruikt;

b)samengeperste, gegoten of op andere wijze verdichte stoffen worden in stukken gebroken en gezeefd; de zeeffractie van 0,5 tot 1 mm doorsnede wordt gebruikt voor de test en dient representatief te zijn voor de oorspronkelijke stof.

Stoffen die normaal gezien geleverd worden als pasta's zouden, in de mate van het mogelijke, moeten worden getest in droge staat of, in ieder geval, na het zoveel mogelijk verwijderd hebben van vloeistof. Vloeistoffen worden onderzocht met een spleet van 1 mm tussen de bovenste en de onderste stalen cilinder.

1.6.2.3. Uitvoering van de proeven

Een reeks van zes proeven wordt uitgevoerd waarbij men het gewicht van 10 kg van een hoogte van 0,40 m (40 J) laat vallen. Indien een explosie wordt verkregen in de reeks met 40 J moet een extra reeks van zes proeven worden uitgevoerd waarbij men 5 kg van 0,15 m (7,5 J) laat vallen. In andere apparaten wordt het monster vergeleken met de gekozen referentiestof via een vastgestelde procedure (bijvoorbeeld op-en-neer techniek, enz.).

1.6.2.4. Beoordeling

Het testresultaat wordt als positief beschouwd als ten minste éénmaal in een van de proeven een explosie (ontbranden en/of een knal staan hiermee gelijk) plaatsvindt met het beschreven slagapparaat of als het monster in een alternatieve slagproef gevoeliger is dan 1,3-dinitrobenzeen of RDX.

1.6.3. Mechanische gevoeligheid (wrijving)

1.6.3.1. Apparatuur (figuur 5)

Het wrijvingsapparaat bestaat uit een gietstalen grondplaat waarop het eigenlijke wrijvingstoestel gemonteerd is. Het wrijvingstoestel bestaat uit een vaste porseleinen pen en een bewegende porseleinen plaat. De porseleinen plaat zit vast in een slede welke tussen twee geleiders beweegt. De slede wordt via een aandrijfstang, een excentrische nok en een geschikt drijfwerk op zodanige wijze met een elektromotor verbonden, dat de porseleinen plaat slechts éénmaal onder de porseleinen pen heen en weer wordt bewogen over een afstand van 10 mm. De porseleinen pen kan belast worden met bijvoorbeeld 120 of 360 newton.

De vlakke porseleinen platen worden van wit technisch porselein (oppervlakteruwheid tussen 9 en 32 μm) gemaakt en zijn 25 mm lang, 25 mm breed en 5 mm hoog. De cylindrische porseleinen pen wordt eveneens van wit technisch porselein gemaakt, is 15 mm lang, heeft een doorsnede van 10 mm en bolvormige uiteinden met een rondingsstraal van 10 mm, en geruwd oppervlak.

1.6.3.2. Testomstandigheden

Het monstervolume dient 10 mm3 te bedragen of overeen te komen met het vulvolume in een alternatief apparaat.

Vaste stoffen dienen in droge toestand te worden onderzocht en worden als volgt voorbewerkt:

a)poedervormige stoffen worden gezeefd (maaswijdte 0,5 mm); alles wat de zeef doorlaat, wordt voor de test gebruikt;

b)samengeperste, gegoten of op andere wijze verdichte stoffen worden in stukken gebroken en gezeefd; de zeeffractie kleiner dan 0,5 mm wordt gebruikt voor de test.

Stoffen die gewoonlijk als pasta's geleverd zouden worden, moeten, in de mate van het mogelijke, in droge staat worden getest. Wanneer de stoffen niet in droge staat kunnen worden bereid, wordt de pasta (na het zoveel mogelijk verwijderen van vloeistof) getest als een 0,5 mm dikke, 2 mm brede en 10 mm lange plak, bereid met behulp van een mal.

1.6.3.3. Uitvoering van de proeven

De porseleinen pen wordt op het te onderzoeken monster geplaatst en de belasting wordt aangebracht. Tijdens de test moeten de groeven van de porseleinen plaat loodrecht op de bewegingsrichting liggen. Er moet goed op worden gelet dat de pen op het monster rust, dat voldoende van de te onderzoeken stof onder de pen ligt en dat de plaat op de juiste wijze onder de pen doorbeweegt. Voor pasta's wordt een 0,5 mm dikke mal met een gleuf van 2 bij 10 mm gebruikt om de pasta op de plaat aan te brengen. De porseleinen plaat moet in 0,44 seconden onder de porseleinen pen heen en weer bewegen over een afstand van 10 mm. De pen en elk gedeelte van het oppervlak mogen slechts voor één test worden gebruikt; de twee uiteinden van de pen kunnen dus dienen voor twee proeven en de twee oppervlakken van de plaat elk voor drie proeven.

Een reeks van zes proeven wordt uitgevoerd met 360 N belasting. Als een positief resultaat wordt verkregen tijdens deze zes proeven, moet een tweede reeks van zes proeven worden uitgevoerd met 120 N belasting. Bij gebruik van andere apparatuur wordt het monster vergeleken met de gekozen referentiestof via een vastgestelde procedure (bijvoorbeeld op-en-neer-techniek, enz.).

1.6.3.4. Beoordeling

Het testresultaat wordt als positief beschouwd als ten minste in één van de proeven een explosie (knetteren en/of een knal of ontbranden staan hiermee gelijk) plaatsvindt met het beschreven wrijvingsapparaat of als aan gelijkwaardige eisen voldaan wordt in andere wrijvingsapparatuur.

2. GEGEVENS

In beginsel wordt in de zin van deze richtlijn aan een stof of preparaat explosiegevaar toegeschreven indien een positief resultaat wordt verkregen in de thermische-, schok- of wrijvingsgevoeligheidstest.

3. RAPPORTAGE

3.1. TESTRAPPORT

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—de identiteit, samenstelling, zuiverheid, vochtgehalte, enz. van de onderzochte stof;

—de fysische vorm van het monster, en of het al dan niet werd verpulverd, gebroken en/of gezeefd;

—waarnemingen tijdens de thermische-gevoeligheidstests (bijvoorbeeld de monstermassa, aantal fragmenten, enz.);

—waarnemingen tijdens de mechanische-gevoeligheidstests (bijvoorbeeld de vorming van grote hoeveelheden rook of complete ontleding zonder knal, vlammen, vonken, knallen, knetteren, enz.);

—de resultaten van elke soort test;

—indien afwijkende apparatuur is gebruikt, moet dit op wetenschappelijke gronden worden gerechtvaardigd; bovendien moet de correlatie tussen meetresultaten met de afwijkende apparatuur en de hierboven beschreven apparatuur bewezen worden;

—eventueel nuttige opmerkingen, zoals verwijzing naar proeven met soortgelijke producten, die van belang kunnen zijn voor een correcte interpretatie van de resultaten;

—alle aanvullende opmerkingen die van belang kunnen zijn voor een goede interpretatie van de resultaten.

3.2. INTERPRETATIE EN BEOORDELING VAN DE RESULTATEN

In het testrapport moet worden vermeld welke resultaten als onjuist, afwijkend of niet-representatief worden beschouwd. Indien een van de resultaten moet worden verworpen, dient een toelichting én de resultaten van alle alternatieve of aanvullende proeven te worden gegeven. Indien een afwijkend resultaat niet kan worden verklaard, moet het worden aanvaard en gebruikt om de stof overeenkomstig in te delen.

4. LITERATUUR

(1)Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.

(2)Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.

(3)Koenen, H., Ide, K.H., en Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6-13 en 30-42.

(4)NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of explosive risk.

Aanhangsel

Voorbeeld van materiaalspecificatie voor thermische-gevoeligheidstest (zie DIN 1623)

(1)Buis: Materiaalspecificatie nr. 1.0336.505 g

(2)Afsluitplaat: Materiaalspecificatie nr. 1.4873

(3)Getapte kraag en moer: Materiaalspecificatie nr. 1.3817

Figuur 1

Apparatuur voor de thermische-gevoeligheidstest

(Alle afmetingen in mm)

image

Figuur 2

Thermische-gevoeligheidstest

(Voorbeelden van fragmentatie)

image

Figuur 3

IJking voor opwarmsnelheid in de thermische-gevoeligheidstest

image

Temperatuur/tijd-curve verkregen door verhitting van dibutylftalaat (27 cm3) in een gesloten (1,5 mm afsluitplaat) buis met behulp van een propaandebiet van circa 3,2 liter/minuut. De temperatuur wordt gemeten met een chromel/alumel thermokoppel, roestvrijstalen omhulsel van 1 mm doorsnede, in het midden van de buis geplaatst op 43 mm onder de rand. De opwarmsnelheid in het bereik van 135 oC tot 285 oC moet tussen 185 en 215 K/minuut liggen.

Figuur 4

Schokgevoeligheidstest

(Afmetingen in mm)

image

Figuur 4

Vervolg

image

Figuur 5

Wrijvingsgevoeligheidstest

image

A.15. ZELFONTBRANDINGSTEMPERATUUR (VLOEISTOFFEN EN GASSEN)

1. METHODE

1.1. INLEIDING

Explosieve stoffen en stoffen die spontaan ontbranden in aanraking met lucht bij kamertemperatuur moeten niet onderworpen worden aan dit onderzoek. De testprocedure is van toepassing op gassen, vloeistoffen en dampen die in aanwezigheid van lucht door een heet oppervlak tot ontbranding kunnen worden gebracht.

De temperatuur waarbij zelfontbranding optreedt, kan aanzienlijk worden verlaagd door de aanwezigheid van katalytische verontreinigingen, door het oppervlakmateriaal, of door een groter volume van het proefvat.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN

De mate van zelfontbranding wordt uitgedrukt in de zelfontbrandingstemperatuur. De zelfontbrandingstemperatuur is de laagste temperatuur waarbij de te onderzoeken stof gemengd met lucht tot ontbranding komt onder omstandigheden zoals beschreven in deze testmethode.

1.3. REFERENTIESTOFFEN

De referentiestoffen worden beschreven in de normen (zie 1.6.3). Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om de werking van de methode regelmatig te controleren en om vergelijking met resultaten van andere methoden mogelijk te maken.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

De methode bepaalt de laagste temperatuur van het binnenoppervlak van een vat, die leidt tot ontbranding van een in het vat geïnjecteerd(e) gas, damp, of vloeistof.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

De reproduceerbaarheid is afhankelijk van het temperatuurgebied waarin de zelfontbranding optreedt, en van de gebruikte testmethode.

De gevoeligheid en specificiteit zijn afhankelijk van de gebruikte testmethode.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.1. Apparatuur

De apparatuur wordt beschreven in de onder 1.6.3 genoemde methode.

1.6.2. Testomstandigheden

De te onderzoeken stof wordt onderzocht volgens de methode beschreven onder 1.6.3.

1.6.3. Uitvoering van de test

Zie: IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.

2. GEGEVENS

Registreer de testtemperatuur, de atmosferische druk, de gebruikte hoeveelheid stof en de tijdsduur tot ontbranding.

3. RAPPORTAGE

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen);

—de gebruikte hoeveelheid stof en de atmosferische druk;

—de gebruikte apparatuur;

—de resultaten van metingen (testtemperaturen, resultaten met betrekking tot ontbranding en bijbehorende tijdsduur);

—alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor interpretatie van de resultaten.

4. LITERATUUR

Geen.

A.16. RELATIEVE ZELFONTBRANDINGSTEMPERATUUR VAN VASTE STOFFEN

1. METHODE

1.1. INLEIDING

Explosiegevaarlijke stoffen en stoffen die in contact met lucht bij kamertemperatuur spontaan ontbranden, moeten niet aan deze test worden onderworpen.

Deze test geeft oriënterende informatie over de zelfontbrandbaarheid van vaste stoffen bij verhoogde temperatuur.

Indien de warmte, die vrijkomt bij reactie van de stof met zuurstof of bij exotherme ontleding, niet snel genoeg aan de omgeving wordt afgegeven, vindt zelfopwarming en uiteindelijk zelfontbranding plaats. Zelfontbranding kan dus slechts optreden als de snelheid van de warmteproductie groter is dan die van het warmteverlies.

De testprocedure is bruikbaar als een oriënterende proef voor vaste stoffen. Omdat de ontsteking en verbranding van vaste stoffen ingewikkelde processen zijn, mag de volgens deze testmethode bepaalde zelfontbrandingstemperatuur alleen voor vergelijkingsdoeleinden worden gebruikt.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN

De zelfontbrandingstemperatuur, die met deze methode verkregen wordt, is de laagste omgevingstemperatuur in oC waarbij een bepaald volume van een stof onder welbepaalde omstandigheden ontbrandt.

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Niet gegeven.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

Een bepaald volume van de te onderzoeken stof wordt bij kamertemperatuur in een oven geplaatst; het temperatuurverloop in het midden van het monster wordt als functie van de tijd geregistreerd, terwijl de temperatuur van de oven met een snelheid van 0,5oC/minuut wordt opgevoerd tot 400 oC of tot de smelttemperatuur indien deze lager is. Voor het doel van deze test wordt de temperatuur van de oven, waarbij de temperatuur van het monster door zelfopwarming 400 oC bereikt, de zelfontbrandingstemperatuur genoemd.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

Niet gegeven.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.1. Apparatuur

1.6.1.1. Oven

Een laboratoriumoven van ongeveer 2 liter, waarvan het temperatuurverloop lineair geregeld kan worden, en voorzien van natuurlijke luchtcirculatie en explosieontlasting. Teneinde eventueel explosiegevaar te vermijden, moet voorkomen worden dat ontledingsgassen in contact kunnen komen met de elektrische verwarmingselementen.

1.6.1.2. Gazen kubus

Een stuk roestvrij staalgaas met openingen van 0,045 mm moet worden uitgeknipt volgens het patroon van figuur 1. Het gaas wordt gevouwen en met draad vastgemaakt in de vorm van een kubus met open bovenkant.

1.6.1.3. Thermokoppels

Geschikte thermokoppels.

1.6.1.4. Recorder

Tweekanaalsrecorder, gecalibreerd van 0 tot 600 oC of hiermee overeenkomstige spanning.

1.6.2. Testomstandigheden

De stoffen worden getest zoals ontvangen.

1.6.3. Uitvoering van de test

De kubus wordt gevuld met de te onderzoeken stof waarbij onder zachtjes tikken zoveel stof toegevoegd wordt dat de kubus volledig gevuld is. Vervolgens wordt de kubus bij kamertemperatuur midden in de oven gehangen. Het ene thermokoppel wordt in het middelpunt van de kubus gebracht en het tweede tussen de kubus en de ovenwand om de oventemperatuur te registreren.

De temperaturen van de oven en van het monster worden continu geregistreerd terwijl de temperatuur van de oven met een snelheid van 0,5oC/min wordt opgevoerd tot 400 oC of tot de smelttemperatuur indien deze lager is dan 400 oC.

Wanneer de stof reageert, zal het thermokoppel in het monster een scherpe temperatuursstijging boven de oventemperatuur te zien geven.

2. GEGEVENS

De oventemperatuur, waarbij de temperatuur van het monster door zelfopwarming 400 oC bereikt, is van belang voor de beoordeling (zie figuur 2).

3. RAPPORTAGE

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—een beschrijving van de onderzochte stof;

—de meetresultaten inclusief de temperatuur/tijd-grafiek;

—alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor interpretatie van de resultaten.

4. LITERATUUR

(1) NF T 20-036 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

Figuur 1

Patroon van de testkubus met ribben van 20 mm

image

Figuur 2

Karakteristieke temperatuur/tijd-curve

image

A.17. OXIDERENDE EIGENSCHAPPEN (VASTE STOFFEN)

1. METHODE

1.1. INLEIDING

Het is nuttig om, voordat deze test wordt uitgevoerd, te beschikken over gegevens over de mogelijke explosieve eigenschappen van de te onderzoeken stof.

Deze test is niet toepasbaar op vloeistoffen en gassen, explosieve of licht ontvlambare vaste stoffen of organische peroxiden.

Deze test hoeft niet uitgevoerd te worden als op grond van de structuurformule met afdoende zekerheid kan worden vastgesteld dat de stof niet exotherm kan reageren met een brandbare stof.

Teneinde vast te stellen of voor deze test speciale voorzorgsmaatregelen nodig zijn, moet een oriënterende proef worden uitgevoerd.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN

Brandduur: de tijd in seconden die de reactiezone nodig heeft om zich langs een rups stof te verplaatsen, volgens de werkwijze van 1.6.

Brandsnelheid: de bijbehorende snelheid in mm/s.

Maximale brandsnelheid: de hoogste waarde van de brandsnelheden van mengsels die 10 tot 90 gewichtsprocent oxiderende stof bevatten.

1.3. REFERENTIESTOF

Als referentiestof voor de test en de oriënterende proef wordt bariumnitraat (analytisch zuiver) gebruikt.

Het referentiemengsel is het volgens 1.6 bereide mengsel van bariumnitraat en poedervormige cellulose, dat de grootst mogelijke brandsnelheid heeft (doorgaans een mengsel met 60 gewichtsprocent bariumnitraat).

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

Met het oog op de veiligheid wordt een oriënterende proef uitgevoerd. Verdere onderzoeken zijn onnodig wanneer uit de oriënterende proef overduidelijk blijkt dat de te onderzoeken stof oxiderende eigenschappen heeft. In andere gevallen wordt de stof aan het volledige onderzoek onderworpen.

In het volledige onderzoek wordt de te onderzoeken stof in verschillende verhoudingen gemengd met een bepaalde brandbare stof. Van ieder mengsel wordt een rups gevormd en deze wordt aan één uiteinde aangestoken. De maximale brandsnelheid wordt bepaald en vergeleken met de maximale brandsnelheid van het referentiemengsel.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

Indien nodig kunnen de stoffen op willekeurige wijze worden gemalen en gemengd, mits de maximale brandsnelheden uit de zes verschillende bepalingen niet meer dan 10 % verschillen van hun rekenkundige gemiddelde.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE METHODE

1.6.1. Voorbereiding

1.6.1.1. Teststof

De deeltjesgrootte van het te onderzoeken monster wordt als volgt tot minder dan 0,125 mm verkleind: de stof wordt gezeefd en de overblijvende fractie gemalen; deze handelingen worden herhaald totdat de gehele portie door de zeef is gegaan.

Iedere methode voor malen en zeven kan worden gebruikt, zolang aan de kwaliteitscriteria is voldaan.

Vóór het bereiden van het mengsel wordt de stof eerst tot constant gewicht gedroogd bij 105 oC. Indien de ontledingstemperatuur van de te onderzoeken stof beneden 105 oC ligt, wordt de stof bij een lagere temperatuur gedroogd.

1.6.1.2. Brandbare stof

Poedervormige cellulose wordt gebruikt als brandbare stof. De cellulose moet het soort zijn dat wordt gebruikt bij dunne-laagchromatografie of kolomchromatografie. Een type waarbij meer dan 85 % van de vezels een lengte hebben tussen 0,020 en 0,075 mm is geschikt gebleken. Het cellulosepoeder wordt gezeefd door een zeef met openingen van 0,125 mm. Eén en dezelfde voorbewerkte batch cellulose wordt gebruikt gedurende de hele proef.

Vóór het bereiden van het mengsel wordt de poedervormige cellulose bij 105 oC tot constant gewicht gedroogd.

Indien in de oriënterende proef houtmeel wordt gebruikt, wordt het houtmeel van naaldhout gebruikt dat door een zeef met openingen van 1,6 mm valt; het gezeefde houtmeel wordt grondig gemengd en vervolgens vier uur bij 105 oC gedroogd in een laag van maximaal 25 mm dikte. Na afkoelen wordt het houtmeel in een luchtdicht vat dat zover mogelijk gevuld is, bewaard tot het ogenblik waarop het wordt gebruikt, zo mogelijk binnen 24 uur na het drogen.

1.6.1.3. Ontstekingsbron

Als ontstekingsbron dient de hete vlam van een gasbrander (minimale diameter 5 mm). Indien een andere ontstekingsbron wordt gebruikt (bijvoorbeeld bij proeven in een inerte atmosfeer), moeten beschrijving, redenen en geschiktheid worden gerapporteerd.

1.6.2. Uitvoering van de test

Opmerking:

In verband met mogelijk explosiegevaar moeten mengsels van oxiderende stoffen en cellulose of houtmeel met de nodige voorzichtigheid worden behandeld.

1.6.2.1. Oriënterende proef

Twee gewichtsdelen gedroogde stof worden grondig gemengd met één gewichtsdeel cellulose of houtmeel. Van het mengsel wordt, bijvoorbeeld met behulp van een glazen trechter waarvan de steel is dichtgestopt, zonder aandrukken een kegelvormig hoopje gemaakt met een basisdiameter van 3,5 cm en een hoogte van 2,5 cm.

Het hoopje wordt op een koude onbrandbare, niet poreuze en slecht warmtegeleidende grondplaat geplaatst. De oriënterende proef moet worden uitgevoerd in een zuurkast zoals beschreven in 1.6.2.2.

De ontstekingsbron wordt in contact gebracht met het hoopje stof. De heftigheid en de duur van de reactie worden geobserveerd en geregistreerd.

De stof kan worden aangemerkt als oxiderend als de reactie heftig verloopt.

Zodra het resultaat aanleiding geeft tot enige twijfel, dient de hieronder beschreven volledige test te worden uitgevoerd.

1.6.2.2. Volledig onderzoek

Er worden mengsels van de oxiderende stof en de brandbare stof gemaakt, waarbij het gehalte oxiderende stof in stappen van 10 gewichtsprocenten oploopt van 10 tot 90 gewichtsprocenten. In grensgevallen moeten tussenliggende mengverhoudingen worden bereid, zodat de maximale brandsnelheid nauwkeuriger kan worden bepaald.

Er wordt een rupsstof gevormd met behulp van een mal. Deze mal is van metaal, heeft een lengte van 250 mm en een driehoekige doorsnede met een hoogte van 10 mm en een basis van 20 mm. Aan weerszijden van de mal worden in de lengterichting twee metalen platen aangebracht die 2 mm boven de driehoekige doorsnede uitsteken (zie figuur). De mal wordt zonder aandrukken gevuld met een kleine overmaat van het mengsel. Na de mal eenmaal van een hoogte van 2 cm op een vast oppervlak te hebben laten vallen, wordt de overmaat mengsel met een schuingehouden blad weggeveegd. De zijstroken worden verwijderd en het overblijvende poeder wordt met een rol glad gestreken. Ten slotte wordt bovenop de mal een vuurvaste, niet poreuze en slecht warmtegeleidende plaat gelegd, het geheel wordt omgekeerd en de mal verwijderd.

De rups wordt in de zuurkast geplaatst in een richting loodrecht op de richting van de trek.

De luchtsnelheid moet voldoende zijn om te verhinderen dat verbrandingsgassen naar de laboratoriumruimte ontsnappen; de luchtsnelheid mag gedurende de test niet veranderd worden. De apparatuur moet worden omgeven door een tochtscherm.

In verband met de hygroscopische eigenschappen van cellulose en sommige te onderzoeken stoffen moet de test zo snel mogelijk worden uitgevoerd.

Eén uiteinde van de rups wordt aangestoken door aanraking met de vlam.

De brandduur wordt gemeten over een lengte van 200 mm, nadat de reactiezone reeds een beginafstand van 30 mm heeft afgelegd.

De test wordt uitgevoerd met de referentiestof en vervolgens ten minste éénmaal met elk mengsel uit de reeks van de te onderzoeken stof en cellulose.

Indien een maximale brandsnelheid wordt waargenomen die aanzienlijk hoger is dan de maximale brandsnelheid van het referentiemengsel, kan de test worden gestaakt; zo niet, dan moet de test vijfmaal worden herhaald met de drie mengsels die de hoogste brandsnelheid opleverden.

Indien men vermoedt dat het resultaat vals positief is, moet de test herhaald worden met een inerte stof met een zelfde deeltjesgrootte, zoals kiezelgoer, in plaats van cellulose. Ook kan het mengsel te onderzoeken stof/cellulose, dat de grootste verbrandingssnelheid heeft, opnieuw getest worden in een inerte atmosfeer (< 2 % v/v zuurstofgehalte).

2. GEGEVENS

Om veiligheidsredenen moet de hoogste brandsnelheid — en niet de gemiddelde waarde — worden beschouwd als kenmerk voor de oxiderende eigenschappen van de stof.

De hoogste waarde van de brandsnelheid binnen een serie van zes metingen voor één bepaald mengsel geldt voor de beoordeling.

Maak een grafiek waarin de hoogste waarde van de brandsnelheid van ieder mengsel wordt uitgezet tegen de concentratie van de oxiderende stof in ieder mengsel; bepaal uit deze grafiek de maximale brandsnelheid.

De zes waarden van de brandsnelheid, in een serie van zes metingen op het mengsel met de hoogste brandsnelheid, mogen niet meer dan 10 % afwijken van hun rekenkundig gemiddelde; anders moeten de gebruikte methoden voor malen en mengen verbeterd worden.

Vergelijk de verkregen maximale brandsnelheid met de maximale brandsnelheid van het referentiemengsel (zie 1.3).

Als tests worden uitgevoerd in een inerte atmosfeer, moet de maximale reactiesnelheid worden vergeleken met die van het referentiemengsel in een inerte atmosfeer.

3. RAPPORTAGE

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—beschrijving, samenstelling, zuiverheid, vochtgehalte, enz. van de onderzochte stof;

—eventuele voorbehandeling van de onderzochte stof (bijvoorbeeld malen, drogen enz.)

—de in de onderzoeken gebruikte ontstekingsbron;

—de resultaten van de metingen;

—de wijze van reactie (bijvoorbeeld een „flashverbranding” aan het oppervlak of een verbranding door de gehele massa, eventuele informatie met betrekking tot de verbrandingsproducten enz.);

—alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, inclusief een beschrijving van de heftigheid (vlammen, vonken, rook, smeulen, en dergelijke) en een schatting van de brandduur van de oriënterende proef, zowel voor de teststof als voor de referentiestof;

—de resultaten van proeven met een inerte stof, indien van toepassing;

—de resultaten van proeven in een inerte atmosfeer, indien van toepassing.

3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN

Een stof wordt aangemerkt als een oxiderende stof wanneer:

a)er in de oriënterende proef een heftige reactie optreedt;

b)in de volledige test de maximale brandsnelheid van de onderzochte mengsels groter is dan of gelijk is aan de maximale brandsnelheid van het referentiemengsel van cellulose en bariumnitraat.

Om vals positieve resultaten te vermijden, dient bij het verwerken van de resultaten ook rekening gehouden te worden met de resultaten verkregen bij het testen van stof gemengd met inert materiaal en/of in een inerte atmosfeer.

4. LITERATUUR

(1) NF T 20-035 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

Aanhangsel

Figuur

Mal en toebehoren voor de bereiding van de rups

(Afmetingen in mm)

image

A.18. AANTALGEMIDDELD MOLECUULGEWICHT EN MOLECUULGEWICHTSVERDELING VAN POLYMEREN

1. METHODE

Deze methode voor gelpermeatiechromatografie is overgenomen van TG 118 van de OESO (1996). Voor de fundamentele beginselen en nadere technische informatie wordt verwezen naar de referenties.

1.1. INLEIDING

Aangezien de eigenschappen van polymeren zo sterk uiteenlopen, is het onmogelijk een enkele methode te beschrijven waarin voor alle mogelijkheden en specifieke gevallen bij de scheiding van polymeren exact de omstandigheden voor scheiding en evaluatie worden aangegeven. Met name complexe polymeersystemen komen vaak niet in aanmerking voor gelpermeatiechromatografie (GPC). Wanneer GPC niet uitvoerbaar is, kan het molecuulgewicht met behulp van andere methoden worden bepaald (zie bijlage). In dat geval moet een gedetailleerde beschrijving van en een volledige motivering voor de gebruikte methode worden gegeven.

De hier beschreven methode is gebaseerd op de norm DIN 55672 (1). Deze norm bevat gedetailleerde informatie over de wijze waarop de experimenten moeten worden uitgevoerd en de gegevens moeten worden geëvalueerd. Wanneer veranderingen in de wijze van uitvoering nodig zijn, moet daarvoor een motivering worden gegeven. Ook andere normen kunnen worden gebruikt, mits de referenties volledig worden vermeld. In de beschreven methode worden voor de kalibratie polystyreenmonsters met een bekende polydispersiteit gebruikt en wijzigingen kunnen nodig zijn om de methode geschikt te maken voor bepaalde polymeren zoals in water oplosbare polymeren en vertakte polymeren met een lange keten.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN

Het aantalgemiddeld molecuulgewicht (Mn) en het gewichtgemiddeld molecuulgewicht (Mw) worden bepaald met behulp van de volgende vergelijkingen:



image

image

waarbij

Hi = de hoogte van het detectorsignaal vanaf de basislijn bij het retentievolume Vi;

Mi = het molecuulgewicht van de polymeerfractie bij het retentievolume Vi;

N = het aantal meetpunten.

De verhouding Mw/Mn is de breedte van de molecuulgewichtsverdeling, die een maat is voor de dispersiteit van het systeem.

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Aangezien GPC een relatieve methode is, moet het systeem worden gekalibreerd. Als standaard worden normaal gesproken fijn verdeelde lineair opgebouwde polystyreenmonsters gebruikt met bekende gemiddelde molecuulgewichten (Mn en Mw) en een bekende molecuulgewichtsverdeling. De kalibratiecurve kan alleen voor de bepaling van het molecuulgewicht van het onbekende monster worden gebruikt als de omstandigheden voor de scheiding van het monster en de standaards op identieke wijze zijn gekozen.

Een tijdens een bepaald experiment vastgesteld verband tussen het molecuulgewicht en het elutievolume is alleen onder de specifieke omstandigheden van dat experiment geldig. Daarbij gaat het vooral om de temperatuur, het oplosmiddel (of het oplosmiddelenmengsel), de omstandigheden tijdens chromatografie en de kolom of het kolomsysteem waarop de scheiding is uitgevoerd.

Een op deze manier bepaald molecuulgewicht van het monster is relatief en wordt beschreven als een „polystyreenequivalent molecuulgewicht”. Dit houdt in dat het molecuulgewicht afhankelijk van de structurele en chemische verschillen tussen het monster en de standaard in meer of mindere mate van de absolute waarde kan afwijken. Als een andere standaard wordt gebruikt, zoals polyethyleenglycol, polyethyleenoxide, polymethylmethacrylaat of polyacrylzuur, moet de reden daarvan worden vermeld.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

Zowel de molecuulgewichtsverdeling van het monster als het gemiddelde molecuulgewicht (Mn of Mw) kan met behulp van GPC worden bepaald. GPC is een speciaal soort vloeistofchromatografie waarbij het monster aan de hand van het hydrodynamische volume van de verschillende bestanddelen wordt gescheiden (2).

De scheiding voltrekt zich tijdens de passage van het monster door een kolom die met een poreus materiaal, meestal een organische gel, is gevuld. Kleine moleculen kunnen de poriën binnendringen, terwijl grote moleculen dit niet kunnen. Grote moleculen volgen dan ook een kortere weg en worden het eerste geëlueerd. Middelgrote moleculen kunnen sommige poriën binnendringen en worden later geëlueerd. De kleinste moleculen, waarvan de gemiddelde hydrodynamische straal kleiner is dan de poriën van de gel, kunnen alle poriën binnendringen. Deze worden het laatst geëlueerd.

In het ideale geval wordt de scheiding uitsluitend door de grootte van het molecuul bepaald, maar enige storing door absorptie-effecten is in de praktijk vrijwel niet te voorkomen. Een ongelijkmatige pakking van de kolom en dode ruimten kunnen de situatie nog ongunstiger maken (2).

Detectie gebeurt aan de hand van bijvoorbeeld de brekingsindex of uv-absorptie en levert een eenvoudige verdelingskromme op. Om echte waarden voor het molecuulgewicht aan de kromme te kunnen toekennen, moet de kolom echter worden gekalibreerd met behulp van polymeren met een bekend molecuulgewicht en liefst een in grote lijnen vergelijkbare structuur, bijvoorbeeld een aantal polystyreenstandaards. Meestal levert dit een gausscurve op, soms met een kleine staart aan de kant van de lage molecuulgewichten, waarbij op de verticale as de geëlueerde hoeveelheid in gewicht wordt uitgezet en op de horizontale as de logaritme van het molecuulgewicht.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

De herhaalbaarheid (relatieve standaardafwijking) van het elutievolume moet beter zijn dan 0,3 %. Indien een chromatogram tijdafhankelijk wordt geëvalueerd en niet aan dit criterium voldoet, moet door correctie met behulp van een interne standaard de vereiste herhaalbaarheid van de analyse worden gewaarborgd (1). De polydispersiteit is afhankelijk van het molecuulgewicht van de standaard. Normale waarden voor polystyreenstandaards zijn:



Mp < 2 000

Mw/Mn < 1,20

2 000 ≤ Mp ≤ 106

Mw/Mn < 1,05

M p > 106

Mw/Mn < 1,20

(Mp is het molecuulgewicht van de standaard bij de top van de piek).

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.1. Bereiding van de polystyreenstandaardoplossingen

De polystyreenstandaard wordt opgelost door deze zorgvuldig te mengen in de gekozen elutievloeistof. Bij de bereiding van de oplossingen moet rekening worden gehouden met de aanbevelingen van de fabrikant.

De concentratie van de standaardoplossingen wordt bepaald aan de hand van verschillende factoren, zoals het geïnjecteerde volume, de viscositeit van de oplossing en de gevoeligheid van de detector. Het maximale geïnjecteerde volume moet aan de lengte van de kolom worden aangepast om overlading te voorkomen. Voor een scheiding met behulp van GPC over een kolom van 30 cm × 7,8 mm wordt meestal een volume van 40 tot 100 μl geïnjecteerd. Grotere volumes zijn mogelijk, maar niet groter dan 250 μl. De optimale verhouding tussen het geïnjecteerde volume en de concentratie moet vóór de kalibratie van de kolom worden bepaald.

1.6.2. Bereiding van de monsteroplossing

In beginsel gelden voor de bereiding van de monsteroplossingen dezelfde eisen. Het monster wordt door zorgvuldig schudden opgelost in een geschikt oplosmiddel, bijvoorbeeld tetrahydrofuraan (THF). Het mag in geen geval met behulp van een ultrasoon bad worden opgelost. Indien nodig, wordt de monsteroplossing gezuiverd over een membraanfilter met een poriegrootte tussen 0,2 en 2 μm.

Indien de oplossing onopgeloste deeltjes bevat, moet dit in het eindverslag worden vermeld, aangezien deze door hoogmoleculaire bestanddelen kunnen ontstaan. Er moet aan adequate methode worden gebruikt om het gewichtspercentage van de onopgeloste deeltjes te bepalen. De oplossingen moeten binnen 24 uur worden gebruikt.

1.6.3. Apparatuur

—oplosmiddelreservoir

—ontgasser (indien van toepassing)

—pomp

—pulsdemper (indien van toepassing)

—injectiesysteem

—chromatografiekolommen

—detector

—stromingsmeter (indien van toepassing)

—gegevensrecorder/verwerker

—afvalreservoir

Er moet voor worden gezorgd dat het GPC-systeem niet met de gebruikte oplosmiddelen reageert (bijvoorbeeld door stalen capillairen te gebruiken voor THF-oplossingen).

1.6.4. Injectie- en oplosmiddeltoevoersysteem

Een bekend volume van de monsteroplossing wordt met behulp van een autosampler of manueel in een scherp begrensde zone op de kolom gebracht. Wanneer bij manueel opbrengen de plunjer van de injectiespuit te snel wordt ingedrukt of teruggetrokken, kan dit tot veranderingen in de waargenomen molecuulgewichtsverdeling leiden. Het oplosmiddeltoevoersysteem moet voorzover mogelijk pulsatievrij zijn en liefst een pulsdemper bevatten. De stroomsnelheid moet ongeveer 1 ml/min zijn.

1.6.5. Kolom

Afhankelijk van het monster wordt het polymeer gekarakteriseerd met behulp van één kolom of een aantal in serie gekoppelde kolommen. In de handel zijn verschillende poreuze pakkingsmaterialen met bekende eigenschappen (bijvoorbeeld poriegrootte en exclusiegrens) verkrijgbaar. De keuze van de gel en de lengte van de kolom wordt bepaald door zowel de eigenschappen van het monster (hydrodynamisch volume, molecuulgewichtsverdeling) als de specifieke omstandigheden voor de scheiding zoals oplosmiddel, temperatuur en stroomsnelheid (1)(2)(3).

1.6.6. Theoretische schotels

De voor de scheiding gebruikte kolom of combinatie van kolommen moet worden gekarakteriseerd met behulp van het aantal theoretische schotels. Daartoe moet, indien THF als elutievloeistof wordt gebruikt, een oplossing van ethylbenzeen of een andere geschikte apolaire stof op een kolom met een bekende lengte worden gebracht. Het aantal theoretische schotels wordt berekend met de volgende vergelijking:



image

of

image

waarbij:

N

=

het aantal theoretische schotels;

Vc

=

het elutievolume bij de top van de piek;

W

=

de piekbreedte aan de basis;

Wl/2

=

de piekbreedte op halve hoogte.

1.6.7. Scheidend vermogen

Naast het aantal theoretische schotels, een grootheid die bepalend is voor de bandbreedte, speelt ook het scheidend vermogen, dat wordt bepaald door de helling van de kalibratiecurve, een rol. Het scheidend vermogen van een kolom kan als volgt worden bepaald:

image

waarbij:

Ve, Mx

=

het elutievolume voor polystyreen met molecuulgewicht Mx;

Ve,(10Mx)

=

het elutievolume voor polystyreen met een tien keer zo hoog molecuulgewicht.

De resolutie van het systeem wordt meestal als volgt gedefinieerd:

image

waarbij:

Vel, Ve2

=

het elutievolume van de twee polystyreenstandaards bij de top van de piek;

Wl' W2

=

die piekbreedte aan de basis;

M1, M2

=

het molecuulgewicht bij de top van de pieken (deze moeten een factor 10 van elkaar verschillen).

De R-waarde voor het kolomsysteem moet groter zijn dan 1,7 (4).

1.6.8. Oplosmiddelen

Alle oplosmiddelen moeten zeer zuiver zijn (THF wordt gebruikt met een zuiverheid van 99,5 %). Het oplosmiddelreservoir (indien nodig onder inert gas) moet groot genoeg zijn voor de kalibratie van de kolom en de analyse van verschillende monsters. Het oplosmiddel moet worden ontgast voordat het via de pomp naar de kolom wordt getransporteerd.

1.6.9. Temperatuurbewaking

De temperatuur van de kritische interne onderdelen (injectieblok, kolommen, detector en leidingen) moet constant zijn en in overeenstemming zijn met het gekozen oplosmiddel.

1.6.10. Detector

De detector is bedoeld om de concentratie van het monster in het eluaat uit de kolom kwantitatief te registreren. Om een onnodige verbreding van de pieken te voorkomen, moet het volume van de meetcel van de detector zo klein mogelijk worden gehouden. Het volume mag niet groter zijn dan 10 μl, behalve voor lichtverstrooiings- en viscositeitsdetectoren. Meestal wordt voor de detectie differentiële refractometrie gebruikt. Indien dit in verband met de specifieke eigenschappen van het monster of de elutievloeistof nodig is, kunnen echter ook andere soorten detectors worden gebruikt, zoals UV/VIS, IR of viscositeitsdetectoren.

2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE

2.1. GEGEVENS

Voor de gedetailleerde beoordelingscriteria en voor de eisen ten aanzien van het verzamelen en bewerken van de gegevens wordt verwezen naar de DIN-norm (1).

Voor elk monster moeten twee onafhankelijke experimenten worden uitgevoerd die los van elkaar moeten worden geanalyseerd.

Voor elke meting moet de waarde van Mn, MR, Mw/Mn en M worden vermeld. Daarbij moet expliciet worden vermeld dat de gemeten waarden relatief zijn en worden uitgedrukt in equivalent-molecuulgewicht van de gebruikte standaard.

Na de bepaling van de retentievolumes of de retentietijden (eventueel gecorrigeerd met behulp van een interne standaard) wordt de logaritmische waarde van M (waarbij M de top van de piek van de kalibratiestandaard is) tegen een van deze grootheden uitgezet. Per log-interval zijn minimaal twee kalibratiepunten nodig en voor de curve als geheel minimaal vijf meetpunten. Het geraamde molecuulgewicht van het monster moet tussen het eerste en het laatste meetpunt liggen. Voor de bepaling van het laagste molecuulgewicht van de kalibratiecurve wordt een oplossing van n-hexylbenzeen of een andere geschikte apolaire stof gebruikt. Het aantalgemiddelde en het gewichtgemiddelde molecuulgewicht worden meestal aan de hand van de bij punt 1.2 vermelde vergelijkingen met behulp van een computer bepaald. Wanneer de digitalisering met de hand gebeurt, kan ASTM D 3536-91 (3) worden geraadpleegd.

De verdelingskromme moet in de vorm van een tabel of als figuur (al dan niet cumulatieve frequentieverdeling tegen log M) worden verstrekt. Bij de grafische weergave moet één log-interval van het molecuulgewicht normaal gesproken ongeveer 4 cm breed zijn en moet de top van de piek ongeveer 8 cm hoog zijn. Bij een cumulatieve frequentieverdeling moet het verschil op de y-as tussen 0 en 100 % ongeveer 10 cm zijn.

2.2. TESTVERSLAG

Het testverslag moet de volgende informatie bevatten:

2.2.1. Onderzochte stof:

—beschikbare informatie over de onderzochte stof (identiteit, additieven, verontreinigingen);

—beschrijving van de behandeling van het monster, opmerkingen, problemen.

2.2.2. Apparatuur:

—elutievloeistofreservoir, inert gas, ontgassing van de elutievloeistof, samenstelling van de elutievloeistof, verontreinigingen;

—pomp, pulsdemper, injectiesysteem;

—scheidingskolommen (fabrikant, alle informatie over de kenmerken van de kolommen zoals poriegrootte en aard van het pakkingsmateriaal, aantal, lengte en volgorde van de gebruikte kolommen);

—aantal theoretische schotels van de kolom (of de combinatie), scheidend vermogen (resolutie van het systeem);

—informatie over de symmetrie van de pieken;

—kolomtemperatuur, aard van de temperatuurregeling;

—detector (meetprincipe, type, volume van de meetcel);

—stromingsmeter, indien gebruikt (fabrikant, meetprincipe);

—systeem voor gegevensregistratie en -verwerking (hardware en software).

2.2.3. Kalibratie van het systeem:

—gedetailleerde beschrijving van de methode die wordt gebruikt om de kalibratiecurve samen te stellen;

—informatie over de kwaliteitscriteria voor deze methode (bijvoorbeeld correlatiecoëfficiënt of som van de kwadraten).

—informatie over alle extrapolaties, veronderstellingen en benaderingen tijdens de experimentele procedure en de beoordeling en verwerking van gegevens.

—alle metingen die voor de samenstelling van de kalibratiecurve worden gebruik, moeten in een tabel worden opgenomen waarbij voor elk kalibratiepunt de volgende informatie moet worden vermeld:

—naam van het monster;

—fabrikant van het monster;

—normale waarden van Mp, Mn, Mw en Mw/Mn, zoals deze door de fabrikant zijn verstrekt of door latere metingen zijn bepaald, alsmede gedetailleerde informatie over de bepalingsmethode;

—geïnjecteerd volume en concentratie daarin;

—voor kalibratie gebruikte waarde van Mp;

—bij de top van de piek gemeten elutievolume of gecorrigeerde retentietijd;

—bij de top van de piek berekende Mp;

—procentuele fout van berekende Mp en de kalibratiewaarde.

2.2.4. Evaluatie:

—evaluatie op basis van tijd: methoden die worden gebruikt om de vereiste reproduceerbaarheid te waarborgen (correctiemethode, interne standaard enz.);

—informatie over de keuze voor elutievolume of retentietijd als basis voor de evaluatie;

—informatie over de grenzen van de evaluatie als een piek niet volledig wordt geanalyseerd;

—beschrijving van afvlakmethoden indien deze zijn gebruikt;

—procedures voor de bereiding en voorbehandeling van het monster;

—eventuele aanwezigheid van onopgeloste deeltjes;

—geïnjecteerd volume (μl) en concentratie daarin (mg/ml);

—bespreking van effecten die tot afwijkingen van het ideale GPC-profiel leiden;

—gedetailleerde beschrijving van alle wijzigingen in de testprocedures;

—gedetailleerde informatie over de foutintervallen;

—alle andere informatie en opmerkingen die relevant zijn voor de interpretatie van de resultaten.

3. REFERENTIES

(1)DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

(2)Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

(3)ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4)ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Aanhangsel

Voorbeelden van andere methoden voor de bepaling van het aantalgemiddelde molecuulgewicht (Mn) van polymeren

Gelpermeatiechromatografie (GPC) geniet de voorkeur als methode voor de bepaling van Mn, vooral wanneer er verschillende standaards beschikbaar zijn waarvan de structuur vergelijkbaar is met die van het polymeer. Wanneer het gebruik van GPC praktische problemen oplevert of reeds wordt vermoed dat de stof niet aan een criterium voor Mn in de regelgeving zal voldoen (en dit vermoeden moet worden bevestigd), zijn echter andere methoden beschikbaar:

1. Gebruik van colligatieve eigenschappen

1.1.Ebullioscopie/Cryoscopie:

Hierbij wordt de kookpuntverhoging (ebullioscopie) of vriespuntverlaging (cryoscopie) van een oplosmiddel na toevoeging van het polymeer gemeten. Bij deze methode wordt gebruik gemaakt van het feit dat het effect van het opgeloste polymeer op het kookpunt/vriespunt van de vloeistof afhankelijk is van het molecuulgewicht van het polymeer (1)(2).

Toepasbaarheid: Mn < 20 000.

1.2.Dampspanningsverlaging:

Hierbij wordt de dampspanning van een gekozen referentievloeistof voor en na toevoeging van bekende hoeveelheden polymeer gemeten (1)(2).

Toepasbaarheid: Mn < 20 000 (theoretisch; in de praktijk is de bruikbaarheid van deze methode beperkt).

1.3.Membraan-osmometrie:

Berust op osmose, d.w.z. de natuurlijke neiging van moleculen van oplosmiddelen om zich via een semipermeabel membraan van een verdunde naar een geconcentreerde oplossing te verplaatsen om een evenwicht te bereiken. In dit geval bevat de verdunde oplossing geen polymeer en de geconcentreerde oplossing wel. Doordat het oplosmiddel door het membraan wordt getrokken, ontstaat een drukverschil dat afhankelijk is van de concentratie en het molecuulgewicht van het polymeer (1)(3)(4).

Toepasbaarheid: 20 000 < Mn < 200 000.

1.4.Dampfase-osmometrie:

Hierbij wordt de verdampingssnelheid van een zuivere oplosmiddelaërosol vergeleken met die van ten minste drie aerosolen die verschillende concentraties polymeer bevatten (1)(5)(6).

Toepasbaarheid: Mn <20 000.

2. Eindgroepanalyse

Om deze methode te kunnen gebruiken is kennis nodig omtrent zowel de algehele structuur van het polymeer als de aard van de eindgroepen die de ketens afsluiten (deze moeten met behulp van bijvoorbeeld NMR of titratie/derivatisering van de hoofdketen kunnen worden onderscheiden). Wanneer de concentratie van de eindgroepen in het polymeermolecuul wordt bepaald, kan op grond daarvan een waarde voor het molecuulgewicht worden afgeleid (7)(8)(9).

Toepasbaarheid: Mn tot 50 000 (met afnemende betrouwbaarheid).

Referenties

(1)Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn, John Wiley, New York.

(2)Glover, CA, (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr.ed., Marcel Dekker, New York.

(3)ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4)Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25-52.

(5)ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(6)Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.

(7)Schröder, E., Muller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.

(8)Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.

(9)Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

A.19. GEHALTE VAN POLYMEREN AAN LAAGMOLECULAIRE BESTANDDELEN

1. METHODE

Deze methode voor gelpermeatiechromatografie is overgenomen van TG 119 van de OESO (1996). Voor de fundamentele beginselen en nadere technische informatie wordt verwezen naar de referenties.

1.1. INLEIDING

Aangezien de eigenschappen van polymeren zo sterk uiteenlopen, is het onmogelijk een enkele methode te beschrijven waarin voor alle mogelijkheden en specifieke gevallen bij de scheiding van polymeren exact de omstandigheden voor scheiding en evaluatie worden aangegeven. Met name complexe polymeersystemen komen vaak niet in aanmerking voor gelpermeatiechromatografie (GPC). Wanneer GPC niet uitvoerbaar is, kan het molecuulgewicht met behulp van andere methoden worden bepaald (zie bijlage). In dat geval moet een gedetailleerde beschrijving van en een volledige motivering voor de gebruikte methode worden gegeven.

De hier beschreven methode is gebaseerd op de norm DIN 55672 (1). Deze norm bevat gedetailleerde informatie over de wijze waarop de experimenten moeten worden uitgevoerd en de gegevens moeten worden geëvalueerd. Wanneer veranderingen in de wijze van uitvoering nodig zijn, moet daarvoor een motivering worden gegeven. Ook andere normen kunnen worden gebruikt, mits de referenties volledig worden vermeld. In de beschreven methode worden voor de kalibratie polystyreenmonsters met een bekende polydispersiteit gebruikt en wijzigingen kunnen nodig zijn om de methode geschikt te maken voor bepaalde polymeren zoals in water oplosbare polymeren en vertakte polymeren met een lange keten.

1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN

Een laag molecuulgewicht wordt hier willekeurig gedefinieerd als een molecuulgewicht beneden 1 000 dalton.

Het aantalgemiddelde molecuulgewicht (Mn) en het gewichtgemiddelde molecuulgewicht (Mw) worden bepaald met behulp van de volgende vergelijkingen:



image

image

waarbij:

Hi

=

de hoogte van het detectorsignaal vanaf de basislijn bij het retentievolume Vi;

Mi

=

het molecuulgewicht van de polymeerfractie bij het retentievolume Vi;

n

=

het aantal meetpunten.

De verhouding Mw/Mn is de breedte van de molecuulgewichtsverdeling, die een maat is voor de dispersiteit van het systeem.

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Aangezien GPC een relatieve methode is, moet het systeem worden gekalibreerd. Als standaard worden normaal gesproken fijn verdeelde lineair opgebouwde polystyreenmonsters gebruikt met bekende gemiddelde molecuulgewichten (Mn en Mw) en een bekende molecuulgewichtsverdeling. De kalibratiecurve kan alleen voor de bepaling van het molecuulgewicht van het onbekende monster worden gebruikt als de omstandigheden voor de scheiding van het monster en de standaards op identieke wijze zijn gekozen.

Een tijdens een bepaald experiment vastgesteld verband tussen het molecuulgewicht en het elutievolume is alleen onder de specifieke omstandigheden van dat experiment geldig. Daarbij gaat het vooral om de temperatuur, het oplosmiddel (of het oplosmiddelenmengsel), de omstandigheden tijdens chromatografie en de kolom of het kolomsysteem waarop de scheiding is uitgevoerd.

Een op deze manier bepaald molecuulgewicht van het monster is relatief en wordt beschreven als een „polystyreen-equivalent molecuulgewicht”. Dit houdt in dat het molecuulgewicht afhankelijk van de structurele en chemische verschillen tussen het monster en de standaard in meer of mindere mate van de absolute waarde kan afwijken. Als een andere standaard wordt gebruikt, zoals polyethyleenglycol, polyethyleenoxide, polymethylmethacrylaat of polyacrylzuur, moet de reden daarvan worden vermeld.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

Zowel de molecuulgewichtsverdeling van het monster als het gemiddelde molecuulgewicht (Mn of Mw) kan met behulp van GPC worden bepaald. GPC is een speciaal soort vloeistofchromatografie waarbij het monster aan de hand van het hydrodynamische volume van de verschillende bestanddelen wordt gescheiden (2).

De scheiding voltrekt zich tijdens de passage van het monster door een kolom die met een poreus materiaal, meestal een organische gel, is gevuld. Kleine moleculen kunnen de poriën binnendringen, terwijl grote moleculen dit niet kunnen. Grote moleculen volgen dan ook een kortere weg en worden het eerste geëlueerd. Middelgrote moleculen kunnen sommige poriën binnendringen en worden later geëlueerd. De kleinste moleculen, waarvan de gemiddelde hydrodynamische straal kleiner is dan de poriën van de gel, kunnen alle poriën binnendringen. Deze worden het laatst geëlueerd.

In het ideale geval wordt de scheiding uitsluitend door de grootte van het molecuul bepaald, maar enige storing door absorptie-effecten is in de praktijk vrijwel niet te voorkomen. Een ongelijkmatige pakking van de kolom en dode ruimten kunnen de situatie nog ongunstiger maken (2).

Detectie gebeurt aan de hand van bijvoorbeeld de brekingsindex of uv-absorptie en levert een eenvoudige verdelingskromme op. Om echte waarden voor het molecuulgewicht aan de kromme te kunnen toekennen, moet de kolom echter worden gekalibreerd met behulp van polymeren met een bekend molecuulgewicht en liefst een in grote lijnen vergelijkbare structuur, bijvoorbeeld een aantal polystyreenstandaards. Meestal levert dit een gausscurve op, soms met een kleine staart aan de kant van de lage molecuulgewichten, waarbij op de verticale as de geëlueerde hoeveelheid in gewicht wordt uitgezet en op de horizontale as de logaritme van het molecuulgewicht.

Het gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen wordt uit deze kromme afgeleid. De kalibratie kan alleen nauwkeurig zijn als de respons van de laagmoleculaire bestanddelen per massa-eenheid equivalent is met die van het polymeer als geheel.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

De herhaalbaarheid (relatieve standaardafwijking) van het elutievolume moet beter zijn dan 0,3 %. Indien een chromatogram tijdafhankelijk wordt geëvalueerd en niet aan dit criterium voldoet, moet door correctie met behulp van een interne standaard de vereiste herhaalbaarheid van de analyse worden gewaarborgd (1). De polydispersiteit is afhankelijk van het molecuulgewicht van de standaard. Normale waarden voor polystyreenstandaards zijn:



Mp < 2 000

Mw/Mn < 1,20

2 000 ≤ Mp ≤ 106

Mw/Mn < 1,05

Mp > 106

Mw/Mn < 1,20

(Mp is het molecuulewicht van de standaard bij de top van de piek.)

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.1. Bereiding van de polystyreenstandaardoplossingen

De polystyreenstandaard wordt opgelost door deze zorgvuldig te mengen in de gekozen elutievloeistof. Bij de bereiding van de oplossingen moet rekening worden gehouden met de aanbevelingen van de fabrikant.

De concentratie van de standaardoplossingen wordt bepaald aan de hand van verschillende factoren, zoals het geïnjecteerde volume, de viscositeit van de oplossing en de gevoeligheid van de detector. Het maximale geïnjecteerde volume moet aan de lengte van de kolom worden aangepast om overlading te voorkomen. Voor een scheiding met behulp van GPC over een kolom van 30 cm × 7,8 mm wordt meestal een volume van 40 tot 100 μl geïnjecteerd. Grotere volumes zijn mogelijk, maar niet groter dan 250 μl. De optimale verhouding tussen het geïnjecteerde volume en de concentratie moet vóór de kalibratie van de kolom worden bepaald.

1.6.2. Bereiding van de monsteroplossing

In beginsel gelden voor de bereiding van de monsteroplossingen dezelfde eisen. Het monster wordt door zorgvuldig schudden opgelost in een geschikt oplosmiddel, bijvoorbeeld tetrahydrofuraan (THF). Het mag in geen geval met behulp van een ultrasoon bad worden opgelost. Indien nodig wordt de monsteroplossing gezuiverd over een membraanfilter met een poriegrootte tussen 0,2 en 2 μm.

Indien de oplossing onopgeloste deeltjes bevat, moet dit in het eindverslag worden vermeld aangezien deze door hoogmoleculaire bestanddelen kunnen ontstaan. Er moet een adequate methode worden gebruikt om het gewichtspercentage van de onopgeloste deeltjes te bepalen. De oplossingen moeten binnen 24 uur worden gebruikt.

1.6.3. Correctie voor het gehalte aan verontreinigingen en additieven

Meestal moet het gehalte aan bestanddelen met M < 1 000 worden gecorrigeerd voor de bijdrage van niet polymeerspecifieke componenten (zoals verontreinigingen en/of additieven), tenzij het gemeten gehalte al lager is dan 1 %. Dit gebeurt door een directe analyse van de polymeeroplossing of van het GPC-eluaat.

Wanneer het eluaat na de passage door de kolom te verdund is om nog te worden geanalyseerd, moet het worden geconcentreerd. Daarbij kan het nodig zijn het eluaat droog te dampen en vervolgens weer op te lossen. Het concentreren van het eluaat moet onder zodanige omstandigheden gebeuren dat wordt gewaarborgd dat er geen veranderingen in het eluaat optreden. De behandeling van het eluaat na GPC is afhankelijk van de analysemethode die voor de kwantitatieve bepaling wordt gebruikt.

1.6.4. Apparatuur

De GPC-apparatuur bestaat uit de volgende onderdelen:

—oplosmiddelreservoir

—ontgasser (indien van toepassing)

—pomp

—pulsdemper (indien van toepassing)

—injectiesysteem

—chromatografiekolommen

—detector

—stromingsmeter (indien van toepassing)

—gegevensrecorder/verwerker

—afvalreservoir

Er moet voor worden gezorgd dat het GPC-systeem niet met de gebruikte oplosmiddelen reageert (bijvoorbeeld door stalen capillairen te gebruiken voor THF-opIossingen).

1.6.5. Injectie- en oplosmiddeltoevoersysteem

Een bekend volume van de monsteroplossing wordt met behulp van een autosampler of manueel in een scherp begrensde zone op de kolom gebracht. Wanneer bij manueel opbrengen de plunjer van de injectiespuit te snel wordt ingedrukt of teruggetrokken, kan dit tot veranderingen in de waargenomen molecuulgewichtsverdeling leiden. Het oplosmiddeltoevoersysteem moet voor zover mogelijk pulsatievrij zijn en liefst een pulsdemper bevatten. De stroomsnelheid moet ongeveer 1 ml/min zijn.

1.6.6. Kolom

Afhankelijk van het monster wordt het polymeer gekarakteriseerd met behulp van één kolom of een aantal in serie gekoppelde kolommen. In de handel zijn verschillende poreuze pakkingsmaterialen met bekende eigenschappen (bijvoorbeeld poriegrootte en exclusiegrens) verkrijgbaar. De keuze van de gel en de lengte van de kolom wordt bepaald door zowel de eigenschappen van het monster (hydrodynamisch volume, molecuulgewichtsverdeling) als de specifieke omstandigheden voor de scheiding zoals oplosmiddel, temperatuur en stroomsnelheid (1)(2)(3).

1.6.7. Theoretische schotels

De voor de scheiding gebruikte kolom of combinatie van kolommen moet worden gekarakteriseerd met behulp van het aantal theoretische schotels. Daartoe moet, indien THF als elutievloeistof wordt gebruikt, een oplossing van ethylbenzeen of een andere geschikte apolaire stof op een kolom met een bekende lengte worden gebracht. Het aantal theoretische schotels wordt berekend met de volgende vergelijking:



image

of

image

waarbij:

N

=

het aantal theoretische schotels;

Ve

=

het elutievolume bij de top van de piek;

W

=

de piekbreedte aan de basis;

W1/2

=

de piekbreedte op halve hoogte.

1.6.8. Scheidend vermogen

Naast het aantal theoretische schotels, een grootheid die bepalend is voor de bandbreedte, speelt ook het scheidend vermogen, dat wordt bepaald door de helling van de kalibratiecurve, een rol. Het scheidend vermogen van een kolom kan als volgt worden bepaald:

image

waarbij:

Ve, Mr

=

het elutievolume voor polystyreen met molecuulgewicht Mx;

Ve,(10.Mr)

=

het elutievolume voor polystyreen met een tien keer zo hoog molecuulgewicht.

De resolutie van het systeem wordt meestal als volgt gedefinieerd:

image

waarbij:

Ve1, Ve2

=

het elutievolume van de twee polystyreenstandaards bij de top van de piek;

W1, W2

=

de piekbreedte aan de basis;

M1, M2

=

het molecuulgewicht bij de top van de pieken (deze moeten een factor 10 van elkaar verschillen).

De R-waarde voor het kolomsysteem moet groter zijn dan 1,7 (4).

1.6.9. Oplosmiddelen

Alle oplosmiddelen moeten zeer zuiver zijn (THF wordt gebruikt met een zuiverheid van 99,5 %). Het oplosmiddelreservoir (indien nodig onder inert gas) moet groot genoeg zijn voor de kalibratie van de kolom en de analyse van verschillende monsters. Het oplosmiddel moet worden ontgast voordat het via de pomp naar de kolom wordt getransporteerd.

1.6.10. Temperatuurbewaking

De temperatuur van de kritische interne onderdelen (injectieblok, kolommen, detector en leidingen) moet constant zijn en in overeenstemming zijn met het gekozen oplosmiddel.

1.6.11. Detector

De detector is bedoeld om de concentratie van het monster in het eluaat uit de kolom kwantitatief te registreren. Om een onnodige verbreding van de pieken te voorkomen, moet het volume van de meetcel van de detector zo klein mogelijk worden gehouden. Het volume mag niet groter zijn dan 10 μl, behalve voor lichtverstrooiings- en viscositeitsdetectoren. Meestal wordt voor de detectie differentiële refractometrie gebruikt. Indien dit in verband met de specifieke eigenschappen van het monster of de elutievloeistof nodig is, kunnen echter ook andere soorten detectors worden gebruikt, zoals UV/VIS, IR of viscositeitsdetectoren.

2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE

2.1. GEGEVENS

Voor de gedetailleerde beoordelingscriteria en voor de eisen ten aanzien van het verzamelen en bewerken van de gegevens wordt verwezen naar de DIN-norm (1).

Voor elk monster moeten twee onafhankelijke experimenten worden uitgevoerd die los van elkaar moeten worden geanalyseerd. Het is van essentieel belang dat in alle gevallen onder dezelfde omstandigheden als de bepaling bij het monster ook een blancobepaling wordt uitgevoerd.

Er moet expliciet worden vermeld dat de gemeten waarden relatief zijn en worden uitgedrukt in equivalent-molecuulgewicht van de gebruikte standaard.

Na de bepaling van de retentievolumes of de retentietijden (eventueel gecorrigeerd met behulp van een interne standaard) wordt de logaritmische waarde van M (waarbij M de top van de piek van de kalibratiestandaard is) tegen een van deze grootheden uitgezet. Per log-interval zijn minimaal twee kalibratiepunten nodig en voor de curve als geheel minimaal vijf meetpunten. Het geraamde molecuulgewicht van het monster moet tussen het eerste en het laatste meetpunt liggen. Voor de bepaling van het laagste molecuulgewicht van de kalibratiecurve wordt een oplossing van n-hexylbenzeen of een andere geschikte apolaire stof gebruikt. Het gedeelte van de curve dat overeenkomt met molecuul-gewichten lager dan 1 000 wordt indien nodig gecorrigeerd voor verontreinigingen en additieven. De evaluatie van de elutiecurves gebeurt meestal met behulp van elektronische gegevensverwerking. Wanneer de digitalisering met de hand gebeurt, kan ASTM D 3536-91 (3) worden geraadpleegd.

Als er onoplosbaar polymeer op de kolom achterblijft, zal dit waarschijnlijk een hoger molecuulgewicht hebben dan de opgeloste fractie en als daar geen rekening mee wordt gehouden, zou het gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen waarschijnlijk te hoog uitvallen. In de bijlage worden richtsnoeren gegeven om het gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen te corrigeren voor de aanwezigheid van onoplosbaar polymeer.

De verdelingskromme moet in de vorm van een tabel of als figuur (al dan niet cumulatieve frequentieverdeling tegen log M) worden verstrekt. Bij de grafische weergave moet één log-interval van het molecuulgewicht normaal gesproken ongeveer 4 cm breed zijn en moet de top van de piek ongeveer 8 cm hoog zijn. Bij een cumulatieve frequentieverdeling moet het verschil op de y-as tussen 0 en 100 % ongeveer 10 cm zijn.

2.2. TESTVERSLAG

Het testverslag moet de volgende informatie bevatten:

2.2.1. Onderzochte stof:

—beschikbare informatie over de onderzochte stof (identiteit, additieven, verontreinigingen);

—beschrijving van de behandeling van het monster, opmerkingen, problemen.

2.2.2. Apparatuur:

—elutievloeistofreservoir, inert gas, ontgassing van de elutievloeistof, samenstelling van de elutievloeistof, verontreinigingen;

—pomp, pulsdemper, injectiesysteem;

—scheidingskolommen (fabrikant, alle informatie over de kenmerken van de kolommen zoals poriegrootte en aard van het pakkingsmateriaal, aantal, lengte en volgorde van de gebruikte kolommen);

—aantal theoretische schotels van de kolom (of de combinatie), scheidend vermogen (resolutie van het systeem);

—informatie over de symmetrie van de pieken;

—kolomtemperatuur, aard van de temperatuurregeling;

—detector (meetprincipe, type, volume van de meetcel);

—stromingsmeter, indien gebruikt (fabrikant, meetprincipe);

—systeem voor gegevensregistratie en -verwerking (hardware en software).

2.2.3. Kalibratie van het systeem:

—gedetailleerde beschrijving van de methode die wordt gebruikt om de kalibratiecurve samen te stellen;

—informatie over de kwaliteitscriteria voor deze methode (bijvoorbeeld correlatiecoëfficiënt of som van de kwadraten);

—informatie over alle extrapolaties, veronderstellingen en benaderingen tijdens de experimentele procedure en de beoordeling en verwerking van gegevens;

—alle metingen die voor de samenstelling van de kalibratiecurve worden gebruikt, moeten in een tabel worden opgenomen waarbij voor elk kalibratiepunt de volgende informatie moet worden vermeld:

—naam van het monster;

—fabrikant van het monster;

—normale waarden van Mp, Mn, Mw en Mw/Mn, zoals deze door de fabrikant zijn verstrekt of door latere metingen zijn bepaald, alsmede gedetailleerde informatie over de bepalingsmethode;

—geïnjecteerd volume en concentratie daarin;

—voor kalibratie gebruikte waarde van M;

—bij de top van de piek gemeten elutievolume of gecorrigeerde retentietijd;

—bij de top van de piek berekende Mp;

—procentuele fout van berekende M en de kalibratiewaarde.

2.2.4. Informatie over het gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen:

—beschrijving van de bij de analyse gebruikte methoden en de wijze waarop de experimenten zijn uitgevoerd;

—informatie over het gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen (als gewichtspercentage van het totale monster);

—informatie over het gehalte aan verontreinigingen, additieven en andere niet-polymeerbestanddelen (als gewichtspercentage van het totale monster).

2.2.5. Evaluatie:

—evaluatie op basis van tijd: alle methoden die worden gebruikt om de vereiste reproduceerbaarheid te waarborgen (correctiemethode, interne standaard enz.);

—informatie over de keuze voor elutievolume of retentietijd als basis voor de evaluatie;

—informatie over de grenzen van de evaluatie als een piek niet volledig wordt geanalyseerd;

—beschrijving van afvlakmethoden indien deze zijn gebruikt;

—procedures voor de bereiding en voorbehandeling van het monster;

—eventuele aanwezigheid van onopgeloste deeltjes;

—geïnjecteerd volume (μl) en concentratie daarin (mg/ml);

—bespreking van effecten die tot afwijkingen van het ideale GPC-profiel leiden;

—gedetailleerde beschrijving van alle wijzigingen in de testprocedures;

—gedetailleerde informatie over de foutintervallen;

—alle andere informatie en opmerkingen die relevant zijn voor de interpretatie van de resultaten.

3. REFERENTIES

(1)DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

(2)Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

(3)ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography — GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4)ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polysryrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Aanhangsel

Richtsnoeren om het gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen te corrigeren voor de aanwezigheid van onoplosbaar polymeer

Wanneer een monster onoplosbaar polymeer bevat, gaat tijdens de GPC-analyse massa verloren. Het onoplosbare polymeer blijft irreversibel op de kolom of het monsterfilter achter, terwijl het oplosbare gedeelte van het monster door de kolom loopt. Wanneer de stijging van de brekingsindex (dn/dc) van het polymeer kan worden geschat of gemeten, kan de massa van de hoeveelheid monster die op de kolom verloren is gegaan, worden geschat. In dat geval wordt de correctie bepaald met behulp van een externe kalibratie met standaardmaterialen met een bekende concentratie en dn/dc om de respons van de refractometer te kalibreren. In het hier gegeven voorbeeld wordt een PMM-standaard (polymethylmethacrylaat) gebruikt.

Bij de externe kalibratie voor de analyse van acrylpolymeren wordt een PMM-standaard met een bekende concentratie in tetrahydrofuraan met behulp van GPC geanalyseerd en worden de resultaten gebruikt voor de bepaling van de refractometerconstante volgens de volgende vergelijking:

K = R/(C × V × dn/dc)

waarbij

K

=

de refractometerconstante (in microvoltseconde/ml);

R

=

de respons van de PMM-standaard (in microvoltseconde);

C

=

de concentratie van de PMM-standaard (in mg/ml);

V

=

het geïnjecteerde volume (in ml);

dn/dc

=

de stijging van de brekingsindex voor PMM in tetrahydrofuraan (in ml/mg).

Normale waarden voor een PMM-standaard zijn:

R

=

2 937 891;

C

=

1,07 mg/ml;

V

=

0,1 ml;

dn/dc

=

9 × 10-5 ml/mg.

Met de aldus berekende waarde van K (3,05 × 1011) wordt vervolgens de theoretische respons van de detector berekend als het geïnjecteerde polymeer voor 100 % via de detector zou zijn geëlueerd.

A.20. OPLOS/EXTRACTIEGEDRAG VAN POLYMEREN IN WATER

1. METHODE

De hier beschreven methode is overgenomen van de herziene versie van TG 120 van de OESO (1997). Voor nadere technische informatie wordt verwezen naar referentie (1).

1.1. INLEIDING

Voor bepaalde polymeren (bijvoorbeeld emulsiepolymeren) moeten eerst voorbereidende werkzaamheden worden uitgevoerd voordat de hier beschreven methode kan worden toegepast. De methode kan niet worden gebruikt voor vloeibare polymeren en voor polymeren die onder de testomstandigheden met water reageren.

Wanneer de methode niet geschikt of niet bruikbaar is, kan het oplos/extractiegedrag met behulp van andere methoden worden onderzocht. In dat geval moet een gedetailleerde beschrijving van en een volledige motivering voor de gebruikte methode worden gegeven.

1.2. REFERENTIESTOFFEN

Geen.

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

Het oplos/extractiegedrag van polymeren in waterig milieu wordt bepaald met behulp van de kolfmethode (zie methode A.6: Oplosbaarheid in water, methode met de kolf) waarin onderstaande wijzigingen worden aangebracht.

1.4. KWALITEITSCRITERIA

Geen.

1.5. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.5.1. Apparatuur

Voor deze methode is de volgende apparatuur nodig:

—een vergruizer, bijvoorbeeld een maalapparaat, om deeltjes met een bekende grootte te vervaardigen;

—een schudapparaat met regelbare temperatuur;

—een membraanfiltersysteem;

—adequate analyseapparatuur;

—gestandaardiseerde zeven.

1.5.2. Monstervoorbereiding

Een representatief monster moet eerst worden vergruisd tot deeltjes met een grootte van 0,125 tot 0,25 mm (gebruik hierbij geschikte zeven). Voor de stabiliteit van het monster of voor het maalprocedé kan koeling nodig zijn. Rubberachtige materialen kunnen bij de temperatuur van vloeibare stikstof worden vergruisd (1).

Als het niet mogelijk is een fractie met de vereiste deeltjesgrootte te verkrijgen, moet worden getracht de deeltjesgrootte zoveel mogelijk te verlagen en moet het resultaat in het verslag worden vermeld. Tevens moet in het verslag worden vermeld hoe het vergruisde monster voor de test is bewaard.

1.5.3. Procedure

In drie kolven met een glazenstop wordt telkens 10 g van de te onderzoeken stof afgewogen. Vervolgens wordt aan elke kolf 1 000 ml water toegevoegd. Indien het niet mogelijk blijkt met een hoeveelheid van 10 g polymeer te werken, moet de eerst hogere hoeveelheid worden gebruikt waarmee wel kan worden gewerkt en moet de hoeveelheid water dienovereenkomstig worden aangepast.

De kolven worden goed afgesloten en vervolgens bij 20 oC geschud. Hiervoor wordt een schuld- of roermachine gebruikt waarmee bij constante temperatuur kan worden gewerkt. Na 24 uur wordt de inhoud van elke kolf gecentrifugeerd of gefiltreerd en wordt de polymeerconcentratie in de heldere waterige fase met behulp van een geschikte analysemethode bepaald. Indien er geen geschikte analysemethoden voor de waterige fase beschikbaar zijn, kan de totale oplosbaarheid/extraheerbaarheid op basis van het drooggewicht van het residu op het filter of het gecentrifugeerde neerslag worden bepaald.

Meestal moet bij de kwantitatieve bepaling onderscheid worden gemaakt tussen de verontreinigingen en additieven enerzijds en het polymeer met een laag molecuulgewicht anderzijds. Bij een gravimetrische bepaling is het ook belangrijk dat er een blancobepaling zonder te onderzoeken stof wordt uitgevoerd om rekening te kunnen houden met residuen ten gevolge van de experimentele procedure.

Het oplos/extractiegedrag van polymeren in water bij 37 oC bij pH 2 en pH 9 kan op dezelfde wijze worden bepaald zoals beschreven voor de uitvoering van het experiment bij 20 oC. De pH kan worden aangepast door de toevoeging van geschikte bufferoplossingen of zuren of basen als zoutzuur, azijnzuur, natrium- of kahumhydroxide (p.a.) of NH3.

Afhankelijk van de gebruikte analysemethode moet de test een- of tweemaal worden uitgevoerd. Wanneer voldoende specifieke methoden beschikbaar zijn voor een directe analyse van de polymeercomponent in de waterige fase, moet één in het voorgaande beschreven test voldoende zijn. Wanneer dergelijke methoden echter niet beschikbaar zijn en het oplos/extractiegedrag van de polymeer uitsluitend wordt bepaald via een indirecte analyse waarbij alleen het totale gehalte aan organische koolstof (TOC) van het waterig extract wordt bepaald, moet de test tweemaal worden uitgevoerd. Deze tweede test moet ook in triplo gebeuren met polymeermonsters die tien keer zo klein zijn als bij de eerste test en dezelfde hoeveelheden water.

1.5.4. Analyse

1.5.4.1. Met één monsterhoeveelheid uitgevoerde test

Het is mogelijk dat er methoden beschikbaar zijn voor een directe analyse van de polymeercomponent in de waterige fase. Als dit niet het geval is, kan worden overwogen een indirecte analyse van opgeloste/geëxtraheerde polymeercomponenten uit te voeren, waarbij het totale gehalte aan oplosbaar materiaal wordt bepaald en wordt gecorrigeerd voor componenten die niet polymeerspecifiek zijn.

Een analyse van de totale hoeveelheid polymeer in de waterige fase is mogelijk:

met behulp van een voldoende gevoelige methode zoals:

—TOC met ontleding door persulfaat of dichromaat tot CO2, gevolgd door bepaling met behulp van IR of chemische analyse;

—atoomabsorptiespectrometrie (AAS) of emissiespectrometrie met inductief gekoppeld plasma (ICP) voor polymeren die silicium of metaal bevatten;

—Uv-absorptie of spectrofluorimetrie voor arylpolymeren,

—LC/MS voor monsters met een laag molecuulgewicht;

door vacuümverdampmg van het waterig extract en analyse van het droge residu met behulp van spectroscopie (bijvoorbeeld IR of uv) of AAS/ICP.

Als een analyse van de waterige fase als zodanig niet uitvoerbaar is, moet het waterige extract worden geëxtraheerd met een niet met water mengbaar organisch oplosmiddel, bijvoorbeeld een gechloreerde koolwaterstof. Vervolgens wordt het oplosmiddel verdampt en wordt het polymeergehalte van het residu volgens een van bovenstaande analysemethoden bepaald. Om de mate van oplossing/extractie van het polymeer zelf te bepalen, moeten componenten van dit residu waarvan wordt vastgesteld dat ze verontreinigingen of additieven zijn, in mindering worden gebracht.

Wanneer betrekkelijk grote hoeveelheden van dergelijke materialen aanwezig zijn, kan het nodig zijn het residu met behulp van bijvoorbeeld HPLC of GC te analyseren om onderscheid te maken tussen de verontreinigingen en het monomeer en van het monomeer afgeleide stoffen zodat het werkelijke gehalte aan laatstgenoemde stoffen kan worden bepaald.

In sommige gevallen kan het voldoende zijn het organische oplosmiddel te verdampen en het droge residu te wegen.

1.5.4.2. Met twee verschillende monsterhoeveelheden uitgevoerde test

Alle waterige extracten worden op TOC geanalyseerd.

Bij het niet-opgeloste/niet-geëxtraheerde deel van het monster wordt een gravimetrische bepaling uitgevoerd. Als na centrifugeren of filtreren van de inhoud van de kolf polymeerresten op de rand van de kolf zijn achtergebleven, moet de kolf met het filtraat worden gespoeld totdat alle zichtbare resten zijn verdwenen. Vervolgens wordt het filtraat opnieuw gecentrifugeerd of gefiltreerd. De op de filter of in de centrifugebuis achtergebleven residuen worden bij 40 oC onder vacuüm gedroogd tot constant gewicht en vervolgens gewogen.

2. GEGEVENS

2.1. MET ÉÉN MONSTERHOEVEELHEID UITGEVOERDE TEST

De aparte resultaten voor de drie kolven en de gemiddelde waarden moeten worden vermeld, uitgedrukt in massa-eenheden per volume oplossing (meestal mg/l) of massa-eenheden per massa polymeermonster (meestal mg/g). Daarnaast moet het gewichtsverlies van het monster worden vermeld (berekend als het gewicht van de opgeloste stof gedeeld door het gewicht van het oorspronkelijke monster). Bovendien moet de relatieve standaardafwijking worden berekend. Deze gegevens moeten worden vermeld voor de stof als geheel (polymeer + essentiële additieven enz.) en voor het zuivere polymeer (d.w.z. nadat de bijdrage van dergelijke additieven is afgetrokken).

2.2. MET TWEE VERSCHILLENDE MONSTERHOEVEELHEDEN UITGEVOERDE TEST

Voor elk waterig extract van de twee in triplo uitgevoerde experimenten dient de TOC-waarde te worden vermeld en daarnaast de gemiddelde waarde voor elk experiment. Deze gegevens dienen te worden uitgedrukt in massa-eenheden per volume oplossing (meestal mg C/l) en massa-eenheden per gewicht van het oorspronkelijke monster (meestal mgC/g).

Als er geen verschil is tussen de resultaten met de hoge en de lage monster/waterverhouding, kan dit erop wijzen dat alle extraheerbare componenten inderdaad zijn geëxtraheerd. In dat geval zou een directe analyse normaal gesproken niet nodig zijn.

Voor elk residu moet het gewicht worden vermeld en worden uitgedrukt als percentage van het oorspronkelijke gewicht van het monster. Per experiment dient het gemiddelde te worden berekend. Het percentage oplosbaar en extraheerbaar materiaal in het oorspronkelijke monster wordt berekend door het gevonden percentage van 100 % af te trekken.

3. RAPPORTAGE

3.1. TESTVERSLAG

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

3.1.1. Onderzochte stof:

—beschikbare informatie over de onderzochte stof (identiteit, additieven, verontreinigingen, gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen).

3.1.2. Testomstandigheden:

—beschrijving van de gevolgde procedures en de testomstandigheden;

—beschrijving van de analyse- en detectiemethoden.

3.1.3. Resultaten

—de oplosbaarheid/extraheerbaarheid in mg/l; aparte resultaten bij de verschillende oplossingen en gemiddelde waarden, gesplitst in polymeergehalte en verontreinigingen, additieven enz.;

—oplosbaarheid/extraheerbaarheid in mg/g polymeer;

—TOC-waarden van de waterige extracten, gewicht van de opgeloste stof en berekende percentages, indien gemeten;

—de pH van elk monster;

—informatie over de blancobepalingen;

—indien nodig gegevens over de chemische instabiliteit van de onderzochte stof, zowel tijdens de testprocedure als tijdens de analyse;

—alle informatie die voor de interpretatie van de resultaten van belang is.

4. REFERENTIE

(1)DIN 53733 (1976), Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

A.21. OXIDERENDE EIGENSCHAPPEN (VLOEISTOFFEN)

1. METHODE

1.1. INLEIDING

Deze testmethode is bedoeld om te meten in hoeverre een vloeistof de verbrandingssnelheid of verbrandingsintensiteit van een brandbare stof kan verhogen of met een brandbare stof een mengsel kan vormen dat spontaan ontbrandt wanneer beide stoffen grondig worden gemengd. De test is gebaseerd op de test voor oxiderende vloeistoffen van de VN (1) en is hieraan gelijkwaardig. Aangezien deze methode A.21 echter in de eerste plaats is bedoeld om te voldoen aan de vereisten van Verordening (EG) nr. 1907/2006, is slechts een vergelijking met één referentiestof vereist. Testen en vergelijken met bijkomende referentiestoffen kan nodig zijn wanneer het waarschijnlijk is dat de testresultaten voor andere doeleinden worden gebruikt (3).

Deze test hoeft niet te worden uitgevoerd wanneer op grond van de structuurformule met afdoende zekerheid kan worden vastgesteld dat de stof niet exotherm kan reageren met een brandbare stof.

Het is nuttig om, voordat deze test wordt uitgevoerd, te beschikken over gegevens over de mogelijke explosieve eigenschappen van de te onderzoeken stof.

Deze test is niet toepasbaar op vaste stoffen, gassen, explosieve of licht ontvlambare stoffen of organische peroxiden.

Deze test hoeft eventueel niet te worden uitgevoerd wanneer voor de te onderzoeken stof al resultaten beschikbaar zijn van de test voor oxiderende vloeistoffen van de VN (1).

1.2. DEFINITIES EN EEN HEDEN

Gemiddelde stijgtijd van de druk: het gemiddelde van de gemeten tijden waarin een mengsel tijdens de test een drukstijging veroorzaakt van 690 kPa tot 2 070 kPa boven de atmosferische druk.

1.3. REFERENTIESTOF

Als referentiestof wordt een waterige oplossing van 65 gewichtsprocent salpeterzuur (analytisch zuiver) gebruikt (4).

Wanneer de experimentator verwacht dat de testresultaten wellicht voor andere doeleinden worden gebruikt (4) , kan het wenselijk zijn de test met bijkomende referentiestoffen uit te voeren (5).

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

De testvloeistof wordt in een massaverhouding van 1:1 met cellulosevezel gemengd en in een drukvat gebracht. Indien tijdens het mengen of vullen spontane ontbranding optreedt, is verder testen niet nodig.

Indien geen spontane ontbranding optreedt, wordt de volledige test uitgevoerd. Het mengsel wordt in een drukvat verwarmd en de gemiddelde tijd waarin de druk stijgt van 690 kPa tot 2 070 kPa boven de atmosferische druk, wordt gemeten. Deze tijd wordt vergeleken met de gemiddelde stijgtijd voor de druk voor het 1:1-mengsel van de referentiestof(fen) en cellulose.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

In een reeks van vijf proeven met dezelfde stof mag geen van de resultaten meer dan 30 % afwijken van het rekenkundige gemiddelde. Resultaten die meer dan 30 % van het gemiddelde afwijken, moeten worden verworpen, de meng- en vulprocedure moet worden verbeterd en de test moet worden herhaald.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE METHODE

1.6.1. Voorbereiding

1.6.1.1. Brandbare stof

Als brandbare stof wordt droge cellulose met een vezellengte tussen 50 en 250 μm en een gemiddelde diameter van 25 μm gebruikt (6). Dit wordt gedurende 4 uur in een laag van ten hoogste 25 mm dik bij 105 oC gedroogd tot constant gewicht en in een exsiccator met droogmiddel bewaard totdat de vezel is afgekoeld en wordt gebruikt. Het watergehalte van de gedroogde cellulose moet minder zijn dan 0,5 % van de droge massa (7). Zo nodig dient de droogtijd te worden verlengd tot deze waarde is bereikt (7) . Gedurende de hele test wordt een en dezelfde batch cellulose gebruikt (8).

1.6.1.2. Apparatuur

1.6.1.2.1. Drukvat

Voor de test wordt gebruik gemaakt van een drukvat. Dit is een cilindrisch stalen drukvat met een lengte van 89 mm en een uitwendige diameter van 60 mm (zie figuur 1). De cilinder wordt zo bewerkt dat aan de buitenkant recht tegenover elkaar twee vlakke zijden ontstaan (waardoor de doorsnede van het vat wordt gereduceerd tot 50 mm) zodat de cilinder gemakkelijker kan worden gemanipuleerd wanneer de ontstekingsplug en ontluchtingsplug worden aangebracht. Het vat, dat een inwendige diameter van 20 mm heeft, wordt aan beide uiteinden tot een diepte van 19 mm opgeruimd en voorzien van een schroefdraad voor 1 „British Standard Pipe (BSP) of het metrische equivalent daarvan. Op 35 mm van een van de uiteinden wordt op 90o van de vlakke oppervlakken in het gebogen oppervlak van het vat een zijbuis geschroefd om de druk op te nemen. Daarvoor wordt een 12 mm diep gat geboord dat wordt voorzien van schroefdraad voor de ½” BSP (of metrisch equivalent) schroefdraad op het uiteinde van de zijbuis. Zo nodig wordt een inerte pakking aangebracht om een gasdichte verbinding te bekomen. De zijbuis steekt 55 mm buiten het drukvat uit en heeft een inwendige diameter van 6 mm. Het uiteinde van de zijbuis wordt opgeruimd en voorzien van een schroefdraad voor een membraanmanometer. Elk type manometer mag worden gebruikt, op voorwaarde dat de manometer bestand is tegen de hete gassen of ontledingsproducten en kan reageren op een drukstijging van 690-2 070 kPa in maximaal 5 ms.

Het uiteinde van het drukvat dat het verst verwijderd is van de zijbuis, wordt afgesloten met een ontstekingsplug met twee elektrodes, de ene geïsoleerd van de plug, de andere via de plug met de massa verbonden. Het andere uiteinde van het drukvat wordt afgesloten met een breekplaat (barstdruk ongeveer 2 200 kPa) die op zijn plaats wordt gehouden met een bevestigingsplug met een inwendige diameter van 20 mm. Zo nodig wordt voor de ontstekingsplug een inerte pakking gebruikt om een gasdichte verbinding te bekomen. Het drukvat wordt tijdens het gebruik in de juiste positie gehouden met een statief (figuur 2). Dit bestaat doorgaans uit een zachtstalen grondplaat van 235 mm × 184 mm × 6 mm en een 185 mm lange vierkante buis van 70 mm × 70 mm × 4 mm.

Van twee tegenover elkaar gelegen zijkanten van de vierkante buis wordt een deel verwijderd zodat een buis van 86 mm lengte overblijft die uitloopt in twee vlakke benen. De uiteinden van deze vlakke benen worden onder een hoek van 60o ten opzichte van de as van de buis afgekort en op de grondplaat gelast. Aan de bovenkant van de vierkante buis wordt in één zijkant een gleuf van 22 mm breed × 46 mm diep uitgefreesd, zodat de zijbuis in de gleuf valt wanneer het drukvat met de ontstekingsplug naar beneden in de vierkante buis wordt geplaatst. Op de onderste binnenzijde van de vierkante buis wordt een stuk staal van 30 mm breed en 6 mm dik gelast als afstandstuk. In de tegenoverliggende zijde worden twee 7 mm vleugelschroeven gedraaid om het drukvat stevig op zijn plaats te houden. Om het drukvat van onderen te steunen worden op de zijkanten die doorlopen naar de basis van het statief, twee stroken van 12 mm breed en 6 mm dik staal gelast.

1.6.1.2.2. Ontstekingssysteem

Het ontstekingssysteem bestaat uit een 25 cm lange Ni/Cr-draad met een diameter van 0,6 mm en een weerstand van 3,85 ohm/m. De draad wordt om een staaf met een diamater van 5 mm tot een spoel gewikkeld en met de elektrodes van de ontstekingsplug verbonden. De spoel moet een van de in figuur 3 afgebeelde configuraties hebben. De afstand tussen de bodem van het vat en de onderzijde van de ontstekingsspoel moet 20 mm bedragen. Wanneer de elektroden niet instelbaar zijn, moeten de einden van de ontstekingsdraad tussen de spoel en de bodem van het vat met een keramische mantel worden geïsoleerd. De draad wordt verhit met een voeding die een constante stroom van ten minste 10 A kan leveren.

1.6.2. Uitvoering van de test (9)

Het toestel wordt met manometer en verhittingssysteem, maar zonder de breekplaat, met de ontstekingsplug naar beneden neergezet. In een glazen beker worden met een glazen roerstaaf 2,5 g testvloeistof en 2,5 g gedroogde cellulose gemengd (10). Om veiligheidsredenen moet tijdens het mengen een veiligheidsschild tussen de experimentator en het mengsel zijn geplaatst. Indien het mengsel tot ontbranding komt tijdens het mengen of vullen, zijn geen verdere tests nodig. Het mengsel wordt in kleine hoeveelheden tegelijk in het drukvat gegoten, terwijl tegen het drukvat wordt geklopt om ervoor te zorgen dat het mengsel de ruimte rond de ontstekingsspoel vult en daarmee goed contact maakt. Het is belangrijk dat de spoel tijdens het vullen niet verbuigt, aangezien dit tot foutieve resultaten kan leiden (11). De breekplaat wordt op zijn plaats gebracht en de bevestigingsplug wordt stevig vastgeschroefd. Het gevulde drukvat wordt met de breekplaat naar boven in het statief geplaatst. De gehele opstelling moet zich in een geschikte gewapende afzuigkast of ontstekingskast bevinden. De voeding wordt aangesloten op de uitwendige aansluitingen van de ontstekingsplug. De stroomsterkte bedraagt 10 A. De tijd tussen het begin van het mengen en het inschakelen van de voeding mag niet langer zijn dan tien minuten.

Het signaal van de manometer wordt geregistreerd met een systeem waarmee het drukverloop kan worden geanalyseerd en continu kan worden geregistreerd (bijv. een transiëntrecorder gekoppeld aan een papierschrijver). Het mengsel wordt verwarmd tot de breekplaat breekt of totdat ten minste 60 seconden zijn verstreken. Als de breekplaat niet breekt, moet het mengsel afkoelen voordat het toestel voorzichtig wordt geopend, waarbij de nodige voorzorgen worden getroffen voor het geval een plotselinge drukstijging optreedt. Er worden vijf proeven uitgevoerd met de teststof en de referentiestof(fen). De tijd waarin de druk stijgt van 690 kPa tot 2 070 kPa boven de atmosferische druk, wordt genoteerd. Vervolgens wordt de gemiddelde stijgtijd van de druk berekend.

In sommige gevallen kunnen stoffen een (te hoge of te lage) drukstijging veroorzaken als gevolg van chemische reacties die niet relevant zijn voor de oxiderende eigenschappen van de stof. In die gevallen kan het nodig zijn de test te herhalen met een inerte stof, bijvoorbeeld diatomiet (kieselgoehr), in plaats van cellulose, om het karakter van de reactie te bepalen.

2. GEGEVENS

Stijgtijd voor de teststof en voor de referentiestof(fen). Stijgtijd voor de tests met een inerte stof, indien uitgevoerd.

2.1. VERWERKING VAN DE RESULTATEN

De gemiddelde stijgtijden van de druk voor de teststof en de referentiestof(fen) worden berekend.

De gemiddelde stijgtijd voor de tests met een inerte stof (indien uitgevoerd) wordt berekend.

Tabel 1 bevat enkele voorbeelden van resultaten



Tabel 1

Voorbeelden van resultaten()

Stof ()

Gemiddelde stijgtijd voor een 1:1 mengsel met cellulose

(ms)

Ammoniumdichromaat, verzadigde waterige oplossing

20 800

Calciumnitraat, verzadigde waterige oplossing

6 700

IJzer(III)nitraat, verzadigde waterige oplossing

4 133

Lithiumperchloraat, verzadigde waterige oplossing

1 686

Magnesiumperchloraat, verzadigde waterige oplossing

777

Nikkelnitraat, verzadigde waterige oplossing

6 250

Salpeterzuur, 65 %

4 767 ()

Perchloorzuur, 50 %

121 ()()

Perchloorzuur, 55 %

59

Kaliumnitraat, 30 % waterige oplossing

26 690

Zilvernitraat, verzadigde waterige oplossing

()

Natriumchloraat, 40 % waterige oplossing

2 555 ()

Natriumnitraat, 45 % waterige oplossing

4 133

Inerte stof

Water:cellulose

()

(1)Zie referentie (1) voor indeling volgens de vervoersvoorschriften van de VN.

(2)Verzadigde oplossingen worden bij 20 oC bereid.

(3)Gemiddelde waarde van vergelijkende interlaboratoriumproeven.

(4)Maximumdruk van 2 070 kPa niet bereikt.

3. RAPPORTAGE

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN

In het verslag moeten de volgende gegevens worden opgenomen:

—identiteit, samenstelling, zuiverheid enz. van de teststof;

—concentratie van de teststof;

—procedure voor het drogen van de cellulose;

—watergehalte van de gebruikte cellulose;

—de meetresultaten;

—eventuele resultaten van tests met een inerte stof;

—berekende gemiddelde stijgtijden van de druk;

—eventuele afwijkingen van deze methoden en redenen daarvoor;

—alle verdere informatie of opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten.

3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN (12)

De testresultaten worden beoordeeld op grond van:

a)de vraag of het mengsel van teststof en cellulose spontaan ontbrand; en

b)een vergelijking van de gemiddelde stijgtijd voor de druk van 690 KPa naar 2 070 kPa met die voor de referentiestof(fen).

Een vloeistof wordt aangemerkt als een oxiderende stof wanneer:

a)een mengsel in een 1:1 massaverhouding van de stof en cellulose spontaan ontbrand, of

b)een mengsel in een massaverhouding van 1:1 van de stof en cellulose een gemiddelde stijgtijd oplevert kleiner dan of gelijk aan de gemiddelde stijgtijd van de druk van een mengsel in een 1:1 massaverhouding van een waterige oplossing van 65 gewichtsprocent salpeterzuur en cellulose.

Om vals-positieve resultaten te vermijden, moet bij de interpretatie van de resultaten zo nodig ook rekening worden gehouden met resultaten verkregen bij het testen van de stof gemengd met inert materiaal.

4. REFERENTIES

(1)Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids.

Figuur 1

Drukvat

image

Figuur 2

Statief

image

Figuur 3

Ontstekingssysteem

image

Opmerking: Beide ontstekingssystemen kunnen worden gebruikt.

▼M1

A.22. NAAR LENGTE GEWOGEN MEETKUNDIG GEMIDDELDE VAN DE DIAMETER VAN VEZELS

1. METHODE

1.1. INLEIDING

In deze methode wordt een procedure beschreven voor de bepaling van het naar lengte gewogen meetkundig gemiddelde van de diameter (Length Weighted Geometric Mean Diameter — LWGMD) van in bulk geproduceerde synthetische anorganische vezels (Man Made Mineral Fibres — MMMF). Aangezien er een waarschijnlijkheid van 95 % is dat de LWGMD van de populatie tussen de 95 %-betrouwbaarheidsniveaus (LWGMD ± twee keer de standaardfout) van het monster ligt, zal als testwaarde de onderste 95 %-betrouwbaarheidsgrens van het monster worden gerapporteerd (d.w.z. LWGMD minus twee keer de standaardfout). De methode is gebaseerd op een bijwerking (juni 1994) van een ontwerp-bedrijfsprocedure van de HSE, die is overeengekomen tijdens een bijeenkomst van de ECFIA en de HSE in Chester op 26 september 1993 en voor en op basis van een tweede interlaboratoriumproef is ontwikkeld (1, 2). Deze meetmethode kan worden gebruikt voor de karakterisering van de vezeldiameter van bulkstoffen of producten die MMMF bevatten, zoals refractaire keramische vezels (RKV), synthetische glasvezels (Man Made Vitreous Fibres — MMVF) of kristallijne en polykristallijne vezels.

Weging naar lengte is een methode om te compenseren voor het effect op de diameterdistributie ten gevolge van het breken van lange vezels bij de bemonstering of behandeling van het materiaal. Voor de meting van de grootteverdeling van MMMF-diameters worden meetkundige statistische methoden (meetkundig gemiddelde) gebruikt, omdat deze diameters meestal een grootteverdeling hebben die een lognormaalverdeling benadert.

Meting van de lengte èn de diameter is zowel saai als tijdrovend, maar als alleen de vezels worden gemeten die een oneindig dunne lijn in een REM-gezichtsveld raken, is de waarschijnlijkheid dat een bepaalde vezel wordt geselecteerd evenredig met de lengte daarvan. Aangezien daarmee de lengte in de berekening van de weging naar lengte wordt verdisconteerd, behoeft alleen nog de diameter te worden gemeten en kan de LWGMD-2SE volgens de beschrijving worden berekend.

1.2. DEFINITIES

Deeltje: Een object met een lengte/breedte-verhouding van minder dan 3:1.

Vezel: Een object met een lengte/breedte-verhouding (aspectverhouding) van ten minste 3:1.

1.3. TOEPASSINGSGEBIED EN BEPERKINGEN

De methode is bedoeld voor diameterdistributies met een mediane diameter van 0,5 μm tot 6 μm. Grotere diameters kunnen met een lagere REM-vergrotingsfactor worden gemeten, maar de methode krijgt steeds meer beperkingen voor kleinere vezels en als de mediane diameter kleiner is dan 0,5 μm, wordt een TEM-meting (transmissie-elektronenmicroscoop) aanbevolen.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

Uit de vezelmat of uit losse bulkvezels wordt een aantal representatieve boormonsters genomen. De lengte van de bulkvezels wordt met behulp van een vergruisprocedure verkleind en een representatief deelmonster wordt gedispergeerd in water. Er worden meetmonsters geëxtraheerd, gefiltreerd over een polycarbonaatfilter met een poriegrootte van 0,2 μm en geprepareerd voor onderzoek met een rasterelektronenmicroscoop (REM). De vezeldiameters worden gemeten bij een vergrotingsfactor van 10 000 × of meer (13) met behulp van een steekproefname langs een lijn om een zuivere raming van de mediane diameter te krijgen. Het onderste 95 %-betrouwbaarheidsinterval (op basis van een eenzijdige toets) wordt berekend om een raming te krijgen van de laagste waarde van het meetkundig gemiddelde van de vezeldiameter van het materiaal.

1.5. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.5.1. Veiligheids/voorzorgmaatregelen

De blootstelling van personen aan vezels in de lucht moet tot een minimum worden beperkt en voor het hanteren van de droge vezels moet een zuurkast of een handschoenenkast worden gebruikt. Om de effectiviteit van de beperkende maatregelen te bepalen moet periodiek monitoring van de blootstelling van personen worden uitgevoerd. Bij het hanteren van MMMF moeten wegwerphandschoenen worden gebruikt om huidirritatie te beperken en kruisbesmetting te voorkomen.

1.5.2. Apparatuur

—Pers en matrijzen (voor 10 MPa).

—Polycarbonaatfilter met capillaire poriën met een poriegrootte van 0,2 μm (diameter 25 mm).

—Cellulose-ester membraanfilter met een poriegrootte van 5 μm dat als secundair filter kan worden gebruikt.

—Glazen filtreerapparaat (of wegwerp-filtratiesystemen) voor filters met een diameter van 25 mm (bv. glazen microanalysekit van Millipore, typenr. XX10 025 00).

—Vers gedestilleerd water dat is gefiltreerd over een filter met een poriegrootte van 0,2 μm om micro-organismen te verwijderen.

—Sputter coater met een goud- of goud/palladiumtarget.

—Rasterelektronenmicroscoop met een resolutie tot 10 nm en een vergrotingsfactor van 10 000 ×.

—Diversen: spatels, scalpelmesje type 24, pincet, REM-buisjes, koolstoflijm of koolstofkleefband, zilverpasta.

—Ultrasone sonde of ultrasoon bad (tafelmodel).

—Monsterboor of kurkboor om boormonsters van een MMMF-mat te nemen.

1.5.3. Testprocedure

1.5.3.1. Monstername

Voor matten en platen wordt een 25 mm monsterboor of kurkboor gebruikt om monsters van de doorsnede te nemen. Deze moeten gelijkmatig gespreid over de breedte van een klein stuk van de mat worden genomen of, als een langer stuk van de mat beschikbaar is, uit aselect gekozen plaatsen. Dezelfde apparatuur kan worden gebruikt om aselecte monsters uit losse vezels te nemen. Indien mogelijk moeten er zes monsters worden genomen om de ruimtelijke variatie in het bulkmateriaal te verdisconteren.

De zes boormonsters worden in een matrijs met een diameter van 50 mm bij 10 Mpa verbrijzeld. Het materiaal wordt met een spatel gemengd en opnieuw aan 10 Mpa blootgesteld. Vervolgens wordt het materiaal uit de matrijs verwijderd en in een gesloten glazen fles bewaard.

1.5.3.2. Monstervoorbereiding

Indien nodig kan organisch bindmiddel worden verwijderd door de vezels gedurende ongeveer één uur bij 450 °C in een oven te leggen.

Verdeel het monster in vieren door een kegelvormig hoopje te maken en dit in vieren te verdelen („cone and quarter”-techniek) (dit moet in een zuurkast gebeuren).

Voeg met een spatel een kleine hoeveelheid (< 0,5 g) monster toe aan 100 ml vers gedestilleerd water dat over een membraanfilter van 0,2 μm is gefiltreerd (ook andere bronnen van ultrazuiver water mogen worden gebruikt, als is aangetoond dat deze aan de eisen voldoen). Dispergeer grondig met een ultrasone sonde die bij een vermogen van 100 W zodanig is ingesteld dat cavitatie optreedt (als er geen sonde beschikbaar is, wordt de volgende methode gebruikt: gedurende 30 seconden herhaaldelijk schudden en omkeren; gedurende vijf minuten ultrasoneren in een tafelmodel ultrasoon bad; vervolgens nog eens gedurende 30 seconden herhaaldelijk schudden en omkeren).

Onmiddellijk na het dispergeren van de vezels wordt met een pipet met brede opening (inhoud 2-5 ml) een aantal analysemonsters genomen (bv. drie monsters van 3, 6 en 10 ml).

Elk analysemonster wordt onder vacuüm gefiltreerd over een polycarbonaatfilter van 0,2 μm op een secundair MEC-filter met een poriegrootte van 5 μm, waarbij een glazen filterkroes van 25 mm met een cilindrisch reservoir wordt gebruikt. In de filterkroes wordt ongeveer 5 ml gefiltreerd gedestilleerd water gebracht en het analysemonster wordt langzaam in het water gepipetteerd, waarbij de pipetpunt onder de meniscus wordt gehouden. De pipet en het reservoir moeten na het pipetteren grondig worden gespoeld, aangezien dunne vezels de neiging hebben aan het oppervlak te blijven.

Verwijder het filter voorzichtig, maak het los van het secundaire filter en leg het in een houder om te laten drogen.

Snij met een type 24 scalpelmes met een schokkende beweging een kwart of halve filterschijf met het filterresidu af. Plak de doorsnede met een stukje koolstofkleefband of koolstoflijm zorgvuldig op een REM-stub. Op ten minste drie plaatsen wordt zilverpasta aangebracht om het elektrisch contact aan de randen van het filter en de stub te verbeteren. Als de lijm/zilverpasta droog is, wordt met een sputter coater ongeveer 50 nm goud of goud/palladium op het oppervlak van het neerslag aangebracht.

1.5.3.3. REM: kalibratie en uitvoering

1.5.3.3.1. Kalibratie

De kalibratie van de REM moet ten minste één keer per week worden gecontroleerd (liefst één keer per dag) met een gecertificeerd kalibratierooster. De kalibratie moet aan de hand van een gecertificeerde standaard worden gecontroleerd en als de gemeten waarde (REM) niet binnen ± 2 % van de gecertificeerde waarde ligt, moet de REM-kalibratie worden aangepast en opnieuw worden gecontroleerd.

De REM moet met een reële monstermatrix bij een vergrotingsfactor van 2 000 × in staat zijn tot een resolutie van ten minste een minimale zichtbare diameter van 0,2 μm.

1.5.3.3.2. Uitvoering

De REM moet worden gebruikt met een vergrotingsfactor van 10 000 × (14) onder omstandigheden die een goede resolutie met een aanvaardbaar beeld geven bij een lage aftastsnelheid van bijvoorbeeld 5 seconden per opname. Hoewel de operationele vereisten van verschillende REM’s kunnen uiteenlopen, wordt bij materialen met een betrekkelijk laag atoomgewicht in het algemeen de beste zichtbaarheid en resolutie verkregen bij gebruik van een versnellingsspanning van 5-10 keV met een kleine stipafmeting en een korte werkafstand. Aangezien er een lineair traject wordt afgelegd, moet er een helling van 0° worden gebruikt om opnieuw scherpstellen tot een minimum te beperken of als de REM een eucentrische objecttafel heeft, moet de eucentrische werkafstand worden gebruikt. Er kan een lagere vergrotingsfactor worden gebruikt als het materiaal geen kleine vezels (kleine diameter) bevat en de vezeldiameter groot is (> 5 μm).

1.5.3.4. Groottebepaling

1.5.3.4.1. Onderzoek bij lage vergrotingsfactor om het monster te evalueren

In eerste instantie wordt het monster bij een lage vergrotingsfactor onderzocht om na te gaan of grote vezels aan elkaar klitten en om de dichtheid van de vezels te bepalen. Als er te veel klitten zijn, wordt aanbevolen een nieuw monster te maken.

Met het oog op de statistische nauwkeurigheid moet er een minimaal aantal vezels worden gemeten en een hoge vezeldichtheid zal wellicht wenselijk lijken, aangezien het bestuderen van lege velden tijdrovend is en niet tot de analyse bijdraagt. Als het filter echter te veel materiaal bevat, wordt het moeilijk alle meetbare vezels te meten en omdat kleine vezels achter grotere vezels verborgen kunnen liggen, worden deze dan wellicht gemist.

Bij een vezeldichtheid van meer dan 150 vezels per millimeter van het lineaire traject kan een systematische fout tot een te hoge LWGMD leiden. Anderzijds leidt een lage vezelconcentratie tot een langere analysetijd en het is vaak kosteneffectief om een monster te maken met een vezeldichtheid die dichter bij het optimum ligt in plaats van tellingen te blijven uitvoeren bij filters met een lage concentratie. Een optimale vezeldichtheid moet gemiddeld ongeveer één of twee telbare vezels per gezichtsveld bij een vergrotingsfactor 5 000 opleveren. De optimale dichtheid is echter wel afhankelijk van de grootte (diameter) van de vezels, dus de experimentator moet zijn kennis en ervaring gebruiken om te beoordelen of de vezeldichtheid in de buurt van de optimale dichtheid ligt of niet.

1.5.3.4.2. Weging van de vezeldiameters naar lengte

Alleen de vezels die een op het scherm van de REM getrokken (oneindig) dunne lijn raken (of kruisen), worden geteld. Daartoe wordt over het centrum van het scherm een horizontale (of verticale) lijn getrokken.

Er kan ook één punt in het centrum van het scherm worden aangebracht, waarna een continue scan in één richting over het filter wordt gestart. Van elke vezel met een aspectverhouding van meer dan 3:1 die dit punt raakt of kruist, wordt de diameter gemeten en geregistreerd.

1.5.3.4.3. Groottebepaling van de vezels

Aanbevolen wordt ten minste 300 vezels te meten. Elke vezel wordt slechts eenmaal gemeten op het snijpunt met de lijn of het punt op het scherm (of vlakbij het snijpunt als de randen van de vezels niet goed te zien zijn). Als er vezels met een niet-uniforme doorsnede worden aangetroffen, wordt er een meting gebruikt van de gemiddelde diameter van de vezel. Bij de bepaling van de rand en het meten van de kortste afstand tussen de randen van de vezel moet zorgvuldig worden gewerkt. De groottebepaling kan on-line gebeuren of off-line met opgeslagen beelden of foto’s. Halfautomatische beeldmeetsystemen die de gegevens direct downloaden naar een spreadsheet worden aanbevolen, aangezien ze tijd besparen en fouten bij het overschrijven elimineren en de berekeningen kunnen worden geautomatiseerd.

Voor lange vezels moet bij een lage vergrotingsfactor worden gecontroleerd of de uiteinden niet naar het gezichtsveld van de meting terugkrullen, zodat vaststaat dat deze vezels slechts één keer worden gemeten.

2. GEGEVENS

2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN

Vezeldiameters hebben meestal geen normaalverdeling. Door een log-transformatie uit te voeren kan er echter een verdeling worden verkregen die de normaalverdeling benadert.

Bereken het rekenkundig gemiddelde (gemiddelde lnD) en de standaarddeviatie (SDlnD) van de natuurlijke logaritmen (lnD) van de n vezeldiameters (D):



image

(1)

image

(2)

Om de standaardfout (SElnD) te krijgen wordt de standaarddeviatie gedeeld door de vierkantswortel van het aantal metingen:



image

(3)

Van het gemiddelde wordt twee keer de standaardfout afgetrokken en van deze waarde (gemiddelde minus twee keer de standaardfout) wordt de e-macht berekend; dit levert het meetkundig gemiddelde minus twee keer de standaardfout van het meetkundig gemiddelde:



image

(4)

3. RAPPORTAGE

TESTVERSLAG

In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opgenomen:

—de waarde van LWGMD-2SE;

—eventuele afwijkingen van de procedure, met name degene die gevolgen kunnen hebben voor de precisie of de nauwkeurigheid van de resultaten, met een afdoende motivering.

4. REFERENTIES

1.B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 1999.

2.G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994.

▼B




DEEL B: METHODEN VOOR DE BEPALING VAN DE TOXICITEIT EN ANDERE INVLOEDEN OP DE GEZONDHEID

INHOUD

ALGEMENE INLEIDING

B.1 bis.

ACUTE ORALE TOXICITEIT: PROCEDURE MET VASTE DOSES

B.1 ter.

ACUTE ORALE TOXICITEIT: METHODE TER BEPALING VAN DE ACUTE-TOXICITEITSKLASSE

B.2.

ACUTE INHALATIETOXICITEIT

B.3.

ACUTE DERMALE TOXICITEIT

B.4.

ACUTE TOXICITEIT: HUIDIRRITATIE/CORROSIE

B.5.

ACUTE TOXICITEIT: OOGIRRITATIE/CORROSIE

B.6.

SENSIBILISATIE VAN DE HUID

B.7.

TOXICITEIT (ORAAL) BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN)

B.8.

TOXICITEIT (INHALATIE) BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN)

B.9.

TOXICITEIT (DERMAAL) BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN)

B.10.

MUTAGENITEIT — IN VITRO TEST OP CHROMOSOOMAFWIJKINGEN IN ZOOGDIERCELLEN

B.11.

MUTAGENITEIT — IN VIVO TEST OP CHROMOSOOMAFWIJKINGEN IN BEENMERGCELLEN VAN ZOOGDIEREN

B.12.

MUTAGENITEIT — IN VIVO MICRONUCLEUSTEST BIJ ERYTROCYTEN VAN ZOOGDIEREN

B.13/14.

MUTAGENITEIT: TERUGMUTATIETEST MET BACTERIËN

B.15.

MUTAGENITEITSONDERZOEK EN SCREENING OP CARCINOGENESE: GENMUTATIE-SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.16.

MITOTISCHE RECOMBINATIE — SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.17.

MUTAGENITEIT — IN VITRO GENMUTATIETEST MET ZOOGDIERCELLEN

B.18.

DNA-BESCHADIGING EN -HERSTEL — DNA-HERSTELSYNTHESE — ZOOGDIERCELLEN IN VITRO

B.19.

ZUSTERCHROMATIDEN-UITWISSELINGSTEST IN VITRO

B.20.

GESLACHTSGEBONDEN RECESSIEVE LETALITEITSTEST MET DROSOPHILA MELANOGASTER

B.21.

ZOOGDIERENCELTRANSFORMATIETEST IN VITRO

B.22.

ONDERZOEK NAAR DOMINANTE LETALE MUTATIES BIJ KNAAGDIEREN

B.23.

TEST OP CHROMOSOOMAFWUKINGEN IN SPERMATOGONIA VAN ZOOGDIEREN

B.24.

VLEKKENTEST BIJ MUIZEN

B.25.

ERFELIJKE TRANSLOCATIES BIJ DE MUIS

B.26.

SUBCHRONISCHE ORALE TOXICITEITSTEST: TOXICITEITSONDERZOEK (ORAAL) OP KNAAGDIEREN BIJ HERHAALDE TOEDIENING (90 DAGEN)

B.27.

SUBCHRONISCHE ORALE TOXICITEITSTEST: TOXICITEITSONDERZOEK (ORAAL) OP DIEREN ANDERS DAN KNAAGDIEREN BIJ HERHAALDE TOEDIENING (90 DAGEN)

B.28.

SUBCHRONISCHE DERMALE TOXICITEITSTEST: 90 DAGEN-TEST MET HERHAALDE DERMALE TOEDIENING AAN KNAAGDIERSOORTEN

B.29.

SUBCHRONISCHE INHALATIETOXICITEITSTEST: 90 DAGEN-TEST MET HERHAALDE INHALATOIRE TOEDIENING AAN KNAAGDIERSOORTEN

B.30.

CHRONISCHE TOXICITEITSTEST

B.31.

ONDERZOEK NAAR PRENATALE ONTWIKKELINGSTOXICITEIT

B.32.

CARCINOGENITEITSONDERZOEK

B.33.

GECOMBINEERDE CHRONISCHE TOXICITEIT/CARCINOGENITEITSTEST

B.34.

REPRODUCTIETOXICITEITSONDERZOEK OVER ÉÉN GENERATIE

B.35.

REPRODUCTIETOXICITEITSONDERZOEK OVER TWEE GENERATIES

B.36.

TOXICOKINETIEK

B.37.

VERTRAAGDE NEUROTOXICITEIT VAN ORGANISCHE FOSFORVERBINDINGEN NA ACUTE BLOOTSTELLING

B.38.

VERTRAAGDE NEUROTOXICITEIT VAN ORGANISCHE FOSFORVERBINDINGEN BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN)

B.39.

IN VIVO TEST OP DNA-HERSTELSYNTHESE IN LEVERCELLEN VAN ZOOGDIEREN

B.40.

IN VITRO HUIDCORROSIE: TEST OP BASIS VAN DE TRANSCUTANE ELEKTRISCHE WEERSTAND (TEW)

B.40 BIS.

IN VITRO HUIDCORROSIE: TEST MET HUMAAN HUIDMODEL

B.41.

IN VITRO 3T3 NRU FOTOTOXICITEITSTEST

B.42.

HUIDSENSIBILISATIE: LOKALE LYMFKLIERTEST

B.43.

NEUROTOXICITEITSONDERZOEK BIJ KNAAGDIEREN

B.44.

ABSORPTIE DOOR DE HUID: IN VIVO METHODE

B.45.

ABSORPTIE DOOR DE HUID: IN VITRO METHODE

B.46.

IN-VITROHUIDIRRITATIE: TESTMETHODE MET GERECONSTRUEERDE HUMANE EPIDERMIS

B.47.

BOVINE CORNEAL OPACITY AND PERMEABILITY (BCOP-) TESTMETHODE VOOR DE IDENTIFICATIE VAN VOOR DE OGEN CORROSIEVE EN HEVIG IRRITERENDE STOFFEN

B.48.

ISOLATED CHICKEN EYE-TESTMETHODE VOOR DE IDENTIFICATIE VAN VOOR HET OOG CORROSIEVE EN HEVIG IRRITERENDE STOFFEN

B.49.

IN-VITROMICRONUCLEUSTEST BIJ ZOOGDIERCELLEN

B.50.

HUIDSENSIBILISATIE: LOKALE LYMFKLIERTEST: AA

B.51.

HUIDSENSIBILISATIE: LOKALE LYMFKLIERTEST: BrdU-ELISA

ALGEMENE INLEIDING

A. KARAKTERISERING VAN DE TESTSTOF

De samenstelling van de teststof, met inbegrip van de voornaamste verontreinigingen, en de relevante fysisch-chemische eigenschappen, waaronder de stabiliteit, moeten vóór de aanvang van ieder toxiciteitsonderzoek bekend zijn.

De fysisch-chemische eigenschappen van de teststof leveren belangrijke informatie over de keuze van de manier van toedienen, de opzet van ieder afzonderlijk onderzoek en het hanteren en bewaren van de teststof.

Alvorens het onderzoek wordt aangevat, moet een analytische methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van de teststof (zo mogelijk met inbegrip van de voornaamste verontreinigingen) in het toedieningsmedium en in het biologisch materiaal ontwikkeld worden.

Alle gegevens met betrekking tot de identificatie, de fysisch-chemische eigenschappen, de zuiverheid en het gedrag van de teststof moeten in het onderzoeksrapport worden opgenomen.

B. VERZORGING VAN DE DIEREN

Bij toxiciteitstests zijn een stringente bewaking van de levensomstandigheden en een goede verzorging van de dieren een eerste vereiste.

i) Huisvesting

De leefomstandigheden in de kamers of ruimten waar de proefdieren zijn ondergebracht, moeten geschikt zijn voor het soort proefdier. Voor ratten, muizen en cavia's is een kamertemperatuur van 22 oC ± 3 oC en een relatieve luchtvochtigheid van 30-70 % geschikt; voor konijnen moet de temperatuur 20 oC + 3 oC en de relatieve luchtvochtigheid 30-70 % bedragen.

Sommige experimentele technieken zijn bijzonder gevoelig voor temperatuureffecten; in dergelijke gevallen wordt in de beschrijving van de onderzoekmethode nader ingegaan op de correcte proefomstandigheden. Bij ieder onderzoek naar toxische effecten moeten de temperatuur en de vochtigheidsgraad worden gecontroleerd, opgetekend en in het eindverslag van de studie worden opgenomen.

Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met afwisselend twaalf uur licht — twaalf uur duisternis. Nadere gegevens over de verlichting moeten worden opgetekend en in het eindverslag worden opgenomen.

Tenzij anders bij de methode vermeld, worden de dieren hetzij afzonderlijk, hetzij in kleine groepen van hetzelfde geslacht gehuisvest In het laatste geval mogen per kooi niet meer dan vijf dieren worden gehuisvest.

Het is belangrijk om in verslagen over dierproeven steeds te vermelden welk soort kooien is gebruikt en hoeveel dieren tijdens de blootstelling aan de chemische stof en tijdens latere waarnemingsperioden in iedere kooi waren gehuisvest.

ii) Voeding

Bij de samenstelling van het voedsel moet worden voldaan aan alle eisen die de proefdiersoorten aan hun voeding stellen. Indien chemische stoffen via de voeding aan de dieren worden toegediend, kan de voedingswaarde door interactie tussen de stof en een bestanddeel van de voeding verminderd worden. Bij het interpreteren van de resultaten dient rekening te worden gehouden met de mogelijkheid van dergelijke reacties. Er kan gebruik worden gemaakt van gebruikelijk laboratoriumvoeder met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het voedsel kan mede worden bepaald door de noodzaak de teststof, wanneer die via het voedsel wordt toegediend, op een passende wijze daarmee te vermengen.

Onzuiverheden in de voeding waarvan bekend is dat ze de toxiciteit beïnvloeden, mogen niet in werkzame concentraties voorkomen.

C. ALTERNATIEVE TESTEN

De Europese Unie maakt zich sterk voor het ontwikkelen en valideren van alternatieve technieken die dezelfde hoeveelheid informatie opleveren als de huidige dierproeven, maar waarbij minder proefdieren worden gebruikt, die minder lijden veroorzaken of die het gebruik van dieren volledig overbodig maken.

Naarmate dergelijke methoden ter beschikking komen, moet het gebruik ervan waar mogelijk worden overwogen voor de risicobeoordeling en de daaruit voortvloeiende classificatie en etikettering ten aanzien van de intrinsieke risico's.

D. EVALUATIE EN INTERPRETATIE

Bij de evaluatie en interpretatie van de testresultaten moet rekening worden gehouden met de beperkingen ten aanzien van de mate waarin de resultaten van dierproeven en in-vitro tests kunnen worden geëxtrapoleerd naar de mens. Daarom kunnen aanwijzingen voor schadelijke effecten bij de mens, indien beschikbaar, gebruikt worden als bevestiging van de testresultaten.

E. LITERATUUR

De meeste van deze methoden zijn ontwikkeld binnen het kader van het OESO-programma inzake richtsnoeren voor het testen; zij moeten worden toegepast overeenkomstig de beginselen van „goede laboratoriumpraktijken”, om zoveel mogelijk te komen tot „onderlinge acceptatie van gegevens”.

Verdere informatie kan worden gevonden in de referenties die te vinden zijn in de OESO-richtsnoeren en in relevante literatuur die elders is gepubliceerd.

B.l bis. ACUTE ORALE TOXICITEIT: PROCEDURE MET VASTE DOSES

1. METHODE

Deze methode is gelijkwaardig aan TG 420 (2001) van de OESO.

1.1. INLEIDING

Bij klassieke methoden voor de bepaling van de acute toxiciteit wordt de dood van dieren als eindpunt gebruikt. In 1984 is door de British Toxicology Society een nieuwe aanpak voor acute toxiciteitstests voorgesteld op basis van de toediening van een reeks vaste doses (1). Deze aanpak gebruikt niet meer de dood van dieren als eindpunt, maar berust op de observatie van duidelijke toxiciteitsverschijnselen bij één van een reeks vaste doses. Na in-vivo valideringsonderzoek in het VK (2) en in internationaal verband (3) is deze procedure in 1992 als testmethode goedgekeurd. Vervolgens zijn de statistische eigenschappen van de procedure met vaste doses bij een reeks onderzoeken met behulp van mathematische modellen geëvalueerd (4)(5)(6). Met de combinatie van in-vivo-onderzoek en modellen is aangetoond dat de procedure reproduceerbaar is, minder dieren gebruikt en minder leed veroorzaakt dan de klassieke methoden en stoffen op een vergelijkbare wijze kan rangschikken als de andere testmethoden voor acute toxiciteit.

Richtsnoeren voor de keuze van de meest geschikte testmethode voor een bepaald doel worden gegeven in de leidraad voor tests op acute orale toxiciteit (7). Deze leidraad bevat ook aanvullende informatie over de uitvoering en interpretatie van testmethode B.l bis.

De methode heeft als beginsel dat bij het hoofdonderzoek slechts beperkt toxische doses worden gebruikt en dat de toediening van doses waarvan wordt verwacht dat ze dodelijk zijn, moet worden vermeden. Ook doses waarvan bekend is dat ze door een bijtende of sterk irriterende werking hevige pijn en leed veroorzaken, behoeven niet te worden toegediend. Stervende dieren of dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevig en voortdurend leed vertonen, worden op humane wijze gedood en worden bij de interpretatie van de testresultaten op dezelfde manier behandeld als dieren die tijdens de test gestorven zijn. Er is een aparte leidraad met criteria om te bepalen of stervende of hevig lijdende dieren moeten worden gedood en richtsnoeren om voorspelbare of ophanden zijnde sterfte te herkennen (8).

De methode levert informatie over de gevaarlijke eigenschappen op en maakt het mogelijk de stof te rangschikken en in te delen aan de hand van het „Globally Harmonised System” (GHS) voor de indeling van chemische stoffen die acute toxiciteit veroorzaken (9).

Het testlaboratorium moet vóór de uitvoering van het onderzoek alle beschikbare informatie over de teststof in overweging nemen. Hierbij gaat het om informatie als de identiteit en de chemische structuur van de stof, de fysisch-chemische eigenschappen, de resultaten van andere met de stof uitgevoerde toxiciteitstests in vivo of in vitro, toxicologische gegevens over qua structuur verwante stoffen en de voorgenomen toepassing(en) van de stof. Deze informatie is nodig om alle betrokkenen ervan te overtuigen dat de test relevant is voor de bescherming van de gezondheid van de mens en helpt tevens bij de keuze van een geschikte aanvangsdosis.

1.2. DEFINITIES

Acute orale toxiciteit: de schadelijke effecten die zich voordoen na orale toediening van één dosis van een stof of verschillende doses die binnen 24 uur worden toegediend.

Vertraagde sterfte: houdt in dat een dier niet binnen 48 uur sterft of stervende is maar later gedurende de observatieperiode van 14 dagen sterft.

Dosis: de toegediende hoeveelheid teststof. De dosis wordt uitgedrukt als gewicht van de teststof per gewichtseenheid van het proefdier (bijvoorbeeld mg/kg).

Manifeste toxiciteit: een algemene term die zodanige duidelijke toxiciteitsverschijnselen na de toediening van de teststof beschrijft (zie (3) voor voorbeelden), dat bij de eerstvolgende vaste dosis hevige pijn en blijvende verschijnselen van ernstig leed, stervende dieren (zie de leidraad voor humane eindpunten (8) voor criteria) of waarschijnlijke sterfte bij de meeste dieren kunnen worden verwacht.

GHS: het „Globally Harmonised Classification System” voor chemische stoffen en mengsels. Een samenwerkingsproject van de OESO (gezondheid van de mens en milieu), het Comité van deskundigen voor het vervoer van gevaarlijke goederen van de VN (fysisch-chemische eigenschappen) en de ILO (communicatie van gevaren) dat wordt gecoördineerd door het Gezamenlijk programma voor een verantwoord beheer van chemische stoffen (IOMC).

Ophanden zijnde sterfte: wanneer vóór het eerstvolgende geplande observatietijdstip een stervende toestand of sterfte wordt verwacht. Voorbeelden van indicaties voor deze toestand bij knaagdieren zijn convulsies, zijligging, liggende positie en tremors (zie de leidraad voor humane eindpunten (8) voor meer bijzonderheden).

LD50(mediaan van de letale dosis): een statistisch afgeleide enkelvoudige dosis van een stof waarvan kan worden verwacht dat 50 % van de dieren waaraan deze dosis oraal wordt toegediend, sterft. De LD50 wordt uitgedrukt als gewicht van de teststof per gewichtseenheid van het proefdier (mg/kg).

Limietdosis: een dosis die bij tests als bovengrens wordt gehanteerd (2 000 of 5 000 mg/kg).

Stervende toestand: een toestand waarop de dood volgt of waarin overleven onmogelijk is, zelfs wanneer het dier wordt behandeld (zie de leidraad voor humane eindpunten (8) voor meer bijzonderheden).

Voorspelbare sterfte: een toestand met klinische verschijnselen die wijzen op sterfte op een bekend tijdstip in de toekomst vóór het geplande einde van het experiment, bijvoorbeeld wanneer het dier geen water of voer kan bereiken (zie de leidraad voor humane eindpunten (8) voor meer bijzonderheden).

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

Groepen met dieren van hetzelfde geslacht krijgen stapsgewijs de vaste doses 5, 50, 300 en 2 000 mg/kg toegediend (bij wijze van uitzondering kan een extra vaste dosis van 5 000 mg/kg worden overwogen; zie punt 1.6.2). Op basis van een verkennende test wordt de aanvangsdosis gekozen, waarvan wordt verwacht dat er enige toxiciteitsverschijnselen optreden zonder dat er sprake is van ernstige toxische effecten of sterfte. Klinische verschijnselen en situaties die gepaard gaan met pijn, leed en ophanden zijnde sterfte, worden gedetailleerd in een aparte OESO-leidraad beschreven (8). Afhankelijk van het al dan niet optreden van toxiciteitsverschijnselen of sterfte kan er aan andere groepen dieren een hogere of lagere dosis worden toegediend. Deze procedure wordt gestaakt zodra de dosis wordt bepaald waarbij manifeste toxiciteit optreedt of ten hoogste één dier sterft, of wanneer blijkt dat er bij de hoogste dosis geen effecten worden geconstateerd of bij de laagste dosis dieren sterven.

1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.4.1. Keuze van de diersoort

Bij voorkeur wordt de rat gebruikt, maar ook andere knaagdiersoorten kunnen worden gebruikt. Normaal gesproken worden vrouwtjes gebruikt (7), omdat uit literatuuronderzoek van klassieke LD50-tests blijkt dat er meestal weinig verschil in gevoeligheid tussen mannetjes en vrouwtjes is, maar wanneer er een verschil wordt geconstateerd, zijn vrouwtjes meestal iets gevoeliger (10). Als echter uit kennis omtrent de toxicologische of toxicokinetische eigenschappen van qua structuur verwante chemische stoffen blijkt dat mannetjes waarschijnlijk gevoeliger zullen zijn, moeten mannetjes worden gebruikt. Wanneer de test bij mannetjes wordt uitgevoerd, moet hiervoor een afdoende motivering worden gegeven. Er worden gezonde jonge volwassen dieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt.

De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn. Elk dier moet bij de eerste toediening 8 tot 12 weken oud zijn en het lichaamsgewicht mag niet meer dan ± 20 % afwijken van het gemiddelde gewicht van dieren waaraan al eerder een dosis is toegediend.

1.4.2. Huisvesting en voeding

De temperatuur in de proefdierruimte dient 22 oC (± 3 oC) te zijn. Hoewel de relatieve vochtigheid minimaal 30 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Verlichting gebeurt met kunstlicht met een ritme van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De dieren mogen per dosis in groepen worden gehuisvest, maar het aantal dieren per kooi mag niet zo groot zijn dat een duidelijke observatie van elk dier wordt gestoord.

1.4.3. Voorbereiding van de dieren

De dieren worden aselect ingedeeld, gemerkt om elk dier afzonderlijk te kunnen identificeren en vóór het begin van de toediening gedurende minimaal 5 dagen in hun kooi gehouden om ze aan de omstandigheden in het laboratorium te laten wennen.

1.4.4. Bereiding van de dosis

In het algemeen worden alle doses van de teststof in het hele testbereik in een constant volume toegediend door de concentratie van de toegediende dosis te variëren. Wanneer echter een vloeibaar eindproduct of mengsel wordt getest, kan het voor de latere risicobeoordeling van die stof zinvoller zijn de teststof onverdund, d.w.z. met een constante concentratie, te gebruiken en sommige regelgevende instanties hebben dit verplicht gesteld. Het maximaal toe te dienen volume mag echter in geen geval worden overschreden. Het is afhankelijk van de grootte van het proefdier welk volume vloeistof in één keer kan worden toegediend. Bij knaagdieren mag het volume normaal gesproken niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht. Bij een waterige oplossing kan echter 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden overwogen. Voor de formulering van de dosis wordt waar mogelijk het gebruik van een waterige oplossing/suspensie/emulsie aanbevolen, in volgorde van voorkeur gevolgd door een oplossing/suspensie/emulsie in olie (bijvoorbeeld maïsolie) en eventueel een oplossing in een ander medium. Wanneer een ander medium dan water wordt gebruikt, moeten de toxicologische kenmerken van het medium bekend zijn. De dosis moet kort vóór de toediening worden bereid, tenzij de stabiliteit van het preparaat gedurende de gebruiksperiode bekend is en is aangetoond dat deze aanvaardbaar is.

1.5. PROCEDURE

1.5.1. Toediening van de dosis

De teststof wordt in één dosis toegediend met een maagsonde of een geschikte katheter. In het uitzonderlijke geval dat één dosis niet mogelijk is, kan de dosis in kleinere porties worden verdeeld die in de loop van maximaal 24 uur worden toegediend.

De dieren moeten vóór de toediening vasten (ratten mogen bijvoorbeeld de nacht vóór de toediening geen voer maar wel water krijgen en muizen gedurende 3-4 uur). Na de vastperiode worden de dieren gewogen en wordt de teststof toegediend. Na de toediening van de stof kan men ratten nog eens 3-4 uur en muizen nog eens 1-2 uur laten vasten. Wanneer een dosis in de loop van de tijd in porties wordt toegediend, kan het afhankelijk van de lengte van de periode nodig zijn de dieren voer en water te geven.

1.5.2. Verkennende test

De verkennende test is bedoeld om de juiste aanvangsdosis voor het hoofdonderzoek te kunnen kiezen. De teststof wordt overeenkomstig het stroomschema in bijlage 1 achtereenvolgens telkens aan één dier toegediend. De verkennende test is afgelopen wanneer er een beslissing kan worden genomen over de aanvangsdosis voor het hoofdonderzoek (of als er bij de laagste vaste dosis een dier sterft).

Als aanvangsdosis voor de verkennende test wordt uit de vaste doses 5, 50, 300 en 2 000 mg/kg de dosis gekozen waarvan wordt verwacht dat er manifeste toxiciteit optreedt, waar mogelijk op basis van gegevens uit in-vitro- en in-vivo-onderzoek met dezelfde chemische stof en andere qua structuur verwante chemische stoffen. Wanneer deze informatie niet beschikbaar is, wordt 300 mg/kg als aanvangsdosis gebruikt.

Er wordt ten minste 24 uur gewacht voordat een dosis aan het volgende dier wordt toegediend. Alle dieren worden gedurende ten minste 14 dagen geobserveerd.

Bij wijze van uitzondering kan alleen met een motivering op basis van specifieke regelgevingsvereisten daarnaast het gebruik van een hogere vaste dosis van 5 000 mg/kg worden overwogen (zie bijlage 3). Met het oog op het welzijn van dieren zijn dierproeven in GHS-categorie 5 tot 2 000-5 000 mg/kg niet wenselijk en moeten deze alleen worden overwogen wanneer er een grote kans is dat de resultaten van die test van direct belang zijn voor de bescherming van de gezondheid van mensen of dieren of het milieu.

Wanneer een dier waaraan bij de verkennende test de laagste vaste dosis (5 mg/kg) is toegediend, sterft, is de normale procedure dat de test wordt afgesloten en de stof wordt ingedeeld in GHS-categorie 1 (zie bijlage 1). Als de indeling echter moet worden bevestigd, kan de volgende facultatieve aanvullende procedure worden uitgevoerd. De dosis van 5 mg/kg wordt aan een tweede dier toegediend. Als dit tweede dier sterft. is de indeling in GHS-categorie 1 bevestigd en wordt het onderzoek onmiddellijk beëindigd. Als het tweede dier blijft leven, wordt de dosis van 5 mg/kg aan ten hoogste nog eens drie dieren toegediend. Omdat er een hoog risico op sterfte zal zijn, moet de dosis met het oog op het welzijn van dieren achtereenvolgens aan telkens één dier worden toegediend. Vóór de toediening aan het volgende dier moet lang genoeg worden gewacht om vast te kunnen stellen dat het vorige dier waarschijnlijk zal blijven leven. Als er een tweede dier sterft, wordt de toediening onmiddellijk gestaakt en worden er geen dieren meer gebruikt. Een tweede dier dat sterft, levert (ongeacht het aantal dieren dat bij beëindiging is getest) het resultaat A op (2 of meer dode dieren), zodat de indelingsregel van bijlage 2 bij de vaste dosis van 5 mg/kg wordt gevolgd (categorie 1 als er 2 of meer dode dieren zijn en categorie 2 als er niet meer dan één dood dier is). Daarnaast geeft bijlage 4 een leidraad voor de indeling in het EU-systeem totdat het nieuwe GHS ingevoerd is.

1.5.3. Hoofdonderzoek

1.5.3.1. Aantal dieren en dosisniveaus

Het stroomschema in bijlage 2 geeft aan wat er na de test op het aanvangsniveau moet gebeuren. Er zijn drie mogelijkheden: de test wordt gestaakt en de desbetreffende gevaar-indelingscategorie wordt toegekend, de test wordt bij een hogere vaste dosis voortgezet of de test wordt bij een lagere vaste dosis voortgezet. Met het oog op de bescherming van dieren wordt een dosisniveau dat bij de verkennende test een dood dier opleverde, bij het hoofdonderzoek niet opnieuw getest (zie bijlage 2). De ervaring heeft geleerd dat het meest waarschijnlijke resultaat bij de aanvangsdosis is dat de stof kan worden ingedeeld en dat er geen verdere tests nodig zijn.

Normaal gesproken worden er voor elk dosisniveau in totaal vijf dieren van hetzelfde geslacht gebruikt, namelijk het dier dat deze dosis bij de verkennende test toegediend heeft gekregen en nog eens vier dieren (behalve wanneer bij wijze van uitzondering een dosisniveau van het hoofdonderzoek niet in de verkennende test was opgenomen).

Het tijdsverloop tussen de toediening op elk niveau wordt bepaald door de aanvang, de duur en de ernst van de toxiciteitsverschijnselen. Met de toediening van een volgende dosis wordt gewacht totdat men er zeker van is dat de eerder geteste dieren blijven leven. Indien nodig wordt een periode van drie of vier dagen tussen de toediening op elk dosisniveau aanbevolen om observatie van vertraagde toxiciteit mogelijk te maken. Dit interval kan indien gewenst worden aangepast, bijvoorbeeld bij een onduidelijke reactie.

Wanneer het gebruik van een hoogste vaste dosis van 5 000 mg/kg wordt overwogen, moet de procedure van bijlage 3 worden gevolgd (zie ook punt 1.6.2).

1.5.3.2. Limiettest

De limiettest wordt voornamelijk uitgevoerd wanneer er informatie is die erop wijst dat het testmateriaal waarschijnlijk niet toxisch is c.q. alleen toxisch is in hogere doses dan de limieten in de regelgeving. Informatie over de toxiciteit van het testmateriaal kan afkomstig zijn van kennis omtrent vergelijkbare geteste verbindingen of vergelijkbare geteste mengsels of producten, waarbij rekening wordt gehouden met de identiteit en het percentage van de bestanddelen waarvan bekend is dat ze in toxicologisch opzicht relevant zijn. Wanneer er weinig of geen informatie over de toxiciteit van het testmateriaal is of wordt verwacht dat het toxisch is, moet het hoofdonderzoek worden uitgevoerd.

De limiettest voor deze testmethode wordt volgens de normale procedure uitgevoerd met een verkennende test met een aanvangsdosis van 2 000 mg/kg (of in uitzonderingsgevallen 5 000 mg/kg), gevolgd door de toediening van deze dosis aan nog eens vier dieren.

1.6. OBSERVATIE

De dieren worden gedurende de eerste 30 minuten na de toediening ten minste éénmaal elk afzonderlijk geobserveerd, gedurende de eerste 24 uur periodiek met bijzondere aandacht voor de eerste vier uur en vervolgens dagelijks gedurende in totaal 14 dagen, behalve wanneer ze met het oog op het welzijn van dieren uit het onderzoek moeten worden genomen en op humane wijze moeten worden gedood of dood aangetroffen worden. De observatieduur is echter geen regel waarvan niet kan worden afgeweken. Deze moet worden bepaald aan de hand van de toxische reacties, het tijdstip waarop ze beginnen en de duur van de herstelperiode en kan dus worden verlengd indien dit nodig wordt geacht. Het is belangrijk op welk tijdstip de toxiciteitsverschijnselen verschijnen en verdwijnen, vooral als er een neiging is tot vertraagde toxiciteitsverschijnselen (11). Alle observaties worden systematisch geregistreerd en voor elk dier wordt een apart verslag bijgehouden.

Als de dieren toxiciteitsverschijnselen blijven vertonen, is aanvullende observatie nodig. Bij de observatie wordt gekeken naar veranderingen in de huid en de vacht, de ogen en de slijmvliezen, de ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het autonome en centrale zenuwstelsel, de somatomotorische activiteit en het gedragspatroon. Er moet worden gelet op de observatie van tremors, convulsies, speekselafscheiding, diarree, lethargie, slaap en coma. Er moet rekening worden gehouden met de beginselen en criteria in de leidraad voor humane eindpunten (8). Dieren die stervend worden aangetroffen en dieren die hevige pijn hebben of blijvende tekenen van ernstig leed vertonen, worden op humane wijze gedood. Wanneer dieren op humane wijze worden gedood of dood worden aangetroffen, wordt zo nauwkeurig mogelijk geregistreerd op welk tijdstip ze zijn gestorven.

1.6.1. Lichaamsgewicht

Kort vóór de toediening van de teststof en vervolgens ten minste wekelijks wordt het gewicht van elk dier bepaald. De gewichtsverandering wordt berekend en geregistreerd. Aan het einde van de test worden de dieren die nog leven gewogen en vervolgens op humane wijze gedood.

1.6.2. Pathologie

Op alle proefdieren (ook degene die tijdens de test sterven of met het oog op het welzijn van dieren uit het onderzoek worden genomen) wordt macroscopische obductie uitgevoerd. Alle macroscopische pathologische veranderingen worden voor elk dier geregistreerd. Microscopisch onderzoek van organen die tekenen van macroscopische pathologische veranderingen vertonen bij dieren die 24 uur of langer na de toediening nog leven, kan ook worden overwogen aangezien dit nuttige informatie kan opleveren.

2. GEGEVENS

Er worden voor elk dier apart gegevens verstrekt. Daarnaast worden alle gegevens in tabelvorm samengevat met voor alle testgroepen vermelding van het gebruikte aantal dieren, het aantal dieren dat toxiciteitsverschijnselen vertoonde, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of op humane wijze is gedood, het tijdstip waarop elk dier is gestorven, een beschrijving van de toxische effecten met het verloop en de omkeerbaarheid en de obductiebevindingen.

3. RAPPORTAGE

3.1. TESTVERSLAG

In het testverslag wordt indien van toepassing de volgende informatie opgenomen:

Teststof:

—de fysische aard, de zuiverheid en indien relevant de fysisch-chemische eigenschappen (bv. de isomeer-samenstelling);

—identificatiegegevens, zoals het CAS-nr.

Medium (indien van toepassing):

—een motivering voor de keuze van het medium als een ander medium dan water wordt gebruikt.

Proefdieren:

—de gebruikte soort/stam;

—de microbiologische status van de dieren, indien deze bekend is;

—het aantal dieren, hun leeftijd en hun geslacht (indien van toepassing een motivering voor het gebruik van mannetjes in plaats van vrouwtjes);

—de herkomst, de huisvesting, de voeding enz.

Testomstandigheden:

—gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof met bijzonderheden over de fysische vorm van het toegediende materiaal;

—gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof met vermelding van het toegediende volume en het toedieningstijdstip;

—gedetailleerde gegevens over het voer en het water (met vermelding van de aard/herkomst van het voer en de herkomst van het water);

—de motivering voor de keuze van de aanvangsdosis.

Resultaten:

—een tabel met gegevens over de respons en de dosis voor elk dier (bv. dieren met toxiciteitsverschijnselen of sterfte en de aard, de hevigheid en de duur van de effecten);

—een tabel met het lichaamsgewicht en de veranderingen in het lichaamsgewicht;

—het gewicht van de dieren op de toedieningsdag, daarna een keer per week en tenslotte wanneer ze sterven of gedood worden;

—de datum en het tijdstip waarop de dieren sterven als dit eerder gebeurt dan gepland;

—voor elk dier de aanvang en het verloop van de toxiciteitsverschijnselen en of ze reversibel waren;

—voor elk dier de obductiebevindingen en de histopathologische bevindingen, indien beschikbaar.

Bespreking en interpretatie van de resultaten.

Conclusies.

4 REFERENTIES

(1)British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92.

(2)Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291.

(3)Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482

(4)Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.

(5)Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol.

(6)Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002) Statistical evaluation on the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196.

(7)OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

(8)OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 19.

(9)OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF html|.

(10)Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33,223-231.

(11)Chan, P.K. and A.W. Hayes (1994). Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

BIJLAGE 1:

STROOMSCHEMA VOOR DE VERKENNENDE TEST

image

image

BIJLAGE 2:

STROOMSCHEMA VOOR HET HOOFDONDERZOEK

image

image

BIJLAGE 3

CRITERIA VOOR DE INDELING VAN TESTSTOFFEN MET EEN VERWACHTE LD50, DIE HOGER LIGT DAN 2 000 MG/KG ZONDER DAT ER TESTS BEHOEVEN TE WORDEN UITGEVOERD

De criteria voor de gevarencategorie 5 zijn bedoeld om reststoffen te kunnen signaleren die een betrekkelijk geringe acute toxiciteit hebben maar onder bepaalde omstandigheden een gevaar voor kwetsbare bevolkingsgroepen kunnen opleveren. Van deze stoffen wordt verwacht dat ze een orale of dermale LD50 tussen 2 000 en 5 000 mg/kg hebben of een vergelijkbare toxiciteit voor andere routes. Deze teststoffen kunnen in de volgende gevallen in de gevarencategorie 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg worden ingedeeld (categorie 5 in het GHS):

a)als ze via een van de testschema s van bijlage 2 op basis van de sterftecijfers in deze categorie terechtkomen;

b)als er al betrouwbaar bewijsmateriaal beschikbaar is waaruit blijkt dat de LD50 binnen het interval van categorie 5 valt of als uit ander onderzoek bij dieren of toxische effecten bij de mens blijkt dat er sprake is van een risico voor de gezondheid van de mens van acute aard;

c)via extrapolatie, raming of meting van gegevens als indeling in een gevaarlijkere categorie niet terecht is en

—er betrouwbare informatie beschikbaar is die wijst op significante toxische effecten bij de mens, of

—bij tests tot waarden van categorie 4 langs orale weg sterfte wordt waargenomen, of

—wanneer het oordeel van deskundigen bevestigt dat er bij tests tot waarden voor categorie 4 significante klinische toxiciteitsverschijnselen zijn met uitzondering van diarree, pilo-erectie of een onverzorgd uiterlijk, of

—wanneer het oordeel van deskundigen betrouwbare informatie bevestigt die op grond van andere dierproeven op mogelijke significante acute effecten wijst.

TESTEN BI J DOSES VAN MEER DAN 2 000 MG/KG

Bij wijze van uitzondering kan alleen met een motivering op basis van specifieke regelgevingsvereisten daarnaast het gebruik van een hogere vaste dosis van 5 000 mg/kg worden overwogen. Met het oog op het welzijn van dieren zijn dierproeven bij 5 000 mg/kg niet wenselijk en moeten deze alleen worden overwogen wanneer er een grote kans is dat de resultaten van die proeven van direct belang zijn voor de bescherming van de gezondheid van dieren of mensen (9).

Verkennende test

De beslissingsregels voor de sequentiële procedure van bijlage 1 worden uitgebreid met een dosis van 5 000 mg/kg. Dit betekent dat wanneer er bij een verkennende test een aanvangsdosis van 5 000 mg/kg wordt gebruikt die resultaat A (sterfte) oplevert, een tweede dier bij 2 000 mg/kg wordt getest; bij resultaat B of C (manifeste toxiciteit of geen toxiciteit) wordt 5 000 mg/kg als aanvangsdosis voor het hoofdonderzoek gekozen. Als een andere aanvangsdosis dan 5 000 mg/kg wordt gebruikt, wordt de test bij resultaat B of C met 2 000 mg/kg voortgezet met 5 000 mg/kg; wanneer vervolgens 5 000 mg/kg resultaat A oplevert, wordt 2 000 mg/kg als aanvangsdosis voor het hoofdonderzoek gekozen en bij resultaat B of C wordt 5 000 mg/kg als aanvangsdosis gekozen.

Hoofdonderzoek

De beslissingsregels voor de sequentiële procedure van bijlage 2 worden uitgebreid met een dosis van 5 000 mg/kg Dit betekent dat wanneer er bij het hoofdonderzoek een aanvangsdosis van 5 000 mg/kg wordt gebruikt die resultaat A (> 2 dode dieren) oplevert, een tweede groep bij 2 000 mg/kg wordt getest; bij resultaat B (manifeste toxiciteit en/of < 1 dood dier) of C (geen toxiciteit) wordt de stof niet volgens het GHS ingedeeld. Als een andere aanvangsdosis dan 5 000 mg/kg wordt gebruikt, wordt de test bij resultaat C met 2 000 mg/kg voortgezet met 5 000 mg/kg; wanneer vervolgens 5 000 mg/kg resultaat A oplevert, wordt de stof ingedeeld in categorie 5 van het GHS en bij resultaat B of C wordt de stof niet ingedeeld.

BIJLAGE 4:

TESTMETHODE B.l bis

Leidraad voor de indeling in het EU-systeem gedurende de overgangsperiode totdat het „Globally Harmonised Classification System” (GHS) volledig is ingevoerd (overgenomen uit referentie (8))

image

image

B.l ter. ACUTE ORALE TOXICITEIT: METHODE TER BEPALING VAN DE ACUTE-TOXICITEITSKLASSE

1. METHODE

Deze methode is gelijkwaardig aan TG 423 (2001) van de OESO.

1.1. INLEIDING

De in deze test beschreven methode ter bepaling van de acute-toxiciteitsklasse (1) is een stapsgewijze procedure waarbij voor iedere stap drie dieren van hetzelfde geslacht worden gebruikt. Afhankelijk van het aantal dode en/of stervende dieren kunnen er gemiddeld twee tot vier stappen nodig zijn om een uitspraak over de acute toxiciteit van de teststof te kunnen doen. Deze procedure is reproduceerbaar, gebruikt heel weinig dieren en kan stoffen op een vergelijkbare wijze rangschikken als de andere testmethoden voor acute toxiciteit. De methode ter bepaling van de acute-toxiciteitsklasse is gebaseerd op biometrische evaluaties (2)(3)(4)(5) met vaste doses, die ver genoeg uiteenliggen om een stof met het oog op de indeling en de bepaling van de gevaren te kunnen rangschikken. De in 1996 goedgekeurde methode is zowel op nationaal (6) als op internationaal (7) niveau uitgebreid in vivo gevalideerd in vergelijking met LD50-gegevens uit de literatuur.

Richtsnoeren voor de keuze van de meest geschikte testmethode voor een bepaald doel worden gegeven in de leidraad voor tests op acute orale toxiciteit (8). Deze leidraad bevat ook aanvullende informatie over de uitvoering en interpretatie van testmethode B.l ter.

Teststoffen behoeven niet te worden toegediend in doses waarvan bekend is dat ze door een bijtende of sterk irriterende werking hevige pijn en leed veroorzaken. Stervende dieren of dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevig en voortdurend leed vertonen, worden op humane wijze gedood en worden bij de interpretatie van de testresultaten op dezelfde manier behandeld als dieren die tijdens de test gestorven zijn. Er is een aparte leidraad met criteria om te bepalen of stervende of hevig lijdende dieren moeten worden gedood en richtsnoeren om voorspelbare of ophanden zijnde sterfte te herkennen (9).

Bij de methode worden vooraf bepaalde doses gebruikt en de resultaten maken het mogelijk de stof te rangschikken en in te delen aan de hand van het „Globally Harmonised System” voor de indeling van chemische stoften die acute toxiciteit veroorzaken (10).

De methode is in principe niet bedoeld om de berekening van een exacte LD50 mogelijk te maken, maar er kan wel een zeker blootstellingsinterval worden bepaald waar sterfte te verwachten valt, aangezien sterfte van een deel van de dieren het belangrijkste eindpunt van deze test blijft. Een LD50 kan met deze methode alleen worden bepaald wanneer ten minste twee doses een sterfte tussen 0 % en 100 % opleveren. Het gebruik van een aantal vooraf bepaalde doses, ongeacht de teststof, waarbij de indeling expliciet wordt gekoppeld aan het aantal dieren waarbij uiteenlopende toestanden worden geobserveerd, biedt betere mogelijkheden voor consistentie en herhaalbaarheid bij rapportage door verschillende laboratoria.

Het testlaboratorium moet vóór de uitvoering van het onderzoek alle beschikbare informatie over de teststof in overweging nemen. Hierbij gaat het om informatie als de identiteit en de chemische structuur van de stof, de fysisch-chemische eigenschappen, het resultaat van andere met de stof uitgevoerde toxiciteitstests in vivo of in vitro, toxicologische gegevens over de qua structuur verwante stoffen en de voorgenomen toepassing(en) van de stof. Deze informatie is nodig om alle betrokkenen ervan te overtuigen dat de test relevant is voor de bescherming van de gezondheid van de mens en helpt tevens bij de keuze van de geschiktste aanvangsdosis.

1.2. DEFINITIES

Acute orale toxiciteit: de schadelijke effecten die zich voordoen na orale toediening van een dosis van een stof of verschillende doses die binnen 24 uur worden toegediend.

Vertraagde sterfte: houdt in dat een dier niet binnen 48 uur sterft of stervende is maar later gedurende de observatieperiode van 14 dagen sterft.

Dosis: de toegediende hoeveelheid teststof. De dosis wordt uitgedrukt als gewicht van de teststof per gewichtseenheid van het proefdier (bijvoorbeeld mg/kg).

GHS: het „Globally Harmonised Classification System” voor chemische stoffen en mengsels. Een samenwerkingsproject van de OESO (gezondheid van de mens en milieu), het Comité van deskundigen voor het vervoer van gevaarlijke goederen van de VN (fysisch-chemische eigenschappen) en de ILO (communicatie van gevaren) dat wordt gecoördineerd door het Gezamenlijk programma voor een verantwoord beheer van chemische stoften (IOMC).

Ophanden zijnde sterfte: wanneer voor het eerstvolgende geplande observatietijdstip een stervende toestand of sterfte wordt verwacht. Voorbeelden van indicaties voor deze toestand bij knaagdieren zijn convulsies, zijligging, liggende positie en tremors (zie de leidraad voor humane eindpunten (9) voor meer bijzonderheden).

LD50(mediaan van de orale letale dosis): een statistisch afgeleide enkelvoudige dosis van een stof waarvan kan worden verwacht dat 50 % van de dieren waaraan deze dosis oraal wordt toegediend, sterft. De LD50 wordt uitgedrukt als gewicht van de teststof per gewichtseenheid van het proefdier (mg/kg).

Limietdosis: een dosis die bij tests als bovengrens wordt gehanteerd (2 000 of 5 000 mg/kg).

Stervende toestand: een toestand waarop de dood volgt of waarin overleven onmogelijk is, zelfs wanneer het dier wordt behandeld (zie de leidraad voor humane eindpunten (9) voor meer bijzonderheden).

Voorspelbare sterfte: een toestand met klinische verschijnselen die wijzen op sterfte op een bekend tijdstip in de toekomst voor het geplande einde van het experiment, bijvoorbeeld wanneer het dier geen water of voer kan bereiken (zie de leidraad voor humane eindpunten (9) voor meer bijzonderheden).

1.3. PRINCIPE VAN DE TEST

Het principe van de test is dat op basis van een stapsgewijze procedure, waarbij per stap een zo klein mogelijk aantal dieren wordt gebruikt, voldoende informatie over de acute toxiciteit van de teststof wordt verkregen om deze in te kunnen delen. Een van de vaste doses van de stof wordt oraal aan een groep proefdieren toegediend. De stof wordt stapsgewijs getest en bij elke stap worden drie dieren van hetzelfde geslacht (normaal gesproken vrouwtjes) gebruikt. Het resultaat van de stap (dieren die ten gevolge van de toediening van de stof sterven of niet) is bepalend voor de volgende stap, namelijk:

—de test kan worden gestaakt,

—dezelfde dosis wordt aan nog eens drie dieren toegediend of

—de eerstvolgende hogere of lagere dosis wordt aan drie andere dieren toegediend.

Bijlage 1 bevat een gedetailleerde beschrijving van de testprocedure. Met deze methode kan een uitspraak worden gedaan over de indeling van de teststof in een van de toxiciteitsklassen die elk worden begrensd door vaste LD50 waarden.

1.4. BESCHRIJVING VAN DE METHODE

1.4.1. Keuze van de diersoort

Bij voorkeur wordt de rat gebruikt, maar ook andere knaagdiersoorten kunnen worden gebruikt Normaal gesproken worden vrouwtjes gebruikt (9), omdat uit literatuuronderzoek van klassieke LD50-tests blijkt dat er weliswaar meestal weinig verschil in gevoeligheid tussen mannetjes en vrouwtjes is, maar dat vrouwtjes meestal iets gevoeliger zijn wanneer er verschillen worden geconstateerd (11). Als echter uit kennis omtrent de toxicologische of toxicokinetische eigenschappen van qua structuur verwante chemische stoffen blijkt dat mannetjes waarschijnlijk gevoeliger zullen zijn, moeten mannetjes worden gebruikt. Wanneer de test bij mannetjes wordt uitgevoerd, moet hiervoor een afdoende motivering worden gegeven.

Er worden gezonde jonge volwassen dieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt. De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn. Elk dier moet bij de eerste toediening 8 tot 12 weken oud zijn en het lichaamsgewicht mag niet meer dan ± 20 % afwijken van het gemiddelde gewicht van dieren waaraan al eerder een dosis is toegediend.

1.4.2. Huisvesting en voeding

De temperatuur in de proefdierruimte dient 22 oC (± 3 oC) te zijn. Hoewel de relatieve vochtigheid minimaal 30 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Verlichting gebeurt met kunstlicht met een ritme van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De dieren mogen per dosis in groepen worden gehuisvest, maar het aantal dieren per kooi mag niet zo groot zijn dat een duidelijke observatie van elk dier wordt gestoord.

1.4.3. Voorbereiding van de dieren

De dieren worden aselect ingedeeld, gemerkt om elk dier afzonderlijk te kunnen identificeren en voor de toediening gedurende minimaal 5 dagen in hun kooi gehouden om ze aan de omstandigheden in het laboratorium te laten wennen.

1.4.4. Bereiding van de dosis

In het algemeen worden alle doses van de teststof in het hele testbereik in een constant volume toegediend door de concentratie van de toegediende dosis te variëren. Wanneer echter een vloeibaar eindproduct of mengsel wordt getest, kan het voor de latere risicobeoordeling van die stof zinvoller zijn de teststof onverdund, d.w.z. met een constante concentratie, te gebruiken en sommige regelgevende instanties hebben dit verplicht gesteld. Het maximaal toe te dienen volume mag echter in geen geval worden overschreden. Het is afhankelijk van de grootte van het proefdier welk volume vloeistof in één keer kan worden toegediend. Bij knaagdieren mag het volume normaal gesproken niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht. Bij een waterige oplossing kan echter 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden overwogen. Voor de formulering van de dosis wordt waar mogelijk het gebruik van een waterige oplossing/suspensie/emulsie aanbevolen, in volgorde van voorkeur gevolgd door een oplossing/suspensie/emulsie in olie (bijvoorbeeld maïsolie) en eventueel een oplossing in een ander medium. Wanneer een ander medium dan water wordt gebruikt, moeten de toxicologische kenmerken van het medium bekend zijn. De dosis moet kort voor de toediening worden bereid, tenzij de stabiliteit van het preparaat gedurende de gebruiksperiode bekend is en is aangetoond dat deze aanvaardbaar is.

1.5. PROCEDURE

1.5.1. Toediening van de dosis

De teststof wordt in een dosis toegediend met een maagsonde of een geschikte katheter In het uitzonderlijke geval dat een dosis niet mogelijk is, kan de dosis in kleinere porties worden verdeeld die in de loop van maximaal 24 uur worden toegediend.

De dieren moeten voor de toediening vasten (ratten mogen bijvoorbeeld de nacht voor de toediening geen voer maar wel water krijgen en muizen gedurende 3-4 uur). Na de vastpenode worden de dieren gewogen en wordt de teststof toegediend. Na de toediening van de stof kan men ratten nog eens 3-4 uur en muizen nog eens 1-2 uur laten vasten. Wanneer een dosis in de loop van de tijd in porties wordt toegediend, kan het afhankelijk van de lengte van de periode nodig zijn de dieren voer en water te geven.

1.5.2. Aantal dieren en hoogte van de doses

Voor elke stap worden er drie dieren gebruikt. Een van de vier vaste doses 5, 50, 300 en 2 000 mg/kg lichaamsgewicht wordt als aanvangsdosis gekozen. Als aanvangsdosis wordt de dosis gekozen waarbij naar alle waarschijnlijkheid enkele dieren zullen sterven. In de stroomschema's van bijlage 1 wordt de procedure beschreven die bij elk van de aanvangsdoses moet worden gevolgd. Daarnaast bevat bijlage 4 een leidraad voor de indeling in het EU systeem totdat het nieuwe GHS is ingevoerd.

Wanneer de beschikbare informatie erop wijst dat er bij de hoogste aanvangdosis (2 000 mg/kg lichaamsgewicht) waarschijnlijk geen dieren zullen sterven, moet er een limiettest worden uitgevoerd. Wanneer er geen informatie over een te testen stof is, wordt met het oog op het welzijn van dieren aanbevolen 300 mg/kg lichaamsgewicht als aanvangsdosis te gebruiken.

Het tijdsverloop tussen de toediening aan de verschillende groepen wordt bepaald door de aanvang, de duur en de ernst van de toxiciteitsverschijnselen. Met de toediening van een volgende dosis moet worden gewacht totdat men er zeker van is dat de eerder geteste dieren blijven leven.

Bij wijze van uitzondering kan alleen met een motivering op basis van specifieke regelgevingsvereisten daarnaast het gebruik van een hogere vaste dosis van 5 000 mg/kg lichaamsgewicht worden overwogen (zie bijlage 2). Met het oog op het welzijn van dieren zijn dierproeven in GHS categorie 5 (2 000-5 000 mg/kg) niet wenselijk en moeten deze alleen worden overwogen wanneer er een grote kans is dat de resultaten van die test van direct belang zijn voor de bescherming van de gezondheid van mens of dier of het milieu.

1.5.3. Limiettest

De limiettest wordt voornamelijk uitgevoerd wanneer er informatie is die erop wijst dat het testmateriaal waarschijnlijk niet toxisch is c.q. alleen toxisch is in hogere doses dan de limieten in de regelgeving. Informatie over de toxiciteit van het testmateriaal kan afkomstig zijn van kennis omtrent vergelijkbare geteste verbindingen of vergelijkbare geteste mengsels of producten, waarbij rekening wordt gehouden met de identiteit en het percentage van de bestanddelen waarvan bekend is dat ze in toxicologisch opzicht relevant zijn. Wanneer er weinig of geen informatie over de toxiciteit van het testmateriaal is of wordt verwacht dat het toxisch is, moet het hoofdonderzoek worden uitgevoerd.

Er kan een limiettest met een dosisniveau van 2 000 mg/kg worden uitgevoerd met zes dieren (drie dieren per stap). Bij wijze van uitzondering kan er een limiettest met een dosisniveau van 5 000 mg/kg worden uitgevoerd met drie dieren (zie bijlage 2). Als er dieren vanwege de toediening van de stof sterven, kan het nodig zijn de test bij de eerstvolgende lagere dosis voort te zetten.

1.6. OBSERVATIE

De dieren worden gedurende de eerste 30 minuten na de toediening ten minste eenmaal elk afzonderlijk geobserveerd, gedurende de eerste 24 uur periodiek met bijzondere aandacht voor de eerste vier uur en vervolgens dagelijks gedurende in totaal 14 dagen, behalve wanneer ze met het oog op het welzijn van dieren uit het onderzoek moeten worden genomen en op humane wijze moeten worden gedood of dood aangetroffen worden. De observatieduur is echter geen regel waarvan niet kan worden afgeweken. Deze moet worden bepaald aan de hand van de toxische reacties, het tijdstip waarop ze beginnen en de duur van de herstelperiode en kan dus worden verlengd indien dit nodig wordt geacht. Het is belangrijk op welk tijdstip de toxiciteitsverschijnselen verschijnen en verdwijnen, vooral als er een neiging is tot vertraagde toxiciteitsverschijnselen (12). Alle observaties worden systematisch geregistreerd en voor elk dier wordt een apart verslag bijgehouden.

Als de dieren toxiciteitsverschijnselen blijven vertonen, is aanvullende observatie nodig. Bij de observatie wordt gekeken naar veranderingen in de huid en de vacht, de ogen en de slijmvliezen, de ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het autonome en centrale zenuwstelsel, de somatomotorische activiteit en het gedragspatroon. Er moet worden gelet op de observatie van tremors, convulsies, speekselafscheiding, diarree, lethargie, slaap en coma. Er moet rekening worden gehouden met de beginselen en criteria in de leidraad voor humane eindpunten (9). Dieren die stervend worden aangetroffen en dieren die hevige pijn hebben of blijvende tekenen van ernstig leed vertonen, worden op humane wijze gedood. Wanneer dieren op humane wijze worden gedood of dood worden aangetroffen, wordt zo nauwkeurig mogelijk geregistreerd op welk tijdstip ze zijn gestorven.

1.6.1. Lichaamsgewicht

Kort vóór de toediening van de teststof en vervolgens ten minste wekelijks wordt het gewicht van elk dier bepaald. De gewichtsverandering wordt berekend en geregistreerd. Aan het einde van de test worden de dieren die nog leven gewogen en op humane wijze gedood.

1.6.2. Pathologie

Op alle proefdieren (ook degene die tijdens de test sterven of met het oog op het welzijn van dieren uit het onderzoek worden genomen) wordt macroscopische obductie uitgevoerd. Alle macroscopische pathologische veranderingen worden voor elk dier geregistreerd. Microscopisch onderzoek van organen die tekenen van macroscopische pathologische veranderingen vertonen bij dieren die na 24 uur of langer nog leven, kan ook worden overwogen aangezien dit nuttige informatie kan opleveren.

2. GEGEVENS

Er worden voor elk dier apart gegevens verstrekt. Daarnaast worden alle gegevens in tabelvorm samengevat met voor alle testgroepen vermelding van het gebruikte aantal dieren, het aantal dieren dat toxiciteitsverschijnselen vertoonde, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of op humane wijze is gedood, het tijdstip waarop elk dier is gestorven, een beschrijving van de toxische effecten met het verloop en de omkeerbaarheid en de obductiebevindingen.

3. RAPPORTACE

3.1. TESTVERSLAG

In het testverslag wordt indien van toepassing de volgende informatie opgenomen:

Teststof

—de fysische aard, de zuiverheid en indien relevant de fysisch chemische eigenschappen (bv. de isomeersamenstelling);

—identificatiegegevens, zoals het CAS-nr.

Medium (indien van toepassing):

—een motivering voor de keuze van het medium als een ander medium dan water wordt gebruikt.

Proefdieren:

—de gebruikte soort/stam;

—de microbiologische status van de dieren, indien deze bekend is;

—het aantal dieren, hun leeftijd en hun geslacht (indien van toepassing een motivering voor het gebruik van mannetjes in plaats van vrouwtjes);

—de herkomst, de huisvesting, de voeding enz.

Testomstandigheden:

—gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof met bijzonderheden over de fysische vorm van het toegediende materiaal;

—gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof met vermelding van het toegediende volume en het toedieningstijdstip;

—gedetailleerde gegevens over het voer en het water (met vermelding van de aard/herkomst van het voer en de herkomst van het water);

—de motivering voor de keuze van de aanvangsdosis.

Resultaten:

—een tabel met gegevens over de respons en de dosis voor elk dier (bv. dieren met toxiciteitsverschijnselen of sterfte en de aard, de hevigheid en de duur van de effecten);

—een tabel met het lichaamsgewicht en de veranderingen in het lichaamsgewicht;

—het gewicht van de dieren op de toedieningsdag, daarna een keer per week en tenslotte wanneer ze sterven of gedood worden;

—de datum en het tijdstip waarop de dieren sterven, als dit eerder gebeurt dan gepland;

—voor elk dier de aanvang en het verloop van de toxiciteitsverschijnselen en of ze reversibel waren;

—voor elk dier de obductiebevindingen en de histopathologische bevindingen, indien beschikbaar.

Bespreking en interpretatie van de resultaten.

Conclusies.

4. REFERENTIES

(1)Roll R., Hofer-Bosse Th. and Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86.

(2)Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.

(3)Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute Toxic Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610.

(4)Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute Toxic Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.

(5)Diener W., and Schlede E. (1999). Acute Toxicity Class Methods- Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134.

(6)Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute Toxic Class Method — An Alternative to the LD50, Test. Arch Toxicol 66, 455-470.

(7)Schlede E, Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute Toxic Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.

(8)OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

(9)OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Chemical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 19.

(10)OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11. [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].

(11)Lipnick R.L., Cotruvo, J.A., Hill R.N., Bruce R.D., Stitzel K.A., Walker A.P., Chu I., Goddard M., Segal L., Springer, J.A. and Myers R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.

(12)Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

BIJLAGE 1

PROCEDURE VOOR ELKE AANVANGSDOSIS

ALGEMENE OPMERKINGEN

In de stroomschema's in deze bijlage wordt voor elke aanvangsdosis de te volgen procedure geschetst:

—Bijlage 1 A: Aanvangsdosis 5 mg/kg lichaamsgewicht

—Bijlage 1 B: Aanvangsdosis 50 mg/kg lichaamsgewicht

—Bijlage 1 C: Aanvangsdosis 300 mg/kg lichaamsgewicht

—Bijlage 1 D: Aanvangsdosis 2 000 mg/kg lichaamsgewicht

De pijlen geven, afhankelijk van het aantal gestorven of op humane wijze gedode dieren, de te volgen procedure aan.

BIJLAGE 1 A

TESTPROCEDURE MET EEN AANVANGSDOSIS VAN 5 MG/KG LICHAAMSGEWICHT

image

BIJLAGE 1 B

TESTPROCEDURE MET EEN AANVANGSDOSIS VAN 50 MG/KG LICHAAMSGEWICHT

image

BIJLAGE 1 C

TESTROCEDURE MET EEN AANVANGSDOSIS VAN 300 MG/KG LICHAAMSGEWICHT

image

BIJLAGE 1 D

TESTPROCEDURE MET EEN AANVANGSDOSIS VAN 2 000 MG/KG LICHAAMSGEWICHT

image

BIJLAGE 2

CRITERIA VOOR DE INDELING VAN TESTSTOFFEN MET EEN VERWACHTE LD50, DIE HOGER LIGT DAN 2 000 MG/KG ZONDER DAT ER TESTS BEHOEVEN TE WORDEN UITGEVOERD

De criteria voor de gevarencategorie 5 zijn bedoeld om teststoffen te kunnen signaleren die een betrekkelijk geringe acute toxiciteit hebben, maar onder bepaalde omstandigheden een gevaar voor kwetsbare bevolkingsgroepen kunnen opleveren. Van deze stoffen wordt verwacht dat ze een orale of dermale LD50 tussen 2 000 en 5 000 mg/kg hebben of een vergelijkbare toxiciteit voor andere routes. Deze teststoffen moeten in de volgende gevallen in de gevarencategorie 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg worden ingedeeld (categorie 5 in het GHS).

a)als ze via een van de testschema's van bijlage 1A-1D op basis van de sterftecijfers in deze categorie terechtkomen;

b)als er al betrouwbaar bewijsmateriaal beschikbaar is waaruit blijkt dat de LD50 binnen het interval van categorie 5 valt of als uit ander onderzoek bij dieren of toxische effecten bij de mens blijkt dat er sprake is van een risico voor de gezondheid van de mens van acute aard;

c)via extrapolatie, raming of meting van gegevens als indeling in een gevaarlijkere categorie niet terecht is en

—er betrouwbare informatie beschikbaar is die wijst op significante toxische effecten bij de mens of

—bij tests tot waarden van categorie 4 langs orale weg sterfte wordt waargenomen of

—wanneer het oordeel van deskundigen bevestigt dat er bij tests tot waarden voor categorie 4 significante klinische toxiciteitsverschijnselen zijn, met uitzondering van diarree, pilo-erectie of een onverzorgd uiterlijk of

—wanneer het oordeel van deskundigen betrouwbare informatie bevestigt die op grond van andere dierproeven op mogelijke significante acute effecten wijst.

TESTEN BIJ DOSES VAN MEER DAN 2 000 MG/KG

Met het oog op het welzijn van dieren zijn dierproeven in categorie 5 (5 000 mg/kg) niet wenselijk en moeten deze alleen worden overwogen wanneer er een grote kans is dat de resultaten van die test van direct belang zijn voor de bescherming van de gezondheid van mens of dier (10). Er dienen geen verdere tests bij hogere doses te worden uitgevoerd.

Wanneer testen met een dosis van 5 000 mg/kg nodig is, wordt er slechts één stap (d.w.z. drie dieren) uitgevoerd. Als het eerste dier na toediening sterft, gaat de toediening verder met 2 000 mg/kg volgens de stroomschema's van bijlage 1. Als het eerste dier blijft leven, wordt aan nog eens twee dieren 5 000 mg/kg toegediend. Als slechts één van de drie dieren sterft, wordt ervan uitgegaan dat de LD50 hoger is dan 5 000 mg/kg. Als beide dieren sterven, gaat de toediening verder met 2 000 mg/kg.

BIJLAGE 3

TESTMETHODE B.1 ter: Leidraad voor de indeling in het EU-systeem gedurende de overgangsperiode totdat het „Globally Harmonised Classification System” (GHS) volledig is ingevoerd (overgenomen uit referentie (8))

image

image

image

image

B.2. ACUTE INHALATIETOXICITEIT

1. METHODE

1.1. INLEIDING

Het is nuttig om over oriënterende informatie te beschikken ten aanzien van de deeltjesgrootte, de dampspanning, het smeltpunt, het kookpunt, het vlampunt en het ontploffingsgevaar (indien van toepassing) van de te onderzoeken stof.

Zie ook algemene inleiding deel B (punt A).

1.2. DEFINITIES

Zie algemene inleiding deel B (punt B).

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Geen.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

Verscheidene groepen proefdieren worden gedurende een vastgestelde periode aan geleidelijk stijgende concentraties van de teststof blootgesteld. Er wordt één concentratie per groep gebruikt. Vervolgens worden de symptomen en sterfte waargenomen. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het einde van de studie leven, wordt necropsie verricht.

Dieren die hevige en aanhoudende tekenen van angst en pijn vertonen, zouden op humane wijze moeten worden gedood. Het doseren van teststoffen op een manier waarvan bekend is dat deze als gevolg van corrosieve of ernstig irriterende eigenschappen pijn en ongemak veroorzaakt, behoeft niet te worden uitgevoerd.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

Geen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.1. Voorbereidingen

Vóór het onderzoek worden de dieren ten minste 5 dagen onder dezelfde huisvestings- en voedingsomstandigheden gehouden als tijdens de proef. Gezonde jonge dieren worden op een willekeurige manier vóór de behandeling in het vereiste aantal groepen ingedeeld. Het is niet nodig de dieren aan een gesimuleerde blootstelling te onderwerpen, tenzij dit wenselijk is bij het type expositieapparatuur dat wordt gebruikt.

Vaste teststoffen moeten eventueel worden gemicroniseerd om deeltjes van geschikte grootte te verkrijgen.

Waar nodig wordt een passend medium aan de teststof toegevoegd, teneinde de juiste concentratie van de proefstof in de atmosfeer te bereiken, in dat geval moet ook een mediumcontrolegroep worden toegevoegd. Indien een medium of andere additieven worden gebruikt om de dosering te vergemakkelijken, moet bekend zijn dat deze geen toxische effecten veroorzaken. In voorkomend geval kunnen bestaande gegevens worden gebruikt.

1.6.2. Proefomstandigheden

1.6.2.1. Proefdieren

Tenzij er contra-indicaties bestaan, wordt de voorkeur gegeven aan ratten. De proef dient te worden uitgevoerd met een rattenstam die gewoonlijk in laboratoria wordt gebruikt. Per geslacht mag bij het begin van de studie het gewicht van de dieren die worden gebruikt, niet meer dan 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken.

1.6.2.2. Aantal en geslacht

Voor ieder concentratieniveau moeten ten minste tien knaagdieren (vijf wijfjes en vijf mannetjes) worden gebruikt. De wijfjes moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn.

Opmerking: In acute-toxiciteittesten met dieren van een hogere orde dan knaagdieren, dienen kleinere aantallen in overweging te worden genomen. De doses dienen zorgvuldig te worden gekozen, en alle moeite dient worden gedaan om matig toxische doses niet te boven te gaan. In dergelijke testen dient toediening van letale doses van de teststof te worden vermeden.

1.6.2.3. Blootstellingsconcentraties

Bij de proeven moeten voldoende (ten minste drie) expositieconcentraties worden gebruikt die zodanig onderling verschillen dat proefgroepen worden verkregen met duidelijke verschillen in toxische effecten en sterftecijfers. De gegevens moeten voldoende zijn om een concentratie/respons-curve te verkrijgen en om indien mogelijk, op aanvaardbare wijze een LC50 te bepalen

1.6.2.4. Limiettest

Als binnen een periode van 14 dagen geen sterfte wordt veroorzaakt door de expositie gedurende 4 uur van vijf mannelijke en vijf vrouwelijke proefdieren aan 20 mg/l in de vorm van een gas en aan 5 mg/l in de vorm van een vloeistofaerosol of van een stofaerosol, is het wellicht niet noodzakelijk verdere proeven te nemen.

1.6.2.5. Blootstellingstijd

De blootstellingstijd bedraagt 4 uur.

1.6.2.6. Apparatuur

De dieren worden aan de teststoffen blootgesteld met behulp van inhalatieapparatuur die zodanig gebouwd is dat kan worden gezorgd voor een dynamische luchtdoorstroming van ten minste 12 luchtverversingen per uur, een toereikend zuurstofgehalte en een gelijkmatige verdeling van de teststoffen in de atmosfeer. Als van een expositiekamer gebruik wordt gemaakt, moet deze op een zodanige wijze zijn ontworpen dat de dieren zo min mogelijk bij elkaar kunnen kruipen en zoveel mogelijk door inhalatie aan de teststof worden blootgesteld. Als algemene regel voor het verzekeren van een stabiele atmosfeer in de expositiekamer geldt, dat het totale „volume” van de proefdieren niet méér mag bedragen dan 5 % van het volume van de blootstellingskamer. Naar keuze kunnen de dieren oronasaal, alleen met hun kop of individueel met hun hele lijf aan de testlucht worden blootgesteld; de eerste twee methoden zullen ertoe bijdragen dat zo min mogelijk teststof via ander wegen in het lichaam wordt opgenomen.

1.6.2.7. Observatieperiode

De observatieperiode moet ten minste 14 dagen bedragen. Deze duur van de observatie moet echter niet als een streng vastgelegde periode worden beschouwd, maar moet door de toxische reacties, het tijdstip waarop deze voor het eerst worden waargenomen en de duur van het herstel worden bepaald; de observatieperiode kan dus indien noodzakelijk, worden verlengd. Van belang zijn het tijdstip waarop toxische verschijnselen voor het eerst zijn waargenomen, het tijdstip waarop zij weer verdwijnen en het tijdstip waarop de dood intreedt, in het bijzonder wanneer de kans bestaat op een uitgestelde dood.

1.6.3. Uitvoering

Kort vóór de blootstelling worden de dieren gewogen en vervolgens 4 uur lang aan de testconcentratie blootgesteld in het daarvoor bestemde apparaat; na evenwichtsinstelling van de concentratie in de blootstellingskamer. De evenwichtsinstelling mag niet veel tijd in beslag nemen. Tijdens de proef dient de temperatuur op 22 oC ± 3 oC te worden gehouden. In het ideale geval moet de relatieve vochtigheid tussen 30 % en 70 % worden gehouden, behalve waar dit niet goed uitvoerbaar is (bijvoorbeeld bij het testen van sommige aerosolen). Het onderhouden van een lichte onderdruk (≤ 5 mm water) voorkomt het weglekken van de teststof naar de omgeving. Gedurende de blootstelling worden de dieren voedsel en water onthouden. Om de testatmosfeer te genereren en concentratiemetingen uit te voeren dienen geschikte systemen gebruikt te worden. Het systeem moet de waarborg bieden dat de expositieomstandigheden bij de proef zo spoedig mogelijk stabiel zijn. De kamer moet zo ontworpen en bediend kunnen worden dat een homogene verdeling van de testatmosfeer binnen de kamer wordt gehandhaafd.

De volgende parameters moeten worden gemeten of gemonitord:

a)de luchtdoorstromingssnelheid (continu) (luchtdebiet);

b)de feitelijke concentratie van de teststof in het ademhalingsgebied van de dieren, ten minste driemaal gemeten tijdens de blootstelling (sommige atmosferen, bijvoorbeeld aerosolen met hoge concentratie moeten eventueel vaker worden gecontroleerd). Tijdens de blootstelling mag de concentratie niet meer dan ± 15 % van het gemiddelde afwijken. Bij sommige aerosolen is het mogelijk dat de concentratie niet binnen deze grenzen gehouden kan worden; in dat geval kan een grotere afwijking worden aanvaard. Voor aerosolen moet zo dikwijls als noodzakelijk is (ten minste éénmaal per testgroep) een analyse worden uitgevoerd om de verdeling van de deeltjesgrootte te bepalen;

c)de temperatuur en de vochtigheid, indien mogelijk continu.

Tijdens en na de blootstelling worden waarnemingen gedaan die voor ieder individueel dier worden geregistreerd. Tijdens de eerste dag moeten frequent waarnemingen worden verricht. Ten minste één keer per werkdag moet een zorgvuldig klinisch onderzoek worden verricht, overige waarnemingen moeten iedere dag worden gedaan waarbij erop moet worden toegezien dat er zo weinig mogelijk dieren voor het onderzoek verloren gaan, bijvoorbeeld door necropsie of koeling van dood aangetroffen dieren en afzondering of opoffering van zwakke of stervende dieren.

Bij het observeren moet in ieder geval aandacht worden besteed aan veranderingen van huid, vacht, ogen, slijmvliezen, ademhalingsorganen, bloedsomloop, autonoom en centraal zenuwstelsel, somatomotorische activiteit en gedrag. Er moet bijzondere aandacht worden besteed aan de waarneming van het ademhalingsgedrag, tremoren, convulsies, speekselvloed, diarree, lethargie, slaap en coma. Het tijdstip waarop de dood intreedt, moet zo nauwkeurig mogelijk worden geregistreerd. Het gewicht van ieder dier wordt na de expositie éénmaal per week en bij de dood van de dieren bepaald.

Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het eind van de proefnemingen leven, wordt necropsie verricht, waarbij vooral aandacht wordt besteed aan veranderingen in het bovenste en onderste gedeelte van de ademhalingswegen. Alle macroscopisch waarneembare pathologische veranderingen worden geregistreerd. Als hiertoe aanleiding bestaat, worden weefselmonsters genomen voor histopathologisch onderzoek.

2. GEGEVENS

De volgende gegevens moeten voor iedere proefgroep in tabellen worden samengevat: aantal dieren bij het begin van het onderzoek, tijdstip waarop de dood intreedt bij de individuele dieren, het aantal dieren dat andere toxiciteitsverschijnselen vertoont, een beschrijving van de toxische effecten en de bevindingen bij de necropsie. Veranderingen in het gewicht moeten worden berekend en geregistreerd indien de dieren langer dan een dag in leven blijven. Dieren die op humane wijze gedood worden omwille van angst en pijn in verband met de stofblootstelling worden geregistreerd als gestorven in verband met de stofblootstelling. Met behulp van een erkende methode wordt de LC50 bepaald. Bij de evaluatie van de gegevens moet ook aandacht worden besteed aan het eventuele verband dat bestaat tussen de blootstelling van de dieren aan de teststof en het aantal en de ernst van alle voorkomende afwijkingen, waaronder gedrags- en klinische afwijkingen, macroscopisch waarneembare beschadigingen, veranderingen in het lichaamsgewicht, sterfte en eventuele andere toxische effecten.

3. RAPPORTAGE

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen

—diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, voeding, enzovoort,

—proefomstandigheden: beschrijving van de expositieapparatuur met inbegrip van ontwerp, type, afmetingen, luchtbron, systeem voor het genereren van aerosolen, methode van luchtconditionering en de wijze waarop de dieren tijdens de proeven in een blootstellingskamer zijn ondergebracht (als deze gebruikt is). Er moet een beschrijving worden gegeven van de apparatuur voor het meten van de temperatuur, de vochtigheid, de concentraties en de verdeling van de deeltjesgrootte van het aerosol.

Gegevens betreffende de expositie:

Deze moeten tabellarisch worden gerangschikt en worden voorzien van gemiddelde waarden en een maat voor de variabiliteit (bijvoorbeeld standaardafwijking). Zij dienen, indien mogelijk, te omvatten:

a)de luchtdoorstromingssnelheid (luchtdebiet) door de inhalatieapparatuur;

b)temperatuur en vochtigheid van de lucht;

c)nominale concentraties (de totale hoeveelheid teststof die de inhalatieapparatuur wordt binnengeleid gedeeld door het luchtvolume);

d)aard van het eventuele medium;

e)feitelijke concentraties van de teststof in het ademhalingsgebied van de dieren;

f)massa-mediaan van de aerodynamische diameter (MMAD) en de geometrische standaardafwijking (GSD);

g)duur van de evenwichtsinstelling;

h)duur van de expositie;

—tabellarische gegevens betreffende de effecten per geslacht en concentratieniveau (dat wil zeggen het aantal dieren dat tijdens de proef stierf of gedood werd, het aantal dieren dat toxische verschijnselen vertoonde, het aantal blootgestelde dieren);

—het tijdstip gedurende of na de blootstelling waarop de dood intreedt, redenen en criteria voor het op humane wijze doden van dieren;

—alle waarnemingen;

—de LC50 voor beide geslachten bepaald aan het eind van de observatieperiode (waarbij de berekeningsmethode dient te worden omschreven);

—95 %-betrouwbaarheidsinterval voor de LC50 (waar dit gegeven kan worden);

—dosis/sterfte-curve met helling (indien dit bij de gebruikte bepalingsmethode mogelijk is);

—bevindingen bij de necropsie;

—eventuele histopathologische bevindingen;

—bespreking van de resultaten (speciale aandacht dient te worden besteed aan het effect van het op humane wijze doden van dieren tijdens de proeven op de berekende LC50);

—interpretatie van de resultaten.

3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE

Zie algemene inleiding deel B (punt D).

4. LITERATUUR

Zie algemene inleiding deel B (punt E).

B.3. ACUTE DERMALE TOXICITEIT

1. METHODE

1.1. INLEIDING

Zie algemene inleiding deel B (punt A).

1.2. DEFINITIES

Zie algemene inleiding deel B (punt B).

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Geen.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

De teststof wordt in geleidelijk stijgende doseringen op de huid van verscheidene groepen proefdieren aangebracht. Er wordt één dosis per groep gebruikt. Vervolgens worden de symptomen en sterfte waargenomen. Bij dieren die tijdens het onderzoek stenen en bij dieren die aan het eind van de proefnemingen leven, wordt necropsie verricht.

Dieren die hevige en aanhoudende tekenen van nood en pijn vertonen, moeten eventueel op humane wijze worden gedood. Het doseren van teststoffen op een manier waarvan bekend is dat deze als gevolg van bijtende of irriterende eigenschappen pijn en nood veroorzaakt, behoeft niet te worden uitgevoerd.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

Geen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.1. Voorbereidingen

Vóór het onderzoek worden de dieren in hun proefkooien ten minste 5 dagen onder dezelfde huisvestings- en voedingsomstandigheden gehouden als tijdens de proef. Gezonde, jong volwassen dieren worden op een willekeurige manier vóór de behandeling in groepen ingedeeld. Ongeveer 24 uur vóór de proef wordt het haar op het ruggedeelte van de romp van de proefdieren door knippen of scheren verwijderd, bij het knippen of scheren moet erop worden gelet dat de huid niet wordt bekrast, omdat daardoor de doorlaatbaarheid van de huid zou kunnen veranderen. Ten minste 10 % van de lichaamsoppervlakte moet voor het aanbrengen van de teststof worden onthaard. Bij een proef met vaste stoffen, die eventueel tot een poeder kunnen worden fijngemaakt, moet de teststof voldoende met water of, zo nodig, met een passend medium worden bevochtigd, zodat de stof goed in contact met de huid komt. Als van een medium gebruik wordt gemaakt, moet rekening worden gehouden met de invloed hiervan op de mate waarin de huid de teststof doorlaat. Vloeibare teststoffen worden in het algemeen onverdund gebruikt.

1.6.2. Proefomstandigheden

1.6.2.1. Proefdieren

Er kan gebruik worden gemaakt van volwassen ratten of konijnen. Ook andere diersoorten kunnen worden gebruikt, maar de noodzakelijkheid hiervan moet worden gerechtvaardigd. De proef dient te worden uitgevoerd met een stam die gewoonlijk in laboratoria wordt gebruikt. Per geslacht mag bij het begin van de studie het gewicht van de dieren die worden gebruikt, niet meer dan 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken.

1.6.2.2. Aantal en geslacht

Voor ieder dosisniveau moeten ten minste 5 knaagdieren worden gebruikt. Zij dienen van hetzelfde geslacht te zijn. Indien wijfjes worden gebruikt, moeten deze nullipaar zijn en niet zwanger. Indien informatie beschikbaar is die aantoont dat eén van beide geslachten duidelijk gevoeliger is, dienen dieren van dit geslacht gebruikt te worden.

Opmerking: In onderzoeken naar acute toxiciteit met dieren van een hogere orde dan knaagdieren, dienen kleinere aantallen in overweging te worden genomen. De doses dienen zorgvuldig te worden uitgekozen, en alle moeite dient te worden gedaan om matig toxische doses niet te boven te gaan. In dergelijke testen dient toediening van letale doses van de teststof te worden vermeden.

1.6.2.3. Dosisniveaus

Bij de proeven moeten voldoende (ten minste drie) dosisniveaus worden toegepast die zodanig onderling verschillen dat proefgroepen worden verkregen met duidelijke verschillen in toxische effecten en sterftecijfers. Bij de vaststelling van de dosisniveaus moet rekening worden gehouden met alle mogelijke irriterende of corrosieve effecten. De gegevens moeten voldoende zijn om een dosis/respons-curve te maken en om, indien mogelijk, op aanvaardbare wijze een LD50 te bepalen.

1.6.2.4. Limiettest

Een limiettest met een dosis van ten minste 2 000 mg/kg lichaamsgewicht wordt uitgevoerd op een groep van 5 mannetjes en 5 wijfjes, met behulp van de hierboven beschreven testmethode. Indien sterfte wordt vastgesteld die met de teststof verband houdt, moet het uitvoeren van een volledig testprogramma overwogen worden.

1.6.2.5. Observatieperiode

De observatieperiode moet ten minste 14 dagen bedragen. Deze duur van de observatie moet echter niet als een streng vastgelegde periode beschouwd worden, maar moet door de toxische reacties, het tijdstip waarop deze voor het eerst worden waargenomen en de duur van het herstel worden bepaald, de observatieperiode kan dus, indien noodzakelijk, worden verlengd. Van belang zijn het tijdstip waarop intoxicatieverschijnselen voor het eerst zijn waargenomen en het tijdstip waarop zij weer verdwijnen, hun duur en het tijdstip waarop de dood intreedt, in het bijzonder wanneer de kans bestaat voor een vertraagde sterfte.

1.6.3. Uitvoering

Ieder dier moet individueel in een kooi worden gehuisvest. De teststof wordt gelijkmatig verdeeld over een oppervlak van ongeveer 10 % van de totale lichaamsoppervlakte. Bij zeer toxische stoffen mag het te behandelen oppervlak kleiner zijn, maar een zo groot mogelijke oppervlakte moet worden bedekt met een zo dun en zo gelijkmatig mogelijk aangebrachte laag.

De teststof moet gedurende de expositietijd van 24 uur door middel van poreus verbandgaas en niet-irriterend plakband in contact met de huid blijven. Het behandelde gedeelte van de huid moet op een geschikte wijze verder worden bedekt om het verbandgaas en de teststof op hun plaats te houden en om te verhinderen dat de dieren de teststof langs orale weg opnemen. Hulpmiddelen om de dieren te fixeren, kunnen worden gebruikt om te voorkomen dat de dieren de teststof via de mond opnemen, maar het wordt niet aangeraden de dieren volledig te immobiliseren.

Aan het eind van de expositieperiode wordt de resterende teststof — zo mogelijk met water — van de huid verwijderd of anders door middel van een andere geschikte reinigingstechniek.

De gedane waarnemingen moeten systematisch worden geregistreerd voor ieder individueel dier. Tijdens de eerste dag worden de dieren regelmatig geobserveerd. Ten minste één keer per werkdag moet een zorgvuldig klinisch onderzoek worden verricht. De andere waarnemingen moeten iedere dag worden verricht, waarbij erop moet worden toegezien dat er zo weinig mogelijk dieren voor het onderzoek verloren gaan, bijvoorbeeld door necropsie of koeling van dood aangetroffen dieren en door afzondering of opoffering van zwakke of stervende dieren.

Bij het observeren wordt aandacht besteed aan veranderingen van vacht, behandelde huid, ogen, slijmvliezen, ademhaling, bloedsomloop, autonoom en centraal zenuwstelsel, somatomotorische activiteit en gedrag. Er moet bijzondere aandacht worden besteed aan de waarneming van tremoren, speekselvloed, diarree, lethargie, slaap en coma. Het tijdstip waarop de dood intreedt moet zo nauwkeurig mogelijk worden geregistreerd. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het einde van de proefnemingen leven, wordt necropsie verricht. Alle macroscopisch waarneembare pathologische veranderingen worden geregistreerd. Als hiertoe aanleiding bestaat, worden weefselmonsters genomen voor histopathologisch onderzoek.

Na het voltooien van de studie voor het ene geslacht, moet ten minste een groep van 5 dieren van het andere geslacht worden blootgesteld aan de stof om te verzekeren dat dit geslacht niet duidelijk gevoeliger is voor de teststof. In bepaalde gevallen kunnen redenen bestaan voor het gebruik van minder dieren. Indien voldoende informatie beschikbaar is om aan te tonen dat dieren van het geteste geslacht duidelijk gevoeliger zijn, mag het testen van het andere geslacht achterwege worden gelaten.

2. GEGEVENS

De volgende gegevens moeten voor iedere proefgroep in tabellen worden samengevat: het aantal dieren bij het begin van het onderzoek, het tijdstip waarop de dood intreedt bij de individuele dieren, het aantal dieren dat andere intoxicatieverschijnselen vertoont, een beschrijving van de toxische effecten en de bevindingen bij de necropsie. Het gewicht van ieder individueel dier wordt bepaald kort voordat de teststof wordt aangebracht, en vervolgens één keer iedere week en ten slotte bij zijn dood; veranderingen in het gewicht worden berekend en geregistreerd, indien de dieren langer dan één dag in leven blijven. Dieren die op humane wijze gedood worden omwille van nood of ongemak en pijn in verband met de stof, worden geregistreerd als gestorven in verband met de stof. De LD50 moet door middel van een erkende methode worden bepaald.

Bij de evaluatie van de gegevens moet ook aandacht worden besteed aan het eventuele verband dat bestaat tussen de blootstelling van de dieren aan de teststof en het aantal en de ernst van alle voorkomende afwijkingen, waaronder gedrags- en klinische afwijkingen, macroscopisch waarneembare beschadigingen, veranderingen in het lichaamsgewicht, sterfte en eventuele andere toxicologische effecten.

3. RAPPORTAGE

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, voeding, enzovoort;

—proefomstandigheden (met vermelding van de wijze waarop de huid is schoongemaakt en het soort verband: occlusief of niet occlusief);

—dosisniveaus (met het eventuele medium en de concentraties);

—het geslacht van de blootgestelde dieren;

—tabellarische gegevens betreffende de effecten per geslacht en dosisniveau (dat wil zeggen het aantal dieren dat tijdens de proef stierf of gedood werd, het aantal dieren dat intoxicatieverschijnselen vertoont, het aantal blootgestelde dieren);

—het tijdstip na de blootstelling waarop de dood intreedt, redenen en criteria voor het op humane wijze doden van dieren;

—alle waarnemingen;

—de LD50 van het geslacht dat het volledige onderzoek onderging, bepaald na 14 dagen (waarbij de berekeningsmethode dient te worden omschreven);

—95 %-betrouwbaarheidsinterval voor de LD50 (waar dit gegeven kan worden);

—dosis/sterfte-curve met helling (indien dit bij de gebruikte bepalingsmethode mogelijk is);

—bevindingen bij de necropsie;

—eventuele histopathologische bevindingen;

—resultaten van de test die eventueel op het andere geslacht werd uitgevoerd;

—bespreking van de resultaten (speciale aandacht dient besteed te worden aan het effect dat het op humane wijze doden van dieren tijdens de proeven zou kunnen hebben op de berekende LD50);

—interpretatie van de resultaten.

3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE

Zie algemene inleiding deel B (punt D).

4. LITERATUUR

Zie algemene inleiding deel B (punt E).

B.4. ACUTE TOXICITEIT: HUIDIRRITTATIE/CORROSIE

1. METHODE

Deze methode is gelijkwaardig aan TG 404 (2002) van de OESO.

1.1. INLEIDING

Bij de samenstelling van deze bijgewerkte methode is bijzondere aandacht besteed aan mogelijke verbeteringen met het oog op het welzijn van de dieren en aan de evaluatie van alle bestaande informatie over de teststof om onnodige tests bij proefdieren te vermijden. In deze methode wordt de aanbeveling opgenomen de bestaande relevante gegevens op bewijskracht te analyseren, alvorens de beschreven in-vivo test op corrosie/irritatie van de stof wordt uitgevoerd. Wanneer er onvoldoende gegevens beschikbaar zijn, kunnen ze worden aangevuld door een sequentiële teststrategie te volgen (1). De aanbevolen teststrategie omvat de uitvoering van gevalideerde en erkende in-vitro tests en is als bijlage bij deze methode opgenomen. Bovendien wordt aanbevolen bij de voorlopige in-vivo test de drie testgaasjes waar mogelijk niet tegelijkertijd maar achtereenvolgens aan te brengen.

In het belang van zowel wetenschappelijke kwaliteit als het dierenwelzijn moeten er geen in-vivo tests worden uitgevoerd voordat alle beschikbare gegevens over de mogelijke huidcorrosie/irritatie door de stof zijn geëvalueerd op bewijskracht. Hierbij gaat het bijvoorbeeld om de resultaten van eerdere studies bij mensen en/of proefdieren, gegevens over corrosie/irritatie door een of meer qua structuur verwante stoffen of mengsels van dergelijke stoffen, gegevens waaruit blijkt dat de stof sterk zuur of sterk alkalisch is (2)(3), en resultaten van gevalideerde en erkende in-vitro- of ex-vivo tests (4)(5)(5a). Door een dergelijke analyse zijn er minder in-vivo tests nodig op huidcorrosie/irritatie door stoffen waarvoor al voldoende bewijsmateriaal bestaat uit andere onderzoeken met deze twee eindpunten.

Een aanbevolen sequentiële teststrategie, waarin de uitvoering van gevalideerde en erkende in-vitro- of ex-vivo tests op corrosie/irritatie is opgenomen, is als bijlage bij deze methode opgenomen. De strategie is ontwikkeld tijdens een OESO-workshop (6), met algemene stemmen door de deelnemers aanbevolen en als aanbevolen teststrategie opgenomen in het „Globally Harmonised System for the Classification of Chemical Substances” (GHS) (7). Hoewel deze sequentiële teststrategie geen integrerend onderdeel van testmethode B 4 is, wordt aanbevolen deze teststrategie te volgen alvorens in-vivo tests uit te voeren. Voor nieuwe stoffen is het de aanbevolen stapsgewijze testbenadering om wetenschappelijk verantwoorde gegevens over corrosie/irritatie door de stof te verkrijgen. Wanneer er voor bestaande stoften onvoldoende gegevens over de huidcorrosie/irritatie beschikbaar zijn, moet de strategie worden gebruikt om ontbrekende gegevens aan te vullen. Voor het gebruik van een andere teststrategie of -procedure of de beslissing om geen stapsgewijze testbenadering te volgen moet een motivering worden gegeven.

Als bij een bewijskrachtanalyse niet kan worden geconcludeerd of er sprake is van corrosie of irritatie, moet overeenkomstig de sequentiële teststrategie een in-vivo test worden overwogen (zie de bijlage).

1.2. DEFINITIES

Huidirritatie: het ontstaan van een omkeerbare beschadiging van de huid na het aanbrengen van een teststof gedurende maximaal 4 uur.

Huidcorrosie: het ontstaan van een onomkeerbare beschadiging van de huid, namelijk zichtbare necrose door de epidermis heen in de dermis, na het aanbrengen van een teststof gedurende maximaal 4 uur. Corrosie-reacties worden gekenmerkt door zweren, bloedingen, bloedkorsten en, tegen het eind van de observatieperiode van 14 dagen, ontkleuring door bleking van de huid, gebieden met volledige haaruitval en littekens. Voor de beoordeling van twijfelachtige letsels moet histopathologie worden overwogen.

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

De teststof wordt in een dosis op de huid van een proefdier aangebracht; de onbehandelde huid van het proefdier wordt als controle gebruikt. De mate van irritatie/corrosie wordt op bepaalde tijdstippen afgelezen en ingeschaald en wordt nader beschreven om een volledige evaluatie van de effecten mogelijk te maken. De duur van de studie moet voldoende zijn om te kunnen beoordelen of de waargenomen effecten reversibel of irreversibel van aard zijn.

Dieren die gedurende een fase van de test voortdurend tekenen van ernstig ongerief en/of hevige pijn vertonen, moeten op humane wijze worden gedood en de stof dient dienovereenkomstig te worden beoordeeld. Voor criteria voor de beslissing om stervende en hevig lijdende dieren op humane wijze te doden wordt verwezen naar referentie (8).

1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.4.1. Voorbereiding van de in-vivo test

1.4.1.1. Keuze van de diersoort

Als proefdier wordt de voorkeur gegeven aan het albinokonijn en er worden gezonde jonge volwassen konijnen gebruikt. Wanneer er een andere soort wordt gebruikt, moet hiervoor een motivering worden gegeven.

1.4.1.2. Voorbereiding van de dieren

Ongeveer 24 uur voor de test wordt het haar op het ruggedeelte van de romp van de dieren door kort afknippen verwijderd. Er moet op worden gelet dat de huid niet wordt geschaafd. Alleen dieren met een gezonde en gave huid mogen worden gebruikt.

Sommige konijnenstammen hebben plekken met dichte haargroei, die in bepaalde perioden van het jaar meer op de voorgrond treden. De test mag niet op deze plekken met dichte haargroei worden uitgevoerd.

1.4.1.3. Huisvesting en voeding

De dieren worden in aparte kooien gehuisvest. De temperatuur in de proefdierruimte dient 20 oC (± 3 oC) te zijn. Hoewel de relatieve vochtigheid minimaal 30 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Verlichting gebeurt met kunstlicht met een ritme van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater.

1.4.2. Testprocedure

1.4.2.1. Het aanbrengen van de teststof

De teststof wordt aangebracht op een klein huidoppervlak (ongeveer 6 cm2) en de plek wordt bedekt met een gaasje dat met behulp van niet-irriterend plakband op zijn plaats wordt gehouden. Wanneer de stof niet direct kan worden aangebracht (bijvoorbeeld bij vloeistoffen of bepaalde pasta's), wordt de teststof eerst op het gaasje aangebracht en wordt dit daarna op de huid bevestigd. Het gaasje moet gedurende de blootstellingsperiode door middel van een geschikt semi-occlusief verband in licht contact met de huid blijven. Als de teststof op het gaasje wordt aangebracht, moet dit zodanig op de huid worden bevestigd dat er een goed contact en een uniforme verdeling van de stof op de huid is. Er moet tevens voor worden gezorgd dat het gaasje voor het dier onbereikbaar is en dat inslikken of inademen van de teststof onmogelijk is.

Vloeibare stoffen worden in het algemeen onverdund gebruikt. Bij een proef met vaste stoffen (die indien nodig eventueel kunnen worden verpoederd) moet de teststof met een zo klein mogelijke hoeveelheid water (of indien nodig een ander geschikt medium) worden bevochtigd om voor een goed contact met de huid te zorgen. Wanneer een ander medium dan water wordt gebruikt, moet een eventuele invloed van het medium op de irritatie van de huid door de teststof minimaal zijn.

Aan het einde van de blootstellingsperiode, die normaal gesproken 4 uur bedraagt, moeten de resten van de teststof zo mogelijk met water of met een geschikt oplosmiddel worden verwijderd zonder de bestaande respons of de intacte epidermis te wijzigen.

1.4.2.2. Dosisniveau

Een dosis van 0,5 ml vloeistof of 0,5 g vaste stof of pasta wordt op het testgedeelte van de huid aangebracht.

1.4.2.3. Voorlopige test (in-vivo test op huidirritatie/corrosie met één dier)

Het is zeer wenselijk dat de in-vivo test in eerste instantie met één dier wordt uitgevoerd, vooral wanneer wordt vermoed dat de stof corrosie kan veroorzaken. Dit is in overeenstemming met de sequentiële teststrategie (zie bijlage 1).

Wanneer een stof op basis van een bewijskrachtanalyse als corrosief wordt beschouwd, zijn er geen verdere dierproeven nodig. Bij de meeste stoffen waarvan wordt vermoed dat ze corrosief zijn, zijn verdere in-vivo tests normaal gesproken niet nodig. Wanneer aanvullende gegevens nodig worden geacht omdat het bewijsmateriaal onvoldoende is, kunnen echter met de volgende aanpak beperkte dierproeven worden uitgevoerd. Bij het dier worden achtereenvolgens maximaal drie testgaasjes aangebracht. Het eerste gaasje wordt na drie minuten verwijderd. Als er geen ernstige huidreactie wordt waargenomen, wordt een tweede gaasje aangebracht dat na een uur wordt verwijderd. Als de waarnemingen in deze fase erop wijzen dat het niet onmenselijk is de blootstelling tot vier uur te verlengen, wordt een derde gaasje aangebracht, dat na vier uur wordt verwijderd, en wordt de reactie ingeschaald.

Als er na een van de drie achtereenvolgende blootstellingen een corrosiereactie wordt waargenomen, wordt de test onmiddellijk gestaakt. Als er na de verwijdering van het laatste gaasje geen corrosiereactie wordt waargenomen, wordt het dier gedurende 14 dagen geobserveerd tenzij er vóór die tijd al corrosie ontstaat.

Wanneer er niet wordt verwacht dat de teststof corrosie veroorzaakt maar deze wel irriterend kan zijn, wordt er één gaasje gedurende vier uur op één dier aangebracht.

1.4.2.4. Bevestigende test (in-vivo test op huidirritatie/corrosie met meer dieren)

Als er bij de voorlopige test geen corrosiereactie wordt waargenomen, moet de irritatie of negatieve reactie worden bevestigd met nog eens twee dieren die elk gedurende vier uur aan één gaasje worden blootgesteld. Als er bij de voorlopige test irritatie wordt waargenomen, kan de bevestigende test op sequentiële wijze worden uitgevoerd of door nog eens twee dieren tegelijkertijd bloot te stellen. Wanneer in een uitzonderlijk geval de voorlopige test niet wordt uitgevoerd, kunnen twee of drie dieren met één gaasje worden behandeld dat na vier uur wordt verwijderd. Wanneer er twee dieren worden gebruikt die beide dezelfde reactie vertonen, is verder testen niet nodig. Als de reactie verschilt, wordt ook het derde dier getest. Er kunnen extra dieren nodig zijn om duidelijkheid te krijgen omtrent moeilijk te interpreteren reacties.

1.4.2.5. Observatieperiode

De duur van de observatieperiode moet voldoende zijn om volledig te kunnen beoordelen of de waargenomen effecten reversibel zijn. Het experiment moet echter worden beëindigd zodra het dier voortdurend tekenen van hevige pijn of ernstig ongerief vertoont. Om te bepalen of de effecten reversibel zijn, moeten de dieren maximaal 14 dagen na de verwijdering van de gaasjes worden geobserveerd. Als al vóór het verstrijken van de 14 dagen wordt geconstateerd dat de effecten reversibel zijn, wordt het experiment op dat moment beëindigd.

1.4.2.6. Klinische observatie en inschaling van de huidreacties

Alle dieren worden op tekenen van erytheem en oedeem onderzocht en de respons wordt 60 minuten en vervolgens 24, 48 en 72 uur na de verwijdering van het gaasje ingeschaald. Bij de voorlopige test bij één dier wordt de huid ook onmiddellijk na de verwijdering van het gaasje onderzocht. De huidreactie wordt in een van de categorieën in de tabel ingeschaald en geregistreerd. Als er sprake is van een beschadiging van de huid die na 72 uur niet als irritatie of corrosie kan worden geïdentificeerd, kan het nodig zijn de observatie tot dag 14 voort te zetten om te bepalen of de effecten reversibel zijn. Naast de observatie van irritatie worden ook alle lokale toxische effecten, zoals ontvetting van de huid, en alle systemische schadelijke effecten (zoals effecten op klinische toxiciteitsverschijnselen en het lichaamsgewicht) volledig beschreven en geregistreerd. Om duidelijkheid te krijgen omtrent moeilijk te interpreteren reacties moet histopathologisch onderzoek worden overwogen.

De inschaling van huidreacties is per definitie subjectief. Om harmonisatie bij de inschaling van huidreacties te bevorderen en ter ondersteuning van de testlaboratoria en de personen die bij het uitvoeren en het interpreteren van de observatie betrokken zijn, moet het personeel dat de observatie uitvoert afdoende zijn opgeleid in het gebruikte scoresysteem (zie de tabel). Een geïllustreerde leidraad voor de inschaling van huidirritatie en ander letsel kan nuttig zijn (9). De inschaling van de huidreacties moet blind gebeuren.

2. GEGEVENS

2.1. VERMELDING VAN DE RESULTATEN

De resultaten van het onderzoek worden in het eindverslag in tabelvorm vermeld en hierin worden alle onder punt 3.1 vermelde gegevens opgenomen.

2.2. EVALUATIE VAN DE RESULTATEN

De scores voor de huidirritatie worden in samenhang met de aard en ernst van het letsel en de vraag of dit al dan niet reversibel is, beoordeeld. De individuele scores vormen geen absolute norm voor de irriterende eigenschappen van een materiaal, aangezien ook andere effecten van het testmateriaal worden beoordeeld. De individuele scores moeten veeleer als referentiewaarden worden beschouwd, die in combinatie met alle andere observaties tijdens het onderzoek moeten worden geëvalueerd.

Bij de beoordeling van de irritatiereactie moet rekening worden gehouden met de reversibiliteit van het huidletsel. Wanneer reacties als haaruitval (beperkt gebied), hyperkeratose, hyperplasie en schilfering tot het einde van de observatieperiode van 14 dagen blijven bestaan, moet de teststof als irriterend worden beschouwd.

3. RAPPORTACE

3.1. TESTVERSLAG

In het testverslag wordt de volgende informatie opgenomen:

Motivering voor in-vivo test: bewijskrachtanalyse van reeds bestaande testgegevens, zoals de resultaten van een sequentiële teststrategie:

—een beschrijving van de relevante gegevens die van eerdere tests beschikbaar zijn;

—de gegevens die bij elke fase van de teststrategie verkregen zijn;

—een beschrijving van de uitgevoerde in-vitro tests met een gedetailleerde beschrijving van de procedures en de resultaten die met test/referentiestoffen verkregen zijn;

—een bewijskrachtanalyse voor de uitvoering van het in-vivo-onderzoek.

Teststof:

—identificatiegegevens (bv. het CAS-nr., de herkomst, de zuiverheid, bekende verontreinigingen en het chargenummer);

—de fysische aard en de fysisch chemische eigenschappen (bv. de pH, de vluchtigheid, de oplosbaarheid en de stabiliteit),

—bij een mengsel: de samenstelling met voor elk bestanddeel het procentuele gehalte.

Medium:

—identificatiegegevens, de concentratie (indien van toepassing) en het gebruikte volume;

—een motivering voor de keuze van het medium.

Proefdieren:

—de gebruikte soort/stam en een motivering indien andere dieren dan het albinokonijn worden gebruikt;

—het aantal dieren van elk geslacht;

—het gewicht van elk dier aan het begin en het eind van de test;

—de leeftijd aan het begin van het onderzoek;

—de herkomst van de dieren, de huisvesting, de voeding enz.

Testomstandigheden:

—de techniek voor de voorbereiding van de plaats waarop het gaasje wordt aangebracht;

—een gedetailleerde beschrijving van het gebruikte verbandmateriaal en de verbandtechniek;

—gedetailleerde gegevens over het bereiden, het aanbrengen en het verwijderen van de teststof.

Resultaten:

—een tabel met de score van de irritatie/corrosie reactie voor elk dier op elk observatietijdstip;

—beschrijvingen van alle waargenomen letsels;

—een beschrijving in woorden van de aard en de ernst van de waargenomen irritatie of corrosie met eventuele histopathologische bevindingen;

—een beschrijving van andere schadelijke lokale (bijvoorbeeld ontvetting van de huid) en systemische effecten naast de huidirritatie of corrosie.

Bespreking van de resultaten.

4. REFERENTIES

(1)Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995). The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.

(2)Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.

(3)Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998). Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720.

(4)ECETOC (1990) Monograph No. 15, „Skin Irritation”, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels.

(5)Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp.483-524.

(5a)Testmethode B 40: Huidcorrosie.

(6)OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop onHarmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http.//www.oecd1.org/ehs/test/background.htm).

(7)OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(8)OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/monos.htm).

(9)EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.

[op verzoek verkrijgbaar bij het OESO secretariaat].

Tabel I:

INSCHALING VAN DE HUIDREACTIES



Vorming van erytheem en korsten

Geen erytheem

0

Zeer licht erytheem (nauwelijks waarneembaar)

1

Duidelijk gedefinieerd erytheem

2

Matig tot ernstig erytheem

3

Ernstig erytheem (diep rood) tot korstvorming waardoor de inschaling van erytheem onmogelijk is

4

Maximale score 4



Vorming van oedeem

Geen oedeem

0

Zeer licht oedeem (nauwelijks waarneembaar)

1

Licht oedeem (de randen van het gebied zijn goed zichtbaar door duidelijke zwelling)

2

Matig oedeem (ongeveer 1 mm zwelling)

3

Ernstig oedeem (meer dan 1 mm zwelling tot buiten het blootstellingsgebied)

4

Maximale score. 4

Om duidelijkheid te krijgen omtrent moeilijk te interpreteren reacties kan histopathologisch onderzoek worden uitgevoerd.

BIJLAGE

Een sequentiële teststrategie voor huidirritatie en -corrosie

ALGEMENE OVERWEGINGEN

In het belang van verantwoorde wetenschap en het welzijn van dieren is het belangrijk dat het onnodig gebruik van dieren wordt vermeden en dat tests waarvan hevige reacties bij dieren worden verwacht, tot een minimum worden beperkt. Alle informatie over een stof die relevant is voor de mogelijke huidirritatie/corrosie door die stof moet worden geëvalueerd voordat een in-vivotest wordt overwogen. Wellicht bestaat er al voldoende bewijsmateriaal om een teststof qua mogelijke huidirritatie of -corrosie in te delen zonder dat er tests bij proefdieren behoeven te worden uitgevoerd. Daarom zal het gebruik van een bewijskrachtanalyse en een sequentiële teststrategie de noodzaak van in-vivotests tot een minimum beperken, vooral als er van de stof hevige reacties worden verwacht.

Het gebruik van een bewijskrachtanalyse voor de evaluatie van bestaande informatie over huidirritatie en -corrosie door stoffen wordt aanbevolen om te bepalen of ander aanvullend onderzoek dan in-vivohuidonderzoek moet worden uitgevoerd om te helpen bij de bepaling van deze mogelijke effecten. Wanneer nader onderzoek nodig is, wordt aanbevolen de sequentiële teststrategie te gebruiken om de relevante experimentele gegevens te verkrijgen. Voor stoffen die nog niet zijn getest, moet de sequentiële teststrategie worden gebruikt om de gegevens te vergaren die nodig zijn om de mogelijke huidirritatie/corrosie te bepalen. De in deze bijlage beschreven teststrategie is tijdens een OESO-workshop (1) ontwikkeld en later bevestigd en opgenomen in het „Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances”, die de steun heeft gekregen van de 28e gezamenlijke vergadering van het Comité chemische stoffen en de Werkgroep chemische stoffen in november 1998 (2).

Hoewel deze sequentiële teststrategie geen integrerend onderdeel van testmethode B.4 is, vormt zij de aanbevolen aanpak voor de bepaling van de kenmerken qua huidirritatie/corrosie. Deze aanpak houdt zowel een optimale gedragscode als een ethische referentie voor in-vivotests op huidirritatie/corrosie in. De testmethode bevat een leidraad voor de uitvoering van de in-vivotest en geeft een overzicht van de factoren die vóór het begin van een dergelijke test in aanmerking moeten worden genomen. De strategie levert een benadering voor de evaluatie van bestaande gegevens over de eigenschappen van teststoffen inzake huidirritatie/corrosie en een trapsgewijze aanpak voor het vergaren van relevante gegevens over stoffen waarvoor nader onderzoek nodig is of waarvoor nog geen onderzoek is uitgevoerd. Ook wordt aanbevolen onder bepaalde omstandigheden gevalideerde en erkende in-vitro- of ex-vivotests op huidirritatie/corrosie uit te voeren.

BESCHRIJVING VAN DE EVALUATIE EN DE TESTSTRATEGIE

Alvorens te beginnen met tests als onderdeel van de sequentiële teststrategie (zie figuur), moet alle beschikbare informatie worden geëvalueerd om te bepalen of in-vivohuidonderzoek nodig is. Hoewel de evaluatie van individuele parameters (bijvoorbeeld een extreme pH) significante informatie kan opleveren, moet rekening worden gehouden met alle bestaande informatie. Alle relevante gegevens over de effecten van de betrokken stof of analoge verbindingen moeten bij het nemen van een beslissing over de bewijskracht worden geëvalueerd en er moet een motivering voor de beslissing worden gegeven. De nadruk moet in eerste instantie liggen op bestaande gegevens over de effecten van de stof bij mens en dier en vervolgens op de resultaten van in-vitro- of ex-vivotests. Waar mogelijk moet in-vivo-onderzoek aan corrosieve stoffen worden vermeden. Bij de teststrategie spelen de volgende factoren een rol:

Evaluatie van bestaande gegevens over de effecten bij mens en dier (stap 1). In de eerste plaats moet worden gekeken naar bestaande gegevens over de effecten bij de mens, zoals klinisch of bedrijfsgeneeskundig onderzoek en ziektegevallen, en/of gegevens van dierproeven, bijvoorbeeld van onderzoek naar huidtoxiciteit bij eenmalige of herhaalde blootstelling, omdat deze informatie opleveren die rechtstreeks verband houdt met huideffecten. Bij stoffen waarvan bekend is dat ze irritatie of corrosie veroorzaken en stoffen waarvoor duidelijk is aangetoond dat dit niet het geval is, behoeven geen in-vivotests te worden uitgevoerd.

Analyse van structuuractiviteit-relaties (SAR) (stap 2). Er moet worden gekeken naar de resultaten van tests met qua structuur verwante stoffen, indien deze beschikbaar zijn. Wanneer er voldoende gegevens beschikbaar zijn over de effecten van qua structuur verwante stoffen of mengsels van dergelijke stoffen bij mens en/of dier om te kunnen concluderen dat deze huidcorrosie/irritatie kunnen veroorzaken, mag worden aangenomen dat de te evalueren teststof tot dezelfde reacties zal leiden. In dat geval behoeft de stof wellicht niet te worden getest. Negatieve gegevens van onderzoek met qua structuur verwante stoffen of mengsels van dergelijke stoffen vormen in het kader van de sequentiële teststrategie niet een afdoende bewijs dat de stof geen corrosie of irritatie veroorzaakt. Voor de bepaling van de potentie voor zowel huidcorrosie als -irritatie moeten gevalideerde en erkende SAR-methoden worden gebruikt.

Fysisch-chemische eigenschappen en chemische reactiviteit (stap 3). Stoffen met een extreme pH van bijvoorbeeld < 2,0 en ≥ 11,5 kunnen hevige lokale effecten hebben. Als een stof op basis van een extreme pH als corrosief voor de huid wordt aangeduid, kan ook rekening worden gehouden met zijn zuur/alkalireserve (of buffercapaciteit) (3)(4). Als de buffercapaciteit erop wijst dat een stof wellicht niet corrosief voor de huid is, moeten er nadere tests worden uitgevoerd om dit te bevestigen, waarbij bij voorkeur een gevalideerde en erkende in-vitro- of ex-vivotest moet worden gebruikt (zie de stappen 5 en 6).

Huidtoxiciteit (slap 4). Als van een stof is aangetoond dat deze via de huid zeer toxisch is, is een in-vivo-onderzoek naar huidirritatie/corrosie wellicht niet uitvoerbaar, omdat de normaal gesproken gebruikte hoeveelheid teststof al groter kan zijn dan de zeer toxische dosis en derhalve tot gevolg kan hebben dat de dieren sterven of hevig lijden. Wanneer er al onderzoek naar de huidtoxiciteit bij albinokonijnen tot de limietdosis van 2 000 mg/kg lichaamsgewicht of meer is uitgevoerd en er geen huidirritatie of -corrosie is waargenomen, zijn verdere tests op huidirritatie/corrosie bovendien wellicht niet nodig. Bij de evaluatie van acute huidtoxiciteit bij eerder uitgevoerd onderzoek moet er op een aantal aspecten worden gelet. Zo kan de gerapporteerde informatie over huidletsel onvolledig zijn. De tests en observaties kunnen bij een andere soort dan het konijn zijn uitgevoerd en de gevoeligheid kan van soort tot soort sterk verschillen. Het is ook mogelijk dat de stof op de dieren is aangebracht in een vorm die niet geschikt is voor de beoordeling van huidirritatie/corrosie, bijvoorbeeld omdat de stof voor de test op huidtoxiciteit is verdund (5). Wanneer er echter goed opgezette en uitgevoerde onderzoeken op huidtoxiciteit bij konijnen zijn verricht, kunnen negatieve resultaten als voldoende bewijs worden beschouwd dat de stof geen corrosie of irritatie veroorzaakt.

Resultaten van in-vitro of ex-vivotests (stappen 5 en 6). Stoffen waarvan met een gevalideerde en erkende in-vitro of ex-vivotest (6)(7), die voor de beoordeling van deze specifieke effecten is opgezet, is aangetoond dat ze corrosieve of ernstig irriterende eigenschappen hebben, behoeven niet bij dieren te worden getest. Er kan worden aangenomen dat dergelijke stoffen in vivo vergelijkbare hevige effecten veroorzaken.

In-vivotest bij konijnen (stappen 7 en 8). Wanneer op grond van de bewijskracht wordt besloten over te gaan tot in-vivotests, dient eerst een voorlopige test met één dier te worden gedaan. Als de resultaten van deze test erop wijzen dat de stof corrosief voor de huid is, dienen er geen verdere tests te worden uitgevoerd. Als er bij de voorlopige test geen corrosief effect wordt waargenomen, moet de irritatiereactie of de negatieve respons worden bevestigd met ten hoogste nog eens twee dieren gedurende een blootstellingsperiode van vier uur. Als er bij de voorlopige test een irritatiereactie wordt waargenomen, kan de bevestigingstest sequentieel of door gelijktijdige blootstelling van de twee dieren worden uitgevoerd.

REFERENTIES

(1)OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/tests/background.htm).

(2)OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(3)Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709-720.

(4)Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) pp 19-26.

(5)Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996). Animal, Human, and In Vitro Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6, Chapter 31, 411-436.

(6)Testmethode B.40.

(7)Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp.483-524.

Figuur

TEST- EN EVALUATIESTRATEGIE VOOR HUIDIRRITATIE/CORROSIE

image

B.5. ACUTE TOXICITEIT: OOGIRRITATIE/CORROSIE

1. METHODE

Deze methode is gelijkwaardig aan TG 405 (2002) van de OESO.

1.1. INLEIDING

Bij de samenstelling van deze bijgewerkte methode is bijzondere aandacht besteed aan mogelijke verbeteringen via de evaluatie van alle bestaande informatie over de teststof om onnodige tests bij proefdieren te vermijden en zodoende rekening te houden met de bezorgdheid omtrent het welzijn van dieren. In deze methode wordt de aanbeveling opgenomen de bestaande relevante gegevens op bewijskracht te analyseren (1), alvorens de beschreven in-vivotest op acute oogirritatie/corrosie wordt uitgevoerd. Wanneer er onvoldoende gegevens beschikbaar zijn, wordt aanbevolen deze aan te vullen door een sequentiële teststrategie te volgen (2)(3). De aanbevolen teststrategie omvat de uitvoering van gevalideerde en erkende in-vitrotests en is als bijlage bij de testmethode opgenomen. Bovendien wordt aanbevolen als prognose voor oogcorrosie een in-vivotest op huidirritatie/corrosie uit te voeren alvorens een in-vivo-oogtest te overwegen.

In het belang van zowel wetenschappelijke kwaliteit als het dierenwelzijn moeten er geen in-vivotests worden overwogen voordat alle beschikbare gegevens over de mogelijke oogcorrosie/irritatie door de stof zijn geëvalueerd op bewijskracht. Hierbij gaat het bijvoorbeeld om de resultaten van eerdere studies bij mensen en/of proefdieren, gegevens over corrosie/irritatie door een of meer qua structuur verwante stoffen of mengsels van dergelijke stoffen, gegevens waaruit blijkt dat de stof sterk zuur of sterk alkalisch is (4)(5), en resultaten van gevalideerde en erkende in-vitro- of ex-vivotests op huidcorrosie en -irritatie (6)(6a). De studies kunnen al vóór de bewijskrachtanalyse zijn uitgevoerd, maar dit kan ook naar aanleiding van deze analyse gebeuren.

Voor bepaalde stoffen kan uit een dergelijke analyse blijken dat er een in-vivo-onderzoek naar een mogelijke oogcorrosie/irritatie door de stof nodig is. In al deze gevallen verdient het de voorkeur, alvorens het gebruik van de in-vivo-oogtest te overwegen, eerst overeenkomstig testmethode B.4 (7) een onderzoek naar de in-vivohuideffecten van de stof uit te voeren en te beoordelen. Door toepassing van een bewijskrachtanalyse en de sequentiële teststrategie zal het minder vaak nodig zijn de in-vivotest op oogcorrosie/irritatie uit te voeren met stoffen waarvoor al voldoende bewijsmateriaal uit andere studies bestaat. Als met de sequentiële teststrategie niet kan worden bepaald of er sprake is van een mogelijke oogcorrosie of -irritatie, zelfs na de uitvoering van een in-vivo-onderzoek naar huidcorrosie en -irritatie, kan een in-vivotest op oogcorrosie/irritatie worden uitgevoerd.

Een aanbevolen sequentiële teststrategie, waarin de uitvoering van gevalideerde in-vitro- of ex-vivotests op corrosie/irritatie is opgenomen, is in de bijlage van deze testmethode opgenomen. De strategie is ontwikkeld tijdens een OESO-workshop (8), met algemene stemmen door de deelnemers aanbevolen en als aanbevolen teststrategie opgenomen in het „Globally Harmonised System for the Classification of Chemical Substances” (GHS) (9). Hoewel deze sequentiële teststrategie geen integrerend onderdeel van testmethode B.5 is, wordt aanbevolen deze teststrategie te volgen alvorens in-vivotests uit te voeren. Voor nieuwe stoffen is het de aanbevolen stapsgewijze testbenadering om wetenschappelijk verantwoorde gegevens over corrosie/irritatie door de stof te verkrijgen. Wanneer er voor bestaande stoffen onvoldoende gegevens over de huid- en oogcorrosie/irritatie beschikbaar zijn, moet de strategie worden gebruikt om ontbrekende gegevens aan te vullen. Voor het gebruik van een andere teststrategie of -procedure of de beslissing om geen stapsgewijze testbenadering te volgen moet een motivering worden gegeven.

1.2. DEFINITIES

Oogirritatie: het ontstaan van veranderingen in het oog na het aanbrengen van een teststof op het oppervlak aan de voorzijde van het oog, die binnen 21 dagen na het aanbrengen volledig reversibel zijn.

Oogcorrosie: het ontstaan van weefselbeschadiging in het oog of een ernstige fysieke zichtvermindering na het aanbrengen van een teststof op het oppervlak aan de voorzijde van het oog, die binnen 21 dagen na het aanbrengen niet volledig reversibel is.

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

De teststof wordt in één dosis op een van de ogen van het proefdier aangebracht; het onbehandelde oog wordt als controle gebruikt. De mate van oogirritatie/corrosie wordt geëvalueerd door op bepaalde tijdstippen het letsel aan de conjunctiva, de cornea en de iris in te schalen. Ook andere effecten in het oog en schadelijke systemische effecten worden beschreven om een volledige evaluatie van de effecten mogelijk te maken. De duur van de studie moet voldoende zijn om te kunnen beoordelen of de effecten reversibel of irreversibel van aard zijn.

Dieren die gedurende een fase van de test voortdurend tekenen van ernstig ongerief en/of hevige pijn vertonen, moeten op humane wijze worden gedood en de stof dient dienovereenkomstig te worden beoordeeld. Voor criteria voor de beslissing om stervende en hevig lijdende dieren op humane wijze te doden wordt verwezen naar referentie (10).

1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.4.1. Voorbereiding van de in-vivotest

1.4.1.1. Keuze van de soort

Als proefdier wordt de voorkeur gegeven aan het albinokonijn en er worden gezonde jonge volwassen dieren gebruikt. Wanneer er een andere stam of soort wordt gebruikt, moet hiervoor een motivering worden gegeven.

1.4.1.2. Voorbereiding van de dieren

Beide ogen van ieder voorlopig voor de test geselecteerd proefdier worden binnen 24 uur vóór het begin van de test onderzocht. Dieren die aan oogirritatie, oogaandoeningen of een reeds bestaand cornealetsel lijden, mogen niet worden gebruikt.

1.4.1.3. Huisvesting en voeding

De dieren worden in aparte kooien gehuisvest. De temperatuur in de proefdierruimte dient voor konijnen 20 oC (+ 3 oC) te zijn. Hoewel de relatieve vochtigheid minimaal 30 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Verlichting gebeurt met kunstlicht met een ritme van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater.

1.4.2. Testprocedure

1.4.2.1. Het aanbrengen van de teststof

De teststof wordt bij elk dier aangebracht in de conjunctivaalzak van één oog, waarbij het onderste ooglid voorzichtig van de oogbol wordt weggetrokken. Vervolgens worden de oogleden ongeveer één seconde zachtjes dichtgehouden om verlies van het materiaal te voorkomen. Het andere oog, dat niet behandeld wordt, fungeert als controle.

1.4.2.2. Irrigatie

De ogen van de proefdieren mogen gedurende ten minste 24 uur na het indruppelen van de teststof niet worden uitgewassen, tenzij het om een vaste stof gaat (zie punt 1.4.2.3.2) of wanneer er sprake is van onmiddellijke corrosieve of irriterende effecten. Na 24 uur mogen de ogen eventueel worden uitgewassen.

Het gebruik van een satellietgroep om de invloed van het uitwassen te onderzoeken wordt niet aanbevolen, tenzij dit wetenschappelijk verantwoord is. Als er een satellietgroep nodig is, dienen hiervoor twee konijnen te worden gebruikt. De wijze van uitwassen, waarbij het bijvoorbeeld gaat om het tijdstip, de samenstelling en temperatuur van de wasvloeistof, de duur, het volume en de stroomsnelheid, moet zorgvuldig worden vastgelegd.

1.4.2.3. Dosisniveau

1.4.2.3.1. Vloeibare teststoffen

Bij vloeibare reststoffen wordt een dosis van 0,1 ml gebruikt. Er mogen geen sproeipompjes worden gebruikt om de stof rechtstreeks in het oog te brengen. De vloeistof wordt na het sproeien opgevangen en vervolgens wordt 0,1 ml in het oog gedruppeld.

1.4.2.3.2. Vaste teststoffen

Bij het testen van vaste stoffen, pasta's en vaste deeltjes wordt een hoeveelheid met een volume van 0,1 ml of een gewicht van ten hoogste 100 mg gebruikt. Het testmateriaal wordt tot een fijn poeder vermalen. Alvorens het volume te meten wordt het vaste materiaal licht ingeklonken, bijvoorbeeld door tegen de houder te tikken. Als de vaste stof op het eerste observatietijdstip (1 uur na de behandeling) nog niet door fysiologische mechanismen uit het oog van het proefdier is verwijderd, kan het oog met fysiologisch zout of gedestilleerd water worden uitgewassen.

1.4.2.3.3. Aerosol-teststoffen

Aanbevolen wordt alle sproeivloeistoffen en aerosolen op te vangen voordat ze in het oog worden gedruppeld. Er wordt alleen een uitzondering gemaakt voor stoffen in spuitbussen onder druk, die niet kunnen worden opgevangen omdat ze verdampen. In deze gevallen wordt het oog opengehouden en wordt de teststof aan het oog toegediend door in één keer gedurende ongeveer één seconde vanaf een afstand van 10 cm recht voor het oog te spuiten. Deze afstand kan afhankelijk van de druk van de nevel en de inhoud worden aangepast. Er moet voor worden gezorgd dat het oog niet door de druk van de nevel wordt beschadigd. In bepaalde gevallen kan het nodig zijn na te gaan of een „mechanische” beschadiging van het oog door de druk van de nevel mogelijk is.

De dosis uit een spuitbus kan door een simulatie als volgt worden geraamd: de stof wordt door een opening die zo groot is als het oog van een konijn en recht voor het papier wordt gehouden, op een weegpapiertje gespoten. De gewichtstoename van het papier wordt gebruikt voor een benadering van de hoeveelheid die in het oog wordt gespoten. Bij vluchtige stoffen kan de dosis worden geraamd door een opvangbakje voor en na de verwijdering van het testmateriaal te wegen.

1.4.2.4. Voorlopige test (in-vivotest op oogirritatie/corrosie met één dier)

Zoals in de sequentiële teststrategie (zie bijlage 1) wordt gesteld, is het zeer wenselijk dat de in-vivotest in eerste instantie met één dier wordt uitgevoerd.

Als de resultaten van deze test erop wijzen dat de stof bij gebruik van de beschreven procedure corrosief of hevig irriterend is, dienen er geen verdere tests op oogirritatie te worden uitgevoerd.

1.4.2.5. Lokale anesthetica

Van geval tot geval kan worden bekeken of er lokale anesthetica moeten worden gebruikt. Als de bewijskrachtanalyse erop wijst dat de stof pijn kan veroorzaken of als uit de eerste tests blijkt dat er een pijnlijke reactie optreedt, kan vóór het indruppelen van de teststof een lokaal anestheticum worden toegediend. De aard, de concentratie en de dosis van het lokaal anestheticum moeten met zorg worden gekozen om ervoor te zorgen dat het gebruik niet leidt tot verschillen in de reactie op de teststof. Het controleoog moet op dezelfde wijze worden verdoofd.

1.4.2.6. Bevestigende test (in-vivotest op oogirritatie/corrosie met meer dieren)

Als er bij de voorlopige test geen corrosiereactie wordt waargenomen, moet de irritatie of negatieve reactie worden bevestigd met nog eens twee dieren. Als er bij de voorlopige test hevige irritatie wordt waargenomen, hetgeen wijst op een mogelijk hevig (irreversibel) effect bij de bevestigende test, wordt aanbevolen de bevestigende test op sequentiële wijze bij één dier tegelijk uit te voeren en de twee andere dieren niet tegelijkertijd bloot te stellen. Als er bij het tweede dier corrosieve of hevig irriterende effecten optreden, wordt de test niet voortgezet. Er kunnen extra dieren nodig zijn om een zwakke of matige irritatiereactie te bevestigen.

1.4.2.7. Observatieperiode

De duur van de observatieperiode moet voldoende zijn om de omvang en de reversibiliteit van de waargenomen effecten volledig te kunnen beoordelen. Het experiment moet echter worden beëindigd zodra het dier voortdurend tekenen van hevige pijn of ernstig ongerief vertoont (9). Om te bepalen of de effecten reversibel zijn, moeten de dieren normaal gesproken gedurende 21 dagen na de toediening van de teststof worden geobserveerd. Als al vóór het verstrijken van de 21 dagen wordt geconstateerd dat de effecten reversibel zijn, wordt het experiment op dat moment beëindigd.

1.4.2.7.1. Klinische observatie en inschaling van de oogreacties

De ogen worden 1, 24, 48 en 72 uur na het aanbrengen van de teststof onderzocht. De dieren worden niet langer dan nodig voor de test ingezet zodra er definitieve informatie is verkregen. Dieren die voortdurend tekenen van hevige pijn of ernstig ongerief vertonen, moeten op humane wijze worden gedood en de stof dient dienovereenkomstig te worden beoordeeld. Dieren die na de indruppeling de volgende oogletsels ontwikkelen, moeten op humane wijze worden gedood: perforatie van de cornea, significante ulceratie van de cornea en stafyloom; bloed in de voorste oogkamer; klasse 4 troebelheid van de cornea die gedurende 48 uur aanhoudt; afwezigheid van een lichtreflex (iris-reactie klasse 2) die gedurende 72 uur aanhoudt; ulceratie van de conjunctivae; necrose van de conjunctivae of het knipvlies: loslatend dood weefsel. De reden hiervoor is dat dergelijke letsels in het algemeen irreversibel zijn.

Wanneer de dieren geen oogletsel ontwikkelen, mag de test niet eerder dan drie dagen na de indruppeling worden beëindigd. Dieren met licht tot matig letsel moeten worden geobserveerd tot het letsel verdwijnt of gedurende 21 dagen; op dat tijdstip wordt de test dan afgesloten. Op dag 7, dag 14 en dag 21 worden de dieren geobserveerd om te bepalen wat de status van het letsel is en of het reversibel of irreversibel is.

Bij elk onderzoek wordt de score van de oogreactie (conjunctivae, cornea en iris) geregistreerd (zie tabel 1). Ook ander letsel in het oog (zoals pannus of verkleuring) en schadelijke systemische effecten worden gerapporteerd.

Het onderzoek van de respons kan worden vergemakkelijkt door het gebruik van een binoculaire loep, een handspleetlamp, een biomicroscoop of andere geschikte apparatuur. Na de registratie van de observaties na 24 uur kunnen de ogen nader worden onderzocht met behulp van fluoresceïne.

De inschaling van oogreacties is per definitie subjectief. Om harmonisatie bij de inschaling van oogreacties te bevorderen en ter ondersteuning van de testlaboratoria en de personen die bij het uitvoeren en het interpreteren van de observatie betrokken zijn, moet het personeel dat de observatie uitvoert afdoende zijn opgeleid in het gebruikte scoresysteem.

2. GEGEVENS

2.1. EVALUATIE VAN DE RESULTATEN

De scores voor de oogirritatie worden in samenhang met de aard en ernst van het letsel en de vraag of dit al dan niet reversibel is, beoordeeld. De individuele scores vormen geen absolute norm voor de irriterende eigenschappen van een materiaal, aangezien ook andere effecten van het restmateriaal worden beoordeeld. De individuele scores moeten veeleer als referentiewaarden worden beschouwd en zijn alleen zinvol wanneer ze worden ondersteund door een volledige beschrijving en evaluatie van alle observaties.

3. RAPPORTAGE

3.1. TESTVERSLAG

In het testverslag wordt de volgende informatie opgenomen:

Motivering voor in-vivotest: bewijskrachtanalyse van reeds bestaande testgegevens, zoals de resultaten van een sequentiële teststrategie:

—een beschrijving van de relevante gegevens die van eerdere tests beschikbaar zijn;

—de gegevens die bij elke stap van de teststrategie verkregen zijn;

—een beschrijving van de uitgevoerde in-vitro tests met een gedetailleerde beschrijving van de procedures en de resultaten die met test/referentiestoffen verkregen zijn;

—een beschrijving van het uitgevoerde in-vivo-onderzoek op huidirritatie/corrosie met de verkregen resultaten;

—een bewijskrachtanalyse voor de uitvoering van het in-vivo-onderzoek.

Teststof:

—identificatiegegevens (bv. het CAS-nr., de herkomst, de zuiverheid, bekende verontreinigingen en het chargenummer):

—de fysische aard en de fysisch-chemische eigenschappen (bv. de pH, de vluchtigheid, de oplosbaarheid, de stabiliteit en de reactiviteit met water);

—bij een mengsel de samenstelling met voor elk bestanddeel het procentuele gehalte;

—als een lokaal anestheticum is gebruikt: identificatiegegevens, de zuiverheid, het type, de dosis en de potentiële interactie met de teststof.

Medium:

—identificatiegegevens, de concentratie (indien van toepassing) en het gebruikte volume;

—een motivering voor de keuze van het medium.

Proefdieren:

—de gebruikte soort/stam en een motivering indien andere dieren dan het albinokonijn worden gebruikt;

—de leeftijd van elk dier aan het begin van het onderzoek;

—het aantal dieren van elk geslacht in de test- en controlegroep (indien deze nodig is);

—het gewicht van elk dier aan het begin en het eind van de test;

—de herkomst, de huisvesting, de voeding enz.

Resultaten:

—een beschrijving van de methode die is gebruikt om de irritatie op elk observatietijdstip in te schalen (bijvoorbeeld handspleetlamp, biomicroscoop of fluoresceïne):

—een tabel met de gegevens van de irritatie/corrosiereactie voor elk dier op elk observatietijdstip tot het moment waarop elk dier uit de test wordt genomen;

—een beschrijving in woorden van de ernst en de aard van de waargenomen irritatie of corrosie;

—een beschrijving van alle andere in het oog waargenomen letsels (bijvoorbeeld vascularisatie, pannusvorming, verkleving en verkleuring);

—een beschrijving van schadelijke lokale effecten buiten het oog en schadelijke systemische effecten en eventuele histopathologische bevindingen.

Bespreking van de resultaten.

3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN

Een extrapolatie van de resultaten van het onderzoek naar oogirritatie bij proefdieren naar de mens heeft slechts een beperkte geldigheid. In veel gevallen is het albinokonijn gevoeliger voor stoffen die oogirritatie of -corrosie veroorzaken dan de mens.

Bij de interpretatie van de resultaten moet ervoor worden gezorgd dat irritatie ten gevolge van secundaire infectie wordt uitgesloten.

4. REFERENTIES

(1)Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995). The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.

(2)de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997). Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164.

(3)Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.

(4)Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.

(5)Neun, D.J. (1993). Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231.

(6)Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp.483-524.

(6a)Testmethode B.40: Huidcorrosie.

(7)Testmethode B.4: Acute toxiciteit: huidirritatie/corrosie.

(8)OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(9)OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(10)OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

Tabel I:

INSCHALING VAN HET OOGLETSEL

Cornea

Troebelheid: dichtheidsgraad (wordt afgelezen in het gebied met de grootste dichtheid) (15)



Geen ulceratie of troebelheid

0

Verspreide of diffuse troebele gebieden (meer dan een lichte vertroebeling van de normale glans); details van de iris duidelijk zichtbaar

1

Gemakkelijk te onderscheiden doorschijnend gebied; details van de iris enigszins vervaagd

2

Parelmoerachtig gebied; details van de iris niet zichtbaar; omvang van de pupil nauwelijks zichtbaar

3

Troebele cornea; iris niet zichtbaar door de troebelheid

4

Maximale score: 4

NOTEN

Iris



Normaal

0

Duidelijk verdiepte rugae, congestie, zwelling, matige hyperemie rond de cornea of injectie; iris reageert op licht (een trage reactie wordt als een effect beschouwd)

1

Bloeding, macroscopische destructie of geen reactie op licht

2

Maximale score: 2

Conjunctivae

Roodheid (geldt voor palpebrale en bulbaire conjunctivae; niet voor cornea en iris)



Normaal

0

Hyperemie in sommige bloedvaten (geïnjecteerd)

1

Diffuse karmozijnrode kleur; individuele vaten niet gemakkelijk zichtbaar

2

Diffuse dieprode kleur

3

Maximale score: 3

Chemosis

Zwelling (geldt voor oogleden en/of knipvliezen)



Normaal

0

Iets meer zwelling dan normaal

1

Duidelijke zwelling met gedeeltelijk uitpuilende oogleden

2

Zwelling met ongeveer half gesloten oogleden

3

Zwelling met meer dan half gesloten oogleden

4

Maximale score: 4

BIJLAGE

Een sequentiële teststrategie voor oogirritatie en -corrosie

ALGEMENE OVERWEGINGEN

In het belang van verantwoorde wetenschap en het welzijn van dieren is het belangrijk dat het onnodig gebruik van dieren wordt vermeden en dat tests waarvan hevige reacties bij dieren worden verwacht, tot een minimum worden beperkt. Alle informatie over een stof die relevant is voor de mogelijke oogirritatie/corrosie door die stof moet worden geëvalueerd voordat een in-vivotest wordt overwogen. Wellicht bestaat er al voldoende bewijsmateriaal om een teststof qua mogelijke oogirritatie of -corrosie in te delen zonder dat er tests bij proefdieren behoeven te worden uitgevoerd. Daarom zal het gebruik van een bewijskrachtanalyse en een sequentiële teststrategie de noodzaak van in-vivotests tot een minimum beperken, vooral als er van de stof hevige reacties worden verwacht.

Er wordt aanbevolen dat een bewijskrachtanalyse wordt gebruikt om bestaande informatie over oogirritatie en -corrosie door stoffen te evalueren en om te bepalen of ander aanvullend onderzoek dan in-vivo-oogonderzoek moet worden uitgevoerd om te helpen bij de bepaling van deze mogelijke effecten. Wanneer nader onderzoek nodig is, wordt aanbevolen de sequentiële teststrategie te gebruiken om de relevante experimentele gegevens te verkrijgen. Voor stoffen die nog niet zijn getest, moet de sequentiële teststrategie worden gebruikt om de gegevens te vergaren die nodig zijn om de oogcorrosie/irritatie te bepalen. De in deze bijlage beschreven teststrategie is tijdens een OESO-workshop (1) ontwikkeld. Later is zij bevestigd en opgenomen in het „Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances”, die de steun heeft gekregen van de 28e gezamenlijke vergadering van het Comité chemische stoffen en de Werkgroep chemische stoffen in november 1998 (2).

Hoewel deze teststrategie geen integrerend onderdeel van testmethode B.5 is, vormt zij de aanbevolen aanpak voor de bepaling van de eigenschappen qua oogirritatie/corrosie. Deze aanpak houdt zowel een optimale gedragscode als een ethische referentie voor in-vivotests op oogirritatie/corrosie in. De testmethode bevat een leidraad voor de uitvoering van de in-vivotest en geeft een overzicht van de factoren die vóór het overwegen van een dergelijke test in aanmerking moeten worden genomen. De sequentiële teststrategie levert een bewijskrachtbenadering voor de evaluatie van bestaande gegevens over de eigenschappen van stoffen inzake oogirritatie/corrosie en een trapsgewijze aanpak voor het vergaren van relevante gegevens over stoffen waarvoor nader onderzoek nodig is of waarvoor nog geen onderzoek is uitgevoerd. De strategie houdt in dat onder bepaalde omstandigheden eerst gevalideerde en erkende in-vitro of ex-vivotests en vervolgens testmethode B.4 op huidirritatie/corrosie worden uitgevoerd (3)(4).

BESCHRIJVING VAN DE STAPSGEWIJZE TESTSTRATEGIE

Alvorens te beginnen met tests als onderdeel van de sequentiële teststrategie (zie figuur), moet alle beschikbare informatie worden geëvalueerd om te bepalen of in-vivo-oogonderzoek nodig is. Hoewel de evaluatie van individuele parameters (bijvoorbeeld een extreme pH) significante informatie kan opleveren, moet alle bestaande informatie worden geëvalueerd. Alle relevante gegevens over de effecten van de betrokken stof en de qua structuur analoge verbindingen moeten bij het nemen van een beslissing over de bewijskracht worden geëvalueerd en er moet een motivering voor de beslissing worden gegeven. De nadruk moet in eerste instantie liggen op bestaande gegevens over de effecten van de stof bij mens en dier en vervolgens op de resultaten van in-vitro- of ex-vivotests. Waar mogelijk moet in-vivo-onderzoek aan corrosieve stoffen worden vermeden. Bij de teststrategie spelen de volgende factoren een rol:

Evaluatie van bestaande gegevens over de effecten bij mens en dier (stap 1). In de eerste plaats moet worden gekeken naar bestaande gegevens over de effecten bij de mens, zoals klinisch en bedrijfsgeneeskundig onderzoek en ziektegevallen, en/of gegevens van oogonderzoek bij proefdieren, omdat deze informatie opleveren die rechtstreeks verband houdt met oogeffecten. Vervolgens moeten de beschikbare gegevens van onderzoek bij mens en/of dier naar huidcorrosie/irritatie worden geëvalueerd. Stoffen waarvan bekend is dat ze corrosief of hevig irriterend voor het oog zijn, mogen niet in de ogen van dieren worden gedruppeld en dit geldt ook voor stoffen met corrosieve of irriterende effecten op de huid; deze stoffen moeten ook als corrosief en/of irriterend voor het oog worden beschouwd. Ook stoffen waarvoor bij eerder uitgevoerd oogonderzoek afdoende is aangetoond dat ze niet corrosief en niet irriterend zijn, dienen niet meer bij in-vivo-oogonderzoek te worden getest.

Analyse van structuuractiviteitrelaties (SAR) (stap 2). Er moet worden gekeken naar de resultaten van tests met qua structuur verwante chemische stoffen, indien deze beschikbaar zijn. Wanneer er voldoende gegevens beschikbaar zijn over de effecten van qua structuur verwante stoffen of mengsels van dergelijke stoffen bij mens en/of dier om te kunnen concluderen dat deze oogcorrosie/irritatie kunnen veroorzaken, mag worden aangenomen dat de teststof tot dezelfde reacties zal leiden. In dat geval behoeft de stof wellicht niet te worden getest. Negatieve gegevens van onderzoek met qua structuur verwante stoffen of mengsels van dergelijke stoffen vormen in het kader van de sequentiële teststrategie niet een afdoende bewijs dat de stof geen corrosie of irritatie veroorzaakt. Voor de bepaling van de potentie voor zowel huidcorrosie en -irritatie als oogcorrosie en -irritatie moeten gevalideerde en erkende SAR-methoden worden gebruikt.

Fysisch-chemische eigenschappen en chemische reactiviteit (stap 3). Stoffen met een extreme pH van bijvoorbeeld ≤ 2,0 of ≥ 11,5 kunnen hevige lokale effecten hebben. Als een stof op basis van een extreme pH als corrosief of irriterend voor het oog wordt aangeduid, kan ook rekening worden gehouden met zijn zuur/alkalireserve (buffercapaciteit) (5)(6). Als de buffercapaciteit erop wijst dat een stof wellicht niet corrosief voor het oog is, moeten er nadere tests worden uitgevoerd om dit te bevestigen, waarbij bij voorkeur een gevalideerde en erkende in-vitro- of ex-vivotest moet worden gebruikt (zie het gedeelte over de stappen 5 en 6).

Overweging van andere bestaande informatie (stap 4). In deze fase moet alle beschikbare informatie over systemische toxiciteit via de huid worden geëvalueerd. Ook de acute huidtoxiciteit van de teststof moet in de overwegingen worden betrokken. Als er is aangetoond dat de teststof via de huid zeer toxisch is, behoeft deze wellicht niet in het oog te worden getest. Hoewel er niet noodzakelijkerwijs een verband is tussen acute huidtoxiciteit en oogirritatie/corrosie, kan worden aangenomen dat een stof die via de huid zeer toxisch is, ook bij indruppelen in het oog hoge toxiciteit zal vertonen. Deze gegevens kunnen ook tussen de stappen 2 en 3 worden bezien.

Resultaten van in-vitro- of ex-vivotests (stappen 5 en 6). Stoffen waarvan met een in-vitro- of ex-vivotest (7)(8), die specifiek voor de beoordeling van oog- of huidcorrosie/irritatie is gevalideerd en erkend, is aangetoond dat ze corrosieve of hevig irriterende eigenschappen hebben, behoeven niet bij dieren te worden getest. Er kan worden aangenomen dat dergelijke stoffen in vivo vergelijkbare hevige effecten veroorzaken. Als er geen gevalideerde en erkende in-vitro/ex-vivotests beschikbaar zijn, worden de stappen 5 en 6 overgeslagen en wordt direct doorgegaan naar stap 7.

Evaluatie van in-vivohuidirritatie of -corrosie door de stof (stap 7). Wanneer er onvoldoende bewijsmateriaal bestaat voor de uitvoering van een doorslaggevende bewijskrachtanalyse van de mogelijke oogirritatie/corrosie door een stof op basis van gegevens uit bovengenoemde onderzoeken, moet eerst de mogelijke in-vivohuidirritatie/corrosie worden geëvalueerd met behulp van testmethode B.4 (4) en de bijbehorende bijlage (9). Als blijkt dat de stof huidcorrosie of hevige huidirritatie veroorzaakt, moet deze worden beschouwd als een stof die oogcorrosie veroorzaakt, tenzij er andere informatie is die tot een andere conclusie leidt. Dit betekent dat er dan geen in-vivotest op oogirritatie behoeft te worden uitgevoerd. Als de stof voor de huid niet corrosief of hevig irriterend is, moet er een in-vivotest op oogirritatie worden uitgevoerd.

In-vivotest bij konijnen (slappen 8 en 9). Een in-vivo-oogonderzoek dient te beginnen met een voorlopige test met één dier. Als de resultaten van deze test erop wijzen dat de stof hevig irriterend of corrosief voor de ogen is, dienen er geen verdere tests te worden uitgevoerd. Als er bij deze test geen corrosief of hevig irriterend effect wordt waargenomen, wordt er een bevestigende test met nog eens twee dieren uitgevoerd.

REFERENTIES

(1)OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(2)OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(3)Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.

(4)Testmethode B.4: Acute toxiciteit: huidirritatie/corrosie.

(5)Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.

(6)Neun, D.J. (1993). Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231.

(7)Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp.483-524.

(8)Testmethode B.40: Huidcorrosie.

(9)Bijlage van testmethode B.4: Een sequentiële teststrategie voor huidirritatie en -corrosie.

Figuur

TEST- EN EVALUATIESTRATEGIE VOOR OOGIRRITATIE/CORROSIE

image

image

B.6. SENSIBILISATIE VAN DE HUID

1. METHODE

1.1. INLEIDING

Opmerkingen:

De gevoeligheid en het vermogen van een test om stoffen op te sporen met potentieel huidsensibiliserende eigenschappen bij de mens zijn belangrijk in een systeem voor de classificatie van toxische stoffen ten behoeve van de volksgezondheid.

Er bestaat géén universele testmethode waarmee alle stoffen die de menselijke huid kunnen sensibiliseren, adequaat kunnen worden geïdentificeerd en die voor alle stoffen toepasbaar is.

Bij de keuze van een test moet rekening worden gehouden met factoren zoals de fysische kenmerken van een stof, met inbegrip van het vermogen om de huid binnen te dringen.

Er zijn twee soorten tests ontwikkeld die gebruik maken van cavia's: het type waarbij een adjuvans wordt gebruikt en waarbij een verhoogde allergische reactie wordt opgewekt door het oplossen of suspenderen van de teststof in Freunds compleet adjuvans (FCA), en tests waarbij geen adjuvans wordt gebruikt.

Proeven met adjuvans voorspellen een eventueel huidsensibiliserend effect van een stof bij mensen wellicht nauwkeuriger dan methoden die geen gebruik maken van Freunds compleet adjuvans; zij verdienen dan ook de voorkeur.

De maximalisatietest met cavia's is een algemeen toegepaste test waarbij een adjuvans gebruikt wordt. Alhoewel verschillende andere methoden kunnen worden gebruikt om het huidsensibiliserend vermogen van een stof aan te tonen, wordt de maximalisatietest beschouwd als de adjuvanstechniek die de voorkeur heeft.

Voor veel soorten chemicaliën worden tests waarbij geen adjuvans wordt gebruikt (de Buehlertest heeft de voorkeur) als minder gevoelig beschouwd.

In bepaalde gevallen kunnen er goede redenen zijn om de Buehlertest te verkiezen, met lokale applicatie in plaats van intradermale injectie zoals in de maximalisatietest met cavia's. Voor het gebruik van de Buehlertest dient een wetenschappelijke motivering te worden gegeven.

De maximalisatietest met cavia's en de Buehlertest worden hier beschreven. Andere methoden mogen worden gebruikt op voorwaarde dat zij goed zijn gevalideerd en wetenschappelijk verantwoord zijn.

Indien een erkende screeningtest werd uitgevoerd en daarbij een positief resultaat werd geconstateerd, mag de teststof als een potentieel sensibiliserende stof worden aangemerkt en is het niet nodig ook nog een test met cavia's uit te voeren. Indien een dergelijke test evenwel tot een negatief resultaat heeft geleid, moet een caviatest worden uitgevoerd overeenkomstig de onder deze testmethode beschreven procedure.

Zie ook algemene inleiding deel B.

1.2. DEFINITIES

Huidsensibilisatie (allergische contactdermatitis): is een door een immuunrespons veroorzaakte huidreactie op een stof. Bij mensen kan de reactie de vorm aannemen van jeuk, erytheem, oedeem (waterzucht), pukkels, blaasjes, blaren of een combinatie hiervan. Bij andere soorten kunnen de reacties anders zijn en kan alleen erytheem of oedeem optreden.

Inductieblootstelling: een experimentele blootstelling van een proefdier aan een teststof met de bedoeling een hypersensitieve toestand te induceren.

Inductieperiode: een periode van ten minste een week na de inductieblootstelling, gedurende welke een hypersensitieve toestand ontwikkeld kan worden.

Provocatieblootstelling een experimentele blootstelling — na de inductieperiode — van een voorheen reeds blootgesteld proefdier aan een teststof, om vast te stellen of het dier een hypersensitieve reactie vertoont.

1.3. REFERENTIESTOFFEN

De gevoeligheid en de betrouwbaarheid van de gebruikte technieken moet iedere zes maanden worden vastgesteld door het gebruik van stoffen waarvan bekend is dat ze lichte tot matige huidsensibiliserende eigenschappen hebben.

Bij een goed uitgevoerde test kan een reactie van ten minste 30 % worden verwacht bij een adjuvanstest en van ten minste 15 % bij een niet-adjuvanstest, bij gebruikmaking van zwakke/middelsterke sensibilisatoren.

De volgende stoffen genieten de voorkeur:



CAS-nummer

EINECS-nummer

EINECS-naam

Triviale naam

101-86-0

202-983-3

α-hexylcinnamaldehyde

α-hexylcinnamaldehyde

149-30-4

205-736-8

benzothiazol-2-thiol (mercapto-benzothiazol)

kaptax

94-09-7

202-303-5

benzocaïne

norcaïne

Er kunnen omstandigheden zijn waarbij andere referentiestoffen, die aan bovenstaande eisen voldoen, kunnen worden gebruikt; dit moet wetenschappelijk verantwoord worden.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

De proefdieren worden eerst aan de teststof blootgesteld door een intradermale injectie en/of epidermale toepassing (inductieblootstelling). Na een rustperiode van 10 tot 14 dagen (inductieperiode), tijdens welke een immuunreactie op gang kan komen, worden de dieren blootgesteld aan een provocatiedosis. De omvang en intensiteit van de cutane reactie op de provocatieblootstelling bij de proefdieren wordt vergeleken met die van de controlegroep die een blanco behandeling ondergaat bij de industrie maar wél de provocatiedosis toegediend krijgt.

1.5. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN

Als het nodig wordt geacht om de teststof te verwijderen, moet dit gebeuren met behulp van water of een ander geschikt oplosmiddel zonder dat de optredende reactie daardoor wordt beïnvloed of de opperhuid daardoor wordt geschonden.

1.5.1. Maximalisatietest met cavia's (GPMT)

1.5.1.1. Voorbereiding

Gezonde jonge volwassen albinocavia's worden ten minste 5 dagen voor het begin van de test geacclimatiseerd aan de laboratoriumomstandigheden. Voor de test worden de dieren op aselecte wijze verdeeld over de behandelingsgroepen. Verwijdering van het haar gebeurt door middel van knippen, scheren of eventueel door chemische ontharing, afhankelijk van de gebruikte testmethode. Er dient op te worden gelet dat de huid niet beschadigd wordt. De dieren worden gewogen vóór het begin en aan het einde van de test.

1.5.1.2. Proefomstandigheden

1.5.1.2.1. Proefdieren

Er wordt gebruik gemaakt van stammen albinocavia's die gewoonlijk in laboratoria worden gebruikt.

1.5.1.2.2. Aantal en geslacht

Er kan gebruik worden gemaakt van mannelijke en/of vrouwelijke dieren. Vrouwelijke dieren moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn.

Minimaal 10 dieren worden gebruikt voor de behandelde groep en ten minste vijf voor de controlegroep. Als er minder dan 20 testcavia's en 10 controlecavia's worden gebruikt en het niet mogelijk is om vast te stellen of de teststof sensibiliserende eigenschappen heeft, wordt ten sterkste aangeraden om meer dieren te testen zodat een totaal van ten minste 20 testdieren en 10 controledieren wordt bereikt.

1.5.1.2.3. Dosisniveaus

De concentratie van de teststof die voor iedere inductie wordt gebruikt moet systemisch goed te verdragen zijn en gelijk zijn aan de hoogste concentratie die lichte tot matige huidirritatie veroorzaakt. De concentratie die voor de provocatieblootstelling wordt gebruikt moet de hoogste niet-irriterende dosis zijn. Indien noodzakelijk, kunnen de juiste concentraties worden vastgesteld aan de hand van een verkennende studie bij twee of drie proefdieren. Hierbij kan worden overwogen gebruik te maken van met FCA behandelde proefdieren.

1.5.1.3. Procedure

1.5.1.3.1. Inductie

Dag 0 — Testgroep

In de onthaarde schouderstreek worden drie paar injecties van 0,1 ml gegeven, zó dat van ieder paar er één aan elke zijde ligt:

Injectie 1: een 1:1-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische zoutoplossing;

Injectie 2: de teststof in een geschikt vehiculum en in de geschikte concentratie;

Injectie 3: de teststof in de gekozen concentratie, opgelost in een l:l-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische zoutoplossing.

Voor injectie 3 worden de in water oplosbare teststoffen in water opgelost vóór het mengen met FCA. In vet oplosbare of onoplosbare stoffen worden in FCA gesuspendeerd vóór het mengen met water. De uiteindelijke concentratie van de teststof moet gelijk zijn aan die welke voor injectie 2 wordt gebruikt.

De injecties 1 en 2 worden dicht bij elkaar en het dichtst bij het hoofd toegediend en injectie 3 aan de staartzijde van het testgebied.

Dag 0 — Controlegroep

Op dezelfde plaatsen als bij de proefdieren worden drie paar intradermale injecties van 0,1 ml toegediend:

Injectie 1: een 1:1-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische zoutoplossing;

Injectie 2: het onverdunde vehiculum;

Injectie 3: een 50 %-formulering (gewicht/volume) van het vehiculum in een 1:1-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische zoutoplossing.

Dag 5-7 — Testgroep en controlegroep

Als de te onderzoeken stof geen huidirritatie geeft wordt het testgebied ongeveer 24 uur vóór de plaatselijke inductiebehandeling na knippen en/of scheren behandeld met 0,5 ml van een 10 %-formulering van natriumlaurylsulfaat in vaseline om een plaatselijke irritatie op te wekken.

Dag 6-8 — Testgroep

Het testgebied wordt opnieuw onthaard. Een filtreerpapier (2 cm × 4 cm) wordt gedrenkt met de teststof in een geschikt vehiculum en door middel van een occlusief verband gedurende 48 uur op het testgebied aangebracht. De keuze van het vehiculum moet worden verantwoord. Vaste stoffen worden verpulverd en in een geschikt vehiculum opgenomen. Vloeistoffen kunnen, zo nodig, onverdund worden aangebracht.

Dag 6-8 — Controlegroep

Het testgebied wordt opnieuw onthaard. Op dezelfde wijze als bij de testgroep wordt alleen het vehiculum aangebracht en gedurende 48 uur met het testgebied in contact gehouden door een occlusief verband.

1.5.1.3.2. Provocatie

Dag 20-22 — Testgroep en controlegroep

Beide flanken van de dieren uit de testgroep en de controlegroep worden onthaard. Op één flank van de behandelde dieren wordt een gaasje of cupje met de teststof aangebracht en, waar nodig, een gaasje of cupje met alleen het vehiculum op de andere flank. Door middel van een occlusief verband wordt het gaasje gedurende 24 uur met de huid in contact gehouden.

1.5.1.3.3. Observatie en scoring; testgroep en controlegroep

—Ongeveer 21 uur nadat het gaasje is verwijderd, wordt het provocatiegebied gereinigd en zo nodig zorgvuldig geknipt en/of geschoren en onthaard.

—Ongeveer 3 uur hierna (ongeveer 48 uur na het begin van de provocatie) wordt de reactie van de huid geobserveerd en geregistreerd volgens de in het aanhangsel vermelde scores.

—Ongeveer 24 uur na deze waarneming wordt een tweede waarneming gedaan (72 uur na aanvang provocatie) en eveneens geregistreerd.

Aangeraden wordt om de proefdieren en controledieren „blind” (d.w.z. zonder te weten of het test- of controledieren betreft) te scoren.

Als het nodig blijkt om opheldering te verkrijgen over de resultaten van de eerste provocatie kan na ongeveer een week een tweede provocatie (d.w.z. een herprovocatie) worden overwogen met, zo nodig, een nieuwe controlegroep. Herprovocatie kan ook plaatsvinden bij de oorspronkelijke controlegroep.

Alle reacties van de huid en alle ongewone bevindingen, waaronder ook systemische reacties, die het gevolg zijn van de inductie- en provocatieprocedures moeten worden geobserveerd en geregistreerd volgens de scoreschaal van Magnusson/Kligman (zie aanhangsel). Andere technieken zoals histopathologisch onderzoek of meting van de dikte van de huidplooi kunnen worden toegepast om klaarheid te verschaffen omtrent onduidelijke reacties.

1.5.2. Buehlertest

1.5.2.1. Voorbereiding

Gezonde jonge volwassen albinocavia's worden ten minste 5 dagen voor het begin van de test geacclimatiseerd aan de laboratoriumomstandigheden. Voor de test worden de dieren op aselecte wijze verdeeld over de behandelingsgroepen. Verwijdering van het haar gebeurt door middel van knippen, scheren of eventueel door chemische ontharing, afhankelijk van de gebruikte testmethode. Er dient op te worden gelet dat de huid niet beschadigd wordt. De dieren worden gewogen vóór het begin en aan het eind van de test.

1.5.2.2. Proefomstandigheden

1.5.2.2.1. Proefdieren

Er wordt gebruik gemaakt van stammen albinocavia's die gewoonlijk in laboratoria worden gebruikt.

1.5.2.2.2. Aantal en geslacht

Er kan gebruik worden gemaakt van mannelijke en/of vrouwelijke dieren. Vrouwelijke dieren moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn.

Voor de behandelde groep worden minimaal 20 dieren gebruikt en voor de controlegroep ten minste 10.

1.5.2.2.3. Dosisniveaus

De concentratie van de teststof die voor iedere inductie wordt gebruikt moet de hoogste zijn die lichte maar geen excessieve huidirritatie geeft. De concentratie die voor de provocatieblootstelling wordt gebruikt moet de hoogste niet-irriterende dosis zijn. Indien noodzakelijk, kunnen de juiste concentraties worden vastgesteld aan de hand van een verkennende studie bij twee of drie proefdieren.

Als de teststoffen in water oplosbaar zijn verdient water of een verdunde, niet-irriterende oplossing van een surfactans de voorkeur als vehiculum. Bij andere teststoffen wordt de voorkeur gegeven aan 80 % alcohol/water bij de inductie en aan aceton bij de provocatie.

1.5.2.3. Procedure

5.5.2.3.1. Inductie

Dag 0 — Testgroep

Eén flank wordt onthaard. Het testgaasje moet doordrenkt zijn met de teststof in een geschikt vehiculum (de keuze van het vehiculum moet worden verantwoord; vloeibare teststoffen kunnen eventueel onverdund worden aangebracht).

Het testgaasje wordt op het testgebied aangebracht en daarmee gedurende 6 uur in contact gehouden door een occlusieve pleister of een cupje en een geschikt verband.

Het testgaasje moet afdekkend zijn. Er kan gebruik worden gemaakt van een rond of vierkant wattenschijfje met een oppervlakte van ongeveer 4-6 cm2. Om een goede afdekking te garanderen kan een passende voorziening worden gebruikt waardoor de bewegingsvrijheid van de dieren wordt beperkt. Bij gebruik van een zwachtel alléén kan herhaalde blootstelling nodig zijn.

Dag 0 — Controlegroep

Een flank wordt onthaard. Op dezelfde wijze als bij de testgroep wordt nu alleen het vehiculum aangebracht. Het testgaasje wordt op het testgebied aangebracht en daarmee gedurende 6 uur in contact gehouden door een occlusieve pleister of een cupje en een geschikt verband. Als kan worden aangetoond dat een blanco controlegroep niet nodig is, kunnen niet-behandelde dieren als controlegroep worden gebruikt.

Dag 6-8 en 13-15 — Testgroep en controlegroep

Hetzelfde testoppervlak van dezelfde flank ondergaat, na eventuele verwijdering van de beharing, op dag 6-8 en nogmaals op dag 13-15 dezelfde blootstelling als op dag 0.

1.5.2.3.2. Provocatie

Dag 27-29 — Testgroep en controlegroep

De onbehandelde flank van de test- en controledieren wordt onthaard. Een occlusieve pleister of een cupje met de juiste hoeveelheid teststof in de maximale niet-irriterende concentratie, wordt aangebracht op het achterste deel van de flank van de testdieren en van de controledieren.

Indien dit wenselijk is wordt op het voorste gedeelte van de onbehandelde flank van zowel de testdieren als de controledieren een occlusieve pleister of een cupje met alleen het vehiculum aangebracht. De pleisters of cupjes worden gedurende 6 uur op hun plaats gehouden door een geschikt verband.

1.5.2.3.3. Observatie en scoring

—Ongeveer 21 uur nadat de pleister is verwijderd wordt het provocatiegebied onthaard.

—Ongeveer 3 uur hierna (ongeveer 30 uur na het begin van de provocatie) wordt de reactie van de huid geobserveerd en geregistreerd volgens de in het aanhangsel vermelde scores.

—Ongeveer 24 uur na de 30-uurswaarneming wordt een tweede waarneming van de huidreacties gedaan (ongeveer 54 uur na aanvang van de provocatie) en worden de resultaten weer geregistreerd.

Aangeraden wordt om de testdieren en controledieren „blind” (d.w.z. zonder te weten of het test-of controledieren betreft) te scoren.

Als het nodig blijkt om opheldering te verkrijgen over de resultaten van de eerste provocatie kan na ongeveer een week een tweede provocatie (d.w.z. een herprovocatie) overwogen worden met, zo nodig, een nieuwe controlegroep. Herprovocatie kan ook plaatsvinden bij de oorspronkelijke controlegroep.

Alle reacties van de huid en alle ongewone bevindingen, waaronder ook systemische reacties, die het gevolg zijn van de inductie- en provocatieprocedures moeten worden geobserveerd en geregistreerd volgens de schaal van Magnusson/Kligman (zie aanhangsel). Andere technieken zoals histopathologisch onderzoek of meting van de dikte van de huidplooi kunnen worden toegepast om klaarheid te verschaffen omtrent onduidelijke reacties.

2. GEGEVENS (GPMT EN BUEHLERTEST)

Alle gegevens moeten in tabelvorm worden samengevat, waarbij voor ieder dier de bij iedere controle waargenomen huidreacties worden vermeld.

3. RAPPORTAGE (GPMT EN BUEHLERTEST)

Wanneer vóór de proef met cavia's een screeningstest wordt uitgevoerd, moet een beschrijving van of verwijzing naar de test in kwestie (bijvoorbeeld de Local Lymph Node Assay (LI.NA) of de Mouse Ear Swelling Test (MEST)) worden gegeven en moeten bijzonderheden over de procedure worden verstrekt. Verder moeten de resultaten worden gerapporteerd die met de teststof en de referentiestof zijn verkregen.

Verslag van de proefnemingen (GPMT en Buehlertest)

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

Proefdieren:

—gebruikte caviastam;

—aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;

—herkomst, behuizing, dieet, enz.;

—gewicht van ieder dier bij het begin van de proefneming.

Proefomstandigheden:

—gebruikte techniek bij het prepareren van het te behandelen oppervlak;

—bijzonderheden met betrekking tot het pleister- of gaasmateriaal en de wijze van aanbrengen;

—resultaten van de voorstudie met conclusies over de inductie- en provocatieconcentraties die bij de test moeten worden gebruikt;

—bijzonderheden over de bereiding van de teststof, het toedienen en het verwijderen hiervan;

—motivering van de keuze van het vehiculum;

—concentraties van vehiculum en teststof die gebruikt zijn bij de inductie en de provocatie en de totale hoeveelheid teststof die gebruikt is voor inductie en provocatie.

Resultaten:

—een samenvatting van de resultaten van de meest recente gevoeligheids- en betrouwbaarheidscontrole (zie 1.3), met inbegrip van informatie over gebruikte teststof, concentratie en vehiculum;

—resultaten voor ieder dier afzonderlijk, inclusief scores;

—beschrijving van de aard en de intensiteit van de waargenomen effecten;

—eventuele histopathologische bevindingen.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies.

4. LITERATUUR

Deze methode komt overeen met TG 406 van de OESO

Aanhangsel

TABEL

Magnusson/Kligman-scoreschaal voor de evaluatie van reacties op de provocatiepleister

0 = geen zichtbare verandering

1 = discontinu of vlekkerig erytheem

2 = matig en aaneengesloten erytheem

3 = ernstig erytheem met zwelling

B.7. TOXICITEIT (ORAAL) BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN)

1. METHODE

1.1. INLEIDING

Zie algemene inleiding deel B.

1.2. DEFINITIES

Zie algemene inleiding deel B.

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

De teststof wordt gedurende een periode van 28 dagen dagelijks oraal toegediend aan verschillende groepen proefdieren, in trapsgewijs stijgende doses. Er wordt één dosis per groep gebruikt. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks zorgvuldig geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven of worden afgemaakt, wordt een necropsie verricht. Dieren die aan het eind van het onderzoek nog in leven zijn worden afgemaakt en ook hierop wordt een necropsie verricht.

Bij deze methode ligt het accent meer op neurologische effecten als specifiek eindpunt. Benadrukt moet worden dat het noodzakelijk is de dieren zorgvuldig klinisch te observeren om zoveel mogelijk informatie te verzamelen. Deze methode moet het mogelijk maken potentieel neurotoxische chemicaliën te identificeren, die in dit opzicht nader verdienen te worden onderzocht. Voorts kan deze methode aanwijzingen geven over immunologische effecten en toxiciteit voor de voortplantingsorganen.

1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.4.1. Voorbereidingen

Gezonde jonge volwassen dieren worden op aselecte wijze verdeeld over de controlegroep en de testgroepen. De kooien moeten op zodanige wijze worden opgesteld dat eventuele plaatseffecten geminimaliseerd worden. De dieren worden individueel geïdentificeerd en worden vóór het onderzoek ten minste 5 dagen in hun kooi gehouden ter acclimatisatie aan de laboratoriumomstandigheden.

De teststof wordt toegediend via een maagsonde of via de voeding of het drinkwater. De wijze van toedienen is afhankelijk van het doel van het onderzoek en de fysisch/chemische eigenschappen van de teststof.

Zo nodig moet de teststof worden opgelost of gesuspendeerd in een geschikt vehiculum. Het verdient aanbeveling om zo mogelijk een waterige oplossing of suspensie te gebruiken. Als dit niet mogelijk is kan voor een oplossing of suspensie in olie (bij voorbeeld maïsolie) of in laatste instantie voor een oplossing in een ander medium worden gekozen. Van andere media dan water moeten de toxicologische karakteristieken bekend zijn. De stabiliteit van de teststof in het vehiculum moet worden vastgesteld.

1.4.2. Proefomstandigheden

1.4.2.1. Proefdieren

De voorkeur wordt gegeven aan ratten, hoewel andere knaagdiersoorten kunnen worden gebruikt. Er dient gebruik te worden gemaakt van jonge gezonde volwassen dieren van rattenstammen die gewoonlijk in laboratoria worden gebruikt. De wijfjes moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn. De toediening moet zo snel mogelijk na het verspenen beginnen en in ieder geval vóór de dieren negen weken oud zijn.

Bij het begin van de studie moet de gewichtsvariatie van de dieren minimaal zijn en mag het gewicht van ieder dier niet meer dan 20 % afwijken van het gemiddelde gewicht.

Als een proef met herhaalde orale toediening wordt uitgevoerd als inleiding op een studie van langere duur, moeten de dieren in beide studies bij voorkeur tot dezelfde stam behoren en dezelfde oorsprong hebben.

1.4.2.2. Aantal en geslacht

Op ieder dosisniveau moeten ten minste 10 dieren (5 mannetjes en 5 wijfjes) worden gebruikt. Indien het de bedoeling is sommige dieren tussentijds te doden, moet het aantal dieren worden verhoogd met het aantal dat volgens de proefopzet tussentijds zal worden gedood.

Daarnaast kan een satellietgroep van 10 dieren (5 per geslacht) gedurende 28 dagen worden behandeld met het hoge dosisniveau en vervolgens gedurende 14 dagen na de behandeling worden geobserveerd om na te gaan of de toxische effecten eventueel verdwijnen, voortduren of pas later tot uiting komen. Tevens wordt een satellietgroep van 10 controledieren (5 per geslacht) gebruikt.

1.4.2.3. Dosisniveaus

In het algemeen zijn drie testgroepen en een controlegroep vereist. Afgezien van de behandeling met de teststof moeten de dieren van de controlegroep op dezelfde wijze worden behandeld als de dieren in de testgroep Indien een vehiculum wordt gebruikt bij het toedienen van de teststof moet de controlegroep het grootste gebruikte volume van dat vehiculum toegediend krijgen.

Als uit andere gegevens kan worden geconcludeerd dat bij een dagelijkse dosis van 1 000 mg/kg lichaamsgewicht geen effecten worden verwacht, kan een limiettest worden uitgevoerd. Als er geen bruikbare gegevens beschikbaar zijn, kan een studie worden uitgevoerd om de orde van grootte van de te gebruiken doses te helpen bepalen.

De dosisniveaus moeten worden gekozen in het licht van de bestaande gegevens over toxiciteit en (toxico)kinetica van de teststof en verwante stoffen. Het hoogste dosisniveau moet zó gekozen worden dat toxische effecten optreden, maar geen sterfte of ernstig lijden. Verder moet een dalende reeks doses worden gekozen met het oog op het vaststellen van een eventuele dosis-responsrelatie en het niveau zonder schadelijk effect (NOAEL) op het laagste dosisniveau. Dosisniveaus die telkens een factor 2 à 4 verschillen zijn vaak optimaal. Toevoeging van een vierde testgroep is vaak te prefereren boven een zeer groot niveauverschil (bijvoorbeeld een factor 10 of meer) tussen de opvolgende doses.

Indien de stoffen via de voeding of het drinkwater worden toegediend is het van belang erop te letten dat de betrokken hoeveelheden teststof de normale voedings- of waterbalans niet verstoren. Als de teststof via de voeding wordt toegediend kan een vaste concentratie in de voeding (ppm) worden gebruikt óf een constant dosisniveau in termen van het lichaamsgewicht van het dier. Aangegeven moet worden welk alternatief is gebruikt. Bij gebruik van een maagsonde voor het toedienen van de teststof moet de dosis iedere dag op hetzelfde tijdstip worden gegeven en zo nodig worden aangepast om een constant dosisniveau per kg lichaamsgewicht te handhaven.

Als een studie met herhaalde toediening wordt gebruikt als voorloper van een studie op lange termijn moet bij beide studies soortgelijk voedsel worden verstrekt.

1.4.2.4. I.imiettest

Als volgens de hier beschreven procedures een proef wordt uitgevoerd met een dosisniveau van ten minste 1 000 mg/kg lichaamsgewicht per dag — of, in het geval van toediening via het voedsel of het drinkwater, het equivalente percentage in het voedsel of het water (berekend overeenkomstig het lichaamsgewicht) — en er geen waarneembare toxische effecten optreden, en deze ook niet kunnen worden verwacht op grond van gegevens betreffende stoffen met verwante structuur, is het niet noodzakelijk een volledige proef met drie dosisniveaus te doen. De limiettest is van toepassing tenzij het niveau waarop de mens kan worden blootgesteld, testen met een hogere dosis noodzakelijk maakt.

1.4.2.5. Observatieperiode

De dieren moeten 28 dagen worden geobserveerd. Dieren uit een satellietgroep die bestemd is voor vervolgwaarnemingen moeten daarna nog ten minste 14 dagen zonder behandeling worden geobserveerd om de persistentie van de toxische effecten c.q. het herstel alsmede het eventuele optreden van vertraagde toxiciteit te kunnen waarnemen.

1.4.3. Procedure

De dieren krijgen de teststof gedurende 28 dagen zeven maal per week toegediend. Indien de teststof vijf maal per week wordt toegediend moet dit worden verantwoord. Als de teststof wordt toegediend via een maagsonde, moet dit in één keer gebeuren onder gebruikmaking van een maagcatheter of een geschikte intubatiecanule. De maximale hoeveelheid vloeistof die per keer kan worden toegediend hangt af van de grootte van het dier. Het volume mag niet meer zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht, behalve als er een waterige oplossing wordt gebruikt, in welk geval 2 ml/100 g lichaamsgewicht is toegestaan. Met uitzondering van irriterende of bijtende stoffen, die gewoonlijk hevigere effecten veroorzaken bij hogere concentraties, moet de variabiliteit van het testvolume worden geminimaliseerd door aanpassing van de concentratie, zodat op alle dosisniveaus hetzelfde constante testvolume wordt gebruikt.

1.4.3.1. Algemene observaties

Algemene klinische waarnemingen moeten ten minste eenmaal per dag plaatsvinden, bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip en met in achtneming van de piekperiode van de te verwachten effecten na toediening. De gezondheidstoestand van de dieren moet worden geregistreerd. De dieren moeten ten minste tweemaal per dag worden geobserveerd op ziekteverschijnselen en sterfte. Stervende dieren en dieren die in grote nood verkeren of hevige pijn lijden moeten worden verwijderd, op humane wijze afgemaakt en aan een necropsie onderworpen.

Alle dieren worden éénmaal voor het begin van de proef nauwkeurig klinisch onderzocht (om intra-individuele vergelijking mogelijk te maken) en vervolgens ten minste eenmaal per week. Dit onderzoek moet buiten de kooi op een vaste onderzoekplaats en bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip uitgevoerd worden. De resultaten moeten zorgvuldig worden geregistreerd, waarbij bij voorkeur gebruik wordt gemaakt van scoringsystemen die expliciet door het testlaboratorium zijn vastgelegd. Er moet zoveel mogelijk worden gezorgd dat variaties in de proefomstandigheden minimaal zijn en dat de waarnemers niet weten welke behandeling een gegeven dier heeft ondergaan. Tekenen waarop moet worden gelet zijn onder meer (maar niet alleen): veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en uitscheiding, en onwillekeurige reacties zoals traanvorming, rechtopstaan van het haar, verandering van de pupilgrootte of een ongewoon ademhalingspatroon. Veranderingen in gang, houding en respons op vasthouden en ook het uitvoeren van clonische of tonische bewegingen, stereotypen (bij voorbeeld excessief poetsgedrag, ronddraaien) of afwijkend gedrag (bijvoorbeeld zelfverminking, achteruitlopen) moeten worden geregistreerd.

Gedurende de vierde week van de blootstelling moet de sensorische reactiviteit op stimuli van verschillende aard (auditief, visueel en proprioceptief) worden bepaald en moet een bepaling van de grijpkracht en de motorische activiteit plaatsvinden. Nadere bijzonderheden omtrent de te volgen procedures zijn te vinden in de literatuur (zie algemene inleiding deel B).

Als de studie wordt verricht als voorstudie op een daaropvolgende subchronische (90-daagse) studie, kunnen functionele observaties in de vierde week achterwege worden gelaten. In dat geval moeten de functionele observaties in het bedoelde vervolgonderzoek plaatsvinden. Daar staat echter tegenover dat de beschikbaarheid van gegevens betreffende functionele prestaties uit de studie met herhaalde toediening, de keuze van de dosisniveaus voor de daaropvolgende subchronische studie ten goede kan komen.

Bij wijze van uitzondering kunnen functionele observaties ook achterwege blijven bij groepen die verder dermate sterke toxiciteitseffecten vertonen dat het testen van de functionele prestaties daardoor ernstig wordt gehinderd.

1.4.3.2. Lichaamsgewicht en voedel/waterconsumptie

Ieder dier moet ten minste eenmaal per week worden gewogen. De opgenomen hoeveelheid voedsel en water moet minstens eenmaal per week worden gemeten. Indien de teststof via het drinkwater wordt toegediend moet de waterconsumptie ook minstens eenmaal per week worden gemeten.

1.4.3.3. Hematologie

Aan het eind van de testperiode moeten de volgende onderzoeken worden verricht: bepaling van de hematocriet en de homoglobineconcentratie, erythrocytentelling, totale en differentiële leuko-cytentelling, plaatjestelling en bepaling van de stollingstijd en het stollingsvermogen.

De bloedmonsters worden genomen net vóór of tijdens het afmaken van de dieren; er dient te worden genoteerd uit welk lichaamsdeel. De monsters moeten onder de juiste omstandigheden worden bewaard.

1.4.3.4. Klinische biochemie

Om belangrijke toxische effecten op de weefsels en met name op de nieren en de lever te onderzoeken, moet klinisch-biochemisch onderzoek verricht worden op bloedmonsters van alle dieren, met uitzondering van de dieren die stervend zijn aangetroffen of die voortijdig zijn afgemaakt. Deze monsters moeten juist vóór het afmaken of als onderdeel van de procedure hiervoor worden genomen. Het verdient aanbeveling om de dieren vóór het bloedafnemen een nacht te laten vasten (16). Onderzoek van plasma en serum moet omvatten: natrium, kalium, glucose, totaal cholesterol, ureum, creatinine, totaal proteïne en albuminc, ten minste twee enzymen die een indicatie geven van hepatocellulaire effecten (zoals alanineaminotransferase, aspartaataminotransferase, alkalische fosfatase, gamma- glutamyltranspeptidase en sorbitoldehydrogenase). Bepaling van andere enzymen (van hepatische of andere oorsprong) en galzuren kan onder bepaalde omstandigheden nuttige informatie geven.

De volgende facultatieve urineanalysebepalingen kunnen tijdens de laatste week van het onderzoek worden uitgevoerd op basis van een volgens een vast tijdschema verlopende urinemonsterneming: aspect, hoeveelheid, osmolaliteit of dichtheid, pH, proteïnen, glucose en bloed/bloedcellen.

Verder moet een onderzoek naar serummarkers van algemene weefselschade overwogen worden. Andere onderzoeken die moeten worden uitgevoerd als van de teststof bekend is, of vermoed wordt, dat zij de desbetreffende metabolische profielen beïnvloedt, zijn: calcium, fosfaat, triglyce-riden (nuchterwaarde), specifieke hormonen, methemoglobine en cholesterinase. Deze moeten in het geval van teststoffen uit bepaalde klassen c.q. van geval tot geval worden geïndentificeerd.

In het algemeen is een flexibele aanpak noodzakelijk, afhankelijk van het soort proefdieren en het waargenomen en/of verwachte effect van een bepaalde stof.

Als bij gebrek aan referentiegegevens geen adequate vergelijkingsbasis voorhanden is, moet worden overwogen om hematologische en klinisch-biochemische variabelen te bepalen vóór met de toediening wordt begonnen.

1.4.3.5. Macroscopische necropsie

Alle proefdieren uit het onderzoek moeten worden onderworpen aan een volledige, gedetailleerde macroscopische necropsie, die onder meer een zorgvuldig onderzoek van het uitwendige oppervlak van het lichaam, alle lichaamsopeningen en de hersen-, borst- en buikholte en de organen daarin omvat. De lever, nieren, bijnieren, testes, bijballen, zwezerik, milt, hersenen en het hart van alle dieren moeten worden ontdaan van alle aanhangend weefsel en zo snel mogelijk na dissectie in natte toestand worden gewogen om uitdroging te voorkomen.

De volgende weefsels moeten worden geconserveerd in het fixeermiddel dat zowel voor het type weefsel als het voorgenomen histopathologische onderzoek het meest geschikt is: alle grotere laesies, hersenen (representatieve delen waaronder de grote en kleine hersenen en de brug van Varol), ruggenmerg, maag, dunne en dikke darm met plaques van Peyer, lever, nieren, bijnieren, milt, hart, zwezerik, schildklier, luchtpijp en longen (conserveren door opblazen met een fixatief en dan onderdompelen), geslachtsklieren, secundaire geslachtsorganen (bij voorbeeld uterus, prostaat), urineblaas, lymfeklieren (bij voorkeur een klier die in de route van de toediening gelegen is en één die daar ver van verwijderd is, om rekening te houden met systemische effecten), perifere zenuwen (grote heupzenuw of scheenbeenzenuw), bij voorkeur dicht bij de spier, en een coupe van het beenmerg (of, in plaats daarvan, een direct op een objectglaasje aangebracht stukje opgezogen beenmerg). De resultaten van het klinische onderzoek en van andere onderzoeken kunnen aanleiding zijn om nog andere weefsels te bestuderen. Ook moeten alle andere organen worden, geconserveerd die, voor zover bekend is van de eigenschappen van de teststof, waarschijnlijk als doelorgaan fungeren.

1.4.3.6. Histopathologisch onderzoek

Bij de dieren in de met de hoogste dosisniveau behandelde groep en bij de dieren in de controlegroep moet een volledig histopathologisch onderzoek worden verricht op de geconserveerde organen en weefsels. Als met de behandeling samenhangende veranderingen worden geconstateerd in de groep met de hoogste dosering, moet het onderzoek worden uitgebreid tot de dieren van alle andere doseringsgroepen.

Alle grotere laesies moeten worden onderzocht.

Indien gebruik wordt gemaakt van een satellietgroep moet ook daarbij histopathologisch onderzoek worden verricht op alle organen die in de behandelde groep effecten vertonen.

2. GEGEVENS

Er moeten individuele gegevens worden verstrekt. Verder moeten alle gegevens worden samengevat in tabellen die voor iedere proefgroep laten zien: het aantal dieren aan het begin van de test, het aantal dieren dat tijdens de test is gestorven of om ethische redenen is afgemaakt en het tijdstip waarop, het aantal dat verschijnselen van toxiciteit vertoonde, een beschrijving van de waargenomen toxiciteitsverschijnselen, waaronder het tijdstip van aanvang, de duur en ernst van de verschijnselen, het aantal dieren dat laesies vertoonde, het soort laesie en het percentage dieren dat elk soort laesie vertoonde.

Zo mogelijk moeten de numerieke resultaten met behulp van een geschikte en algemeen geaccepteerde statistische methode worden geëvalueerd. De gebruikte methoden moeten reeds bij het ontwerpen van de studie worden gekozen.

3. RAPPORTAGE

VERSLAG VAN HET ONDERZOEK

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

Proefdieren:

—diersoort/stam;

—aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;

—herkomst, behuizing, voeding enz.;

—individueel gewicht als bepaald aan het begin van de test, daarna met wekelijkse intervallen en aan het einde van de test.

Proefomstandigheden:

—motivering van de keuze van het vehiculum als dit geen water was;

—motivering voor de keuze van het dosisniveau;

—bijzonderheden over de bereiding van het teststof/voedselpreparaat, bereikte concentratie, stabiliteit en homogeniteit van het preparaat;

—bijzonderheden over het toedienen van de teststof;

—conversie van teststofconcentratie in voedsel/drinkwater (ppm) naar actuele dosis (mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing;

—bijzonderheden over het soort voedsel en het drinkwater.

Resultaten:

—lichaamsgewicht/veranderingen hierin;

—voedsel- en waterconsumptie, indien van toepassing;

—gegevens over de toxische respons, waaronder tekenen van toxiciteit, uitgesplitst per geslacht en dosisniveau;

—aard, ernst en duur van de klinische verschijnselen (al of niet reversibel);

—sensorische activiteit, grijpkracht en motorische activiteit;

—hematologisch onderzoek {met relevante vergelijkingsbasis);

—klinisch-biochemisch onderzoek (met relevante vergelijkingsbasis);

—lichaamsgewicht bij het afmaken en gegevens over het gewicht van de organen;

—resultaten van de necropsie;

—een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevindingen;

—absorptiegegevens, indien beschikbaar;

—statistische verwerking van de gegevens, waar relevant.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies.

4. LITERATUUR

Deze methode komt overeen met TG 407 van de OESO.

B.8. TOXICITEIT (INHALATIE) BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN)

1. METHODE

1.1. INLEIDING

Het is nuttig om over oriënterende informatie te beschikken ten aanzien van de deeltjesgrootteverdeling, de dampspanning, het smeltpunt, het kookpunt, het vlampunt en het ontploffingsgevaar (indien van toepassing) van de te onderzoeken stof.

Zie verder algemene inleiding deel B (punt A).

1.2. DEFINITIES

Zie algemene inleiding deel B (punt B).

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Geen.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

Verscheidene groepen proefdieren worden gedurende een periode van 28 dagen dagelijks een bepaalde tijd aan geleidelijk stijgende concentraties van de teststof blootgesteld. Er wordt een concentratie per groep gebruikt. Indien een medium wordt gebruikt om de juiste concentratie van de teststof in de atmosfeer te bereiken, moet een mediumcontrolegroep worden toegevoegd. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het eind van de proefnemingen leven, wordt necropsie verricht.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

Geen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.1. Voorbereidingen

Vóór het onderzoek worden de dieren ten minste 5 dagen onder gelijke huisvestings- en voedingsomstandigheden gehouden als gedurende de proef. Gezonde jonge dieren worden op willekeurige wijze voor het onderzoek in het vereiste aantal groepen ingedeeld. Waar nodig wordt een passend medium aan de teststof toegevoegd teneinde de juiste concentratie van de teststof in de atmosfeer te bereiken. Indien een medium of andere additieven worden gebruikt om de dosering te vergemakkelijken, moet bekend zijn dat deze geen toxische effecten veroorzaken. In voorkomend geval kunnen bestaande gegevens worden gebruikt.

1.6.2. Proefomstandigheden

1.6.2.1. Proefdieren

Tenzij er contra-indicaties zijn, wordt de voorkeur gegeven aan ratten. Er dient gebruik te worden gemaakt van jonge gezonde dieren van rattenstammen die gewoonlijk in laboratoria worden gebruikt.

Bij het begin van de studie mag het gewicht van de dieren die bij de test worden gebruikt niet meer dan ± 20 % van het betreffende gemiddelde gewicht afwijken.

1.6.2.2. Aantal en geslacht

Voor iedere testgroep moeten ten minste tien dieren (vijf wijfjes en vijf mannetjes) worden gebruikt. De wijfjes moeten nullipaar zijn en niet zwanger. Indien het de bedoeling is tussentijds dieren te doden, moet het aantal worden verhoogd met het aantal dieren dat volgens plan voor de voltooiing van de studie zal worden gedood. Daarnaast kan een satellietgroep van tien dieren (vijf per geslacht) gedurende 28 dagen worden behandeld met het hoogste concentratieniveau, waarna zij nog gedurende 14 dagen na de behandeling worden geobserveerd om na te gaan of de toxische effecten eventueel verdwijnen, voortduren of pas later tot uiting komen. Tevens wordt een satellietgroep van tien controledieren (vijf per geslacht) gebruikt.

1.6.2.3. Blootstellingsconcentraties

Ten minste drie concentraties met een controle of een mediumcontrole (overeenkomend met de concentratie van het medium bij het hoogste expositieniveau), indien een medium wordt gebruikt, zijn vereist. Afgezien van de toediening van de teststof moeten de dieren in de controlegroep op dezelfde wijze als de dieren in de testgroepen worden behandeld. De hoogste concentratie moet leiden tot toxische effecten, maar er mogen geen of weinig sterfgevallen voorkomen. Bij de laagste concentratie mogen geen tekenen van toxiciteit optreden. Indien het blootstellingsniveau van de mens kan worden geschat, moet de laagste concentratie deze overschrijden. In het ideale geval treden bij de middelste concentratie minimaal waarneembare toxische effecten op. Bij meer dan één tussenconcentratie moet het verschil tussen de concentraties zo groot zijn dat een gradatie in toxische effecten wordt verkregen. In de groep met de laagste concentratie, in de tussengroepen en in de controlegroepen mogen niet veel sterfgevallen voorkomen, omdat anders een zinvolle evaluatie van de resultaten niet mogelijk is.

1.6.2.4. Blootstellingstijd

De dagelijkse blootstellingstijd bedraagt 6 uur, maar een afwijkende duur kan in verband met specifieke vereisten nodig zijn.

1.6.2.5. Apparatuur

De dieren worden aan de teststoffen blootgesteld met behulp van inhalatieapparatuur die zodanig is gebouwd dat kan worden gezorgd voor een dynamische luchtdoorstroming van ten minste 12 luchtverversingen per uur, een toereikend zuurstofgehalte en een gelijkmatige verdeling van de teststof in de atmosfeer. Als van een expositiekamer gebruik wordt gemaakt, moet deze op zodanige wijze zijn ontworpen dat de dieren zo min mogelijk bij elkaar kunnen kruipen en zoveel mogelijk door inhalatie aan de teststof worden blootgesteld. Als algemene regel voor het verzekeren van een stabiele atmosfeer in de expositiekamer geldt dat het totale „volume” van de proefdieren niet méér mag bedragen dan 5 % van het volume van de blootstellingskamer. Naar keuze kunnen de dieren oronasaal, alleen met hun kop of individueel met hun hele lijf aan de testlucht worden blootgesteld; de eerste twee methoden zullen ertoe bijdragen dat zo min mogelijk teststof via andere wegen in het lichaam wordt opgenomen.

1.6.2.6. Observatieperiode

De proefdieren moeten tijdens de gehele periode van behandeling en herstel dagelijks op tekenen van toxiciteit worden onderzocht. Het tijdstip waarop de dood intreedt, het tijdstip waarop toxische verschijnselen voor het eerst zijn waargenomen en het tijdstip waarop zij weer verdwijnen, moeten worden genoteerd.

1.6.3. Uitvoering

De dieren worden gedurende een periode van 28 dagen, 5 tot 7 dagen per week aan de teststof blootgesteld. Dieren in satellietgroepen voor latere waarnemingen moeten nog 14 dagen zonder behandeling worden gehouden om herstel of voortduren van de toxische effecten te kunnen vaststellen. Tijdens de proefnemingen dient de temperatuur op 22 oC ± 3 oC te worden gehouden.

In het ideale geval moet de relatieve vochtigheid tussen 30 % en 70 % worden gehouden, behalve waar dit niet goed uitvoerbaar is (bijvoorbeeld bij het testen van sommige aerosolen). Het onderhouden van een lichte onderdruk (< 5 mm water) voorkomt het weglekken van de teststof naar de omgeving. Gedurende de blootstelling worden de dieren voedsel en water onthouden.

Er moet gebruik worden gemaakt van een dynamisch inhalatiesysteem met een geschikt systeem voor de analytische controle van de concentratie. Aanbevolen wordt in een verkennende proef vast te stellen welke blootstellingsconcentraties voor de proeven het meest geschikt zijn. De doorstromingssnelheid moet zodanig worden aangepast dat de condities in de expositiekamer homogeen zijn. Het systeem moet waarborgen dat de omstandigheden bij de proef zo spoedig mogelijk stabiel zijn.

De volgende parameters moeten worden gemeten of gemonitord:

a)de luchtdoorstromingssnelheid (luchtdebiet) (continu);

b)de feitelijke concentratie van de teststof in het ademhalingsgebied. Tijdens de dagelijkse blootstelling mag de concentratie met niet méér dan ± 15 % van het gemiddelde afwijken. Bij sommige aerosolen is het mogelijk dat de concentratie niet binnen deze grenzen gehouden kan worden; in dat geval kan een grotere afwijking worden aanvaard. Tijdens de gehele duur van de studie moeten de dagelijkse concentraties zo constant mogelijk worden gehouden. Voor aerosolen moet ten minste éénmaal per week bij elke testgroep de deeltjesgrootteverdeling worden geanalyseerd;

c)de temperatuur en de vochtigheid (continu, indien mogelijk);

Tijdens en na de blootstelling worden waarnemingen gedaan die voor elk individueel dier systematisch worden geregistreerd. Alle dieren moeten dagelijks worden geobserveerd; tekenen van toxiciteit moeten worden genoteerd met het tijdstip waarop deze voor het eerst optreden en de mate en de duur ervan. Bij het observeren wordt in ieder geval aandacht besteed aan veranderingen van huid en vacht, ogen, slijmvliezen, ademhalingsorganen, bloedsomloop, autonoom en centraal zenuwstelsel, somatomotorische activiteit en gedrag. Wekelijks moeten de dieren worden gewogen. Het wordt eveneens aanbevolen het voerverbruik wekelijks te meten. De dieren moeten regelmatig worden geobserveerd, om te voorkomen dat ze voor de studie verloren gaan als gevolg van oorzaken als kannibalisme, autolyse van weefsels of omdat de dieren in verkeerde kooien zijn geplaatst. Na afloop van de onderzoekperiode wordt bij alle overlevende dieren in de behandelde groepen (afgezien van de dieren in de satellietgroep) necropsie verricht. Stervende dieren of dieren met hevige angst of pijn, moeten meteen na ontdekking worden verwijderd en op een humane manier worden gedood; bij hen wordt eveneens necropsie verricht.

Na afloop van de proeven moet bij alle dieren, met inbegrip van die uit de controlegroep, het volgende worden onderzocht:

i)hematologie, waarbij ten minste bepaling van hematocriet en hemoglobinegehalte, erythrocytentelling, totale en gedifferentieerde telling van de leucocyten en meting van stollingseigenschappen moeten worden uitgevoerd;

ii)klinisch-biochemische bepalingen in het bloed waarbij ten minste één parameter van de leverfunctie en nierfunctie wordt bekeken: serum alanineaminotransferase (vroegere benaming: serum glutaminezuur-py-rodruivenzuur-transaminase (SGPT)), serum aspartaataminotransferase (vroegere benaming: serum glutaminezuur-oxaalazijnzuur-transaminase (SGOT)), ureum, albumine, bloedcreatinine, totaal bilirubine en totaal serumeiwit.

Voor een goede toxicologische evaluatie kan het nodig zijn het onderzoek uit te breiden met: calcium, fosfor, chloride, natrium, kalium, glucosegehalte in nuchtere toestand, analyse van de lipiden, hormonen, zuur/base-evenwicht, methemoglobine en cholinesterase-activiteit.

Zo nodig kan verder klinisch-biochemisch onderzoek worden verricht om het onderzoek van de waargenomen effecten uit te breiden.

1.6.3.1. Macroscopische necropsie

Bij alle dieren in de studie moet een volledige macroscopische necropsie worden uitgevoerd. Zo spoedig mogelijk na sectie moeten ten minste lever, nieren, bijnieren, longen en testes nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. Organen en weefsels (de ademhalingswegen, lever, nieren, milt, testes, bijnieren, hart en alle organen die macroscopisch waarneembare afwijkingen of veranderingen in omvang vertonen) moeten in een geschikt medium worden bewaard voor eventueel histopathologisch onderzoek. De longen moeten in hun geheel worden verwijderd, gewogen en behandeld worden met een geschikt fixatief om ervoor te zorgen dat de longstructuur intact blijft.

1.6.3.2. Histopathologisch onderzoek

Bij de dieren in de hoge concentratiegroep en bij de dieren in de controlegroep(en) moet histopathologisch onderzoek op de bewaarde organen en weefsels worden verricht. Organen en weefsels die bij het hoogste concentratieniveau door de teststof blijken te zijn beschadigd, moeten in alle groepen met een lagere dosering worden onderzocht. Bij het histopathologisch onderzoek van dieren in satellietgroepen moet speciaal worden gelet op organen en weefsels waar, bij de andere behandelde groepen, effecten blijken te zijn opgetreden.

2. GEGEVENS

De volgende gegevens moeten voor iedere proefgroep in tabellen worden samengevat: het aantal dieren bij het begin van het onderzoek en het aantal dieren waarbij ieder type beschadiging voorkomt.

Alle waargenomen resultaten moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden geëvalueerd. Iedere erkende statistische methode kan hiervoor worden gebruikt.

3. RAPPORTAGE

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, voeding, enzovoort;

—proefomstandigheden:

—Beschrijving van de blootstellingsapparatuur met inbegrip van ontwerp, type, afmetingen, luchtbron, systeem voor het genereren van aerosolen, methode van luchtconditionering, behandeling van de afgevoerde lucht en de wijze waarop de dieren tijdens de proeven in een blootstellingskamer zijn ondergebracht als deze is gebruikt. Er moet een beschrijving worden gegeven van de apparatuur voor het meten van de temperatuur, de vochtigheid en, in voorkomend geval, de stabiliteit van de concentratie of de deeltjesgrootteverdeling van de aerosolen.

—Gegevens betreffende de blootstelling:

—Deze moeten tabellarisch worden gerangschikt en worden voorzien van gemiddelde waarden en een maat voor de variabiliteit (bijvoorbeeld standaardafwijking}. Zij dienen zo mogelijk te omvatten:

a)de luchtdoorstromingssnelheid (luchtdebiet) door de inhalatieapparatuur;

b)temperatuur en vochtigheid van de lucht;

c)nominale concentraties (de totale hoeveelheid teststof die de inhalatieapparatuur wordt binnengeleid, gedeeld door het luchtvolume);

d)aard van het eventuele medium;

e)feitelijke concentraties van de teststof in het ademhalingsgebied van de dieren;

f)massamediaan van de aërodynamische diameter (MMAD) en de geometrische standaardafwijking (GSD);

—gegevens over de toxische reactie per geslacht en concentratie;

—tijdstip gedurende de studie waarop de dood intreedt, of aangeven of de dieren tot het einde van de proef in leven bleven;

—beschrijving van toxische of andere effecten; hoogste niveau waarbij geen effect wordt waargenomen;

—tijdstip waarop een abnormaal verschijnsel wordt waargenomen en het verloop hiervan;

—gegevens over voedselconsumptie en lichaamsgewicht;

—uitgevoerde hematologische proeven en alle resultaten;

—uitgevoerde klinisch-biochemische proeven en alle resultaten;

—bevindingen bij de necropsie;

—een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevindingen;

—waar mogelijk statistische behandeling van de resultaten;

—bespreking van de resultaten;

—interpretatie van de resultaten.

3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE

Zie algemene inleiding deel B (punt D).

4. LITERATUUR

Zie algemene inleiding deel B (punt E).

B.9. TOXICITEIT (DERMAAL) BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN)

1. METHODE

1.1. INLEIDING

Zie algemene inleiding deel B (punt A).

1.2. DEFINITIES

Zie algemene inleiding deel B (punt B).

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Geen.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

De teststof wordt gedurende een periode van 28 dagen dagelijks in geleidelijk stijgende doseringen op de huid van verscheidene groepen proefdieren aangebracht. Er wordt één dosis per groep gebruikt. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het eind van de proef leven, wordt necropsie verricht.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

Geen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.6.1. Voorbereidingen

Voor het onderzoek worden de dieren ten minste 5 dagen onder gelijke huisvestings- en voedingsomstandigheden gehouden als tijdens de proef voorkomen. Gezonde jonge dieren worden op willekeurige wijze voor de behandeling ingedeeld bij testgroepen en controlegroepen. Kort voor de proef wordt het haar op het ruggedeelte van de romp van de proefdieren geknipt; het haar kan ook worden geschoren, maar dit moet dan ongeveer 24 uur voor de proef worden gedaan. Gewoonlijk zal het dier ongeveer om de week opnieuw moeten worden geknipt of geschoren. Bij het knippen of scheren moet erop worden gelet dat de huid niet wordt bekrast. Ten minste 10 % van de lichaamsoppervlakte moet voor het aanbrengen van de teststof worden onthaard. Bij het bepalen van de oppervlakte die moet worden onthaard en de afmetingen van de aan te brengen bedekking moet rekening worden gehouden met het gewicht van het dier. Bij een proef met vaste stoffen, die eventueel tot poeder kunnen worden fijngemaakt, moet de teststof voldoende met water of, zo nodig, met een passend medium worden bevochtigd, zodat de stof goed in contact met de huid komt. Vloeibare teststoffen worden in het algemeen onverdund gebruikt. De teststof wordt gedurende 5 tot 7 dagen per week dagelijks aangebracht.

1.6.2. Proefomstandigheden

1.6.2.1. Proefdieren

Er kan gebruik worden gemaakt van volwassen ratten, konijnen of cavia's. Ook andere diersoorten kunnen worden gebruikt, maar de noodzaak hiervoor moet worden aangetoond.

Bij het begin van de studie mag het gewicht van de dieren die bij de test worden gebruikt niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken.

1.6.2.2. Aantal en geslacht

Voor ieder dosisniveau moeten ten minste tien dieren (vijf wijfjes en vijf mannetjes) met een gezonde huid worden gebruikt. De wijfjes moeten nullipaar zijn en niet zwanger. Indien het de bedoeling is tussentijds dieren te doden, moet het aantal worden verhoogd met het aantal dieren dat volgens plan voor de voltooiing van de studie zal worden gedood. Daarnaast kan een satellietgroep van tien dieren (vijf per geslacht) gedurende 28 dagen worden behandeld met het hoge dosisniveau waarna zij nog gedurende 14 dagen na de behandeling worden geobserveerd om na te gaan of de toxische effecten eventueel verdwijnen, voortduren of pas later tot uiting komen. Tevens wordt een satellietgroep van tien controledieren (vijf per geslacht) gebruikt.

1.6.2.3. Dosisniveau

Ten minste drie dosisniveaus, met een controlegroep of een mediumcontrolegroep, indien een medium wordt gebruikt, zijn vereist. De expositieduur moet ten minste 6 uur per dag bedragen. De teststof moet iedere dag op ongeveer dezelfde tijd worden aangebracht; op vastgestelde tijden (iedere week of twee keer per week) is een correctie vereist om ervoor te zorgen dat het dosisniveau in verhouding tot het lichaamsgewicht van het dier constant blijft. Afgezien van de toediening van de teststof moeten de dieren in de controlegroep op dezelfde wijze als de dieren in de proefgroep worden behandeld. Indien een medium is gebruikt om het doseren te vergemakkelijken moet aan de mediumcontrolegroep op dezelfde wijze als aan de testgroep een dosis van het medium worden toegediend en deze dosis moet even groot zijn als die van de dieren in de groep met het hoogste dosisniveau. Het hoogste dosisniveau van de teststof moet leiden tot toxische effecten, maar er mogen geen of weinig sterfgevallen voorkomen. Bij het laagste dosisniveau mogen geen tekenen van toxiciteit optreden. Indien het blootstellingsniveau van de mens kan worden geschat, moet het laagste niveau deze overschrijden. In het ideale geval treden bij het middelste dosisniveau minimaal waarneembare toxische effecten op. Bij meer dan één tussendosis moet het verschil tussen de dosisniveaus zo groot zijn dat een gradatie in toxische effecten wordt verkregen. In de groep met de laagste dosis en in de tussengroepen, alsmede in de controlegroepen, mogen niet veel sterfgevallen voorkomen, omdat anders een zinvolle evaluatie van de resultaten niet mogelijk is.

Indien toediening van de teststof tot ernstige huidirritatie leidt, moeten de concentraties worden verlaagd, wat vermindering of ontbreken van andere toxische effecten bij het hoge dosisniveau tot gevolg kan hebben. Indien de huid ernstig is beschadigd, kan het zelfs noodzakelijk zijn de studie te beëindigen en een nieuwe studie met lagere concentraties te beginnen.

1.6.2.4. Limiettest

Indien bij een verkennende proef geen toxische effecten optreden bij een dosisniveau van 1 000 mg/kg, of een hoger niveau dat verband houdt met het niveau waaraan de mens, voor zover bekend, kan worden blootgesteld, is het wellicht niet noodzakelijk om verdere proeven te nemen.

1.6.2.5. Observatieperiode

De proefdieren moeten dagelijks worden onderzocht op tekenen van toxiciteit. Het tijdstip waarop de dood intreedt, het tijdstip waarop toxiciteitsverschijnselen voor het eerst zijn waargenomen en het tijdstip waarop zij weer verdwijnen, moeten worden opgetekend.

1.6.3. Uitvoering

De dieren moeten afzonderlijk in kooien worden gehuisvest. De dieren worden gedurende een periode van 28 dagen, zo mogelijk 7 dagen per week, met de teststof behandeld. Dieren in eventuele satellietgroepen voor latere waarnemingen moeten nog 14 dagen zonder behandeling worden gehouden om herstel of voortduren van de toxische effecten te kunnen vaststellen. De blootstellingstijd moet 6 uur per dag bedragen.

De teststof moet gelijkmatig worden aangebracht over een oppervlakte van ongeveer 10 % van de totale lichaamsoppervlakte. Bij zeer toxische stoffen kan de te bedekken oppervlakte kleiner zijn, maar een zo groot mogelijke oppervlakte moet worden bedekt met een zo dun en gelijkmatig mogelijk aangebrachte laag.

De teststof moet gedurende de blootstellingstijd door middel van poreus gaasverband en niet-irriterend plakband in contact met de huid worden gehouden. Het testgedeelte van de huid moet op geschikte wijze verder worden bedekt om het verbandgaas en de teststof op hun plaats te houden en om te verhinderen dat de dieren de teststof via de mond opnemen. Hulpmiddelen om de dieren te fixeren kunnen worden gebruikt om te voorkomen dat de dieren de teststof via de mond opnemen, maar het wordt niet aangeraden de dieren volledig te immobiliseren. Als alternatief kan een „beschermende halskraag” worden gebruikt.

Aan het einde van de blootstellingsperiode wordt de resterende teststof zo mogelijk met water van de huid verwijderd of anders door middel van een andere geschikte reinigingstechniek.

Alle dieren moeten dagelijks worden geobserveerd; tekenen van toxiciteit moeten worden genoteerd met inbegrip van het tijdstip waarop deze voor het eerst optraden en de mate en de duur ervan. Bij het observeren moet aandacht worden besteed aan veranderingen van de huid, de vacht, de ogen en de slijmvliezen, alsmede ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het autonome en het centrale zenuwstelsel, de somatomotorische activiteit en het gedrag. Wekelijks moeten de dieren worden gewogen. Het is eveneens aanbevolen het voerverbruik wekelijks te meten. De dieren moeten regelmatig worden geobserveerd om te voorkomen dat ze voor de studie verloren gaan als gevolg van oorzaken als kannibalisme, autolyse van weefsels of omdat de dieren in verkeerde kooien zijn geplaatst. Na afloop van de onderzoekperiode wordt bij alle overlevende dieren in de behandelde groepen (afgezien van de dieren in de satellietgroep), necropsie verricht. Indien stervende dieren of dieren met hevige nood/ongemak of pijn worden aangetroffen, moeten deze worden verwijderd en op een humane manier worden gedood; bij hen wordt eveneens necropsie verricht.

Na afloop van de studie moeten bij alle dieren, met inbegrip van die uit de controlegroepen, de volgende onderzoekingen worden uitgevoerd:

1)Hematologie waarbij ten minste bepaling van hematocriet en hemoglobinegehalte, erythrocytentelling, totale en gedifferentieerde telling van de leucocyten en meting van stollingsvermogen.

2)Klinisch-biochemische bepalingen in het bloed waarbij ten minste één parameter van de lever- en nierfunctie: serum alanineaminotransferase (vroegere benaming: serum glutaminezuur-pyrodruivenzuur-transaminase (SGPT)), serum aspartaataminotransferase (vroegere benaming: serum glutaminezuur-oxaalazijnzuur-transaminase (SGOT)), ureum, albumine, bloedcreatinine, totaal bilirubine en totaal serumeiwit.

Voor een goede toxicologische evaluatie kan het nodig zijn het onderzoek uit te breiden met: calcium, fosfor chloride, natrium, kalium, glucosegehalte bij nuchtere toestand, analyse van de lipiden, hormonen, zuur/base-evenwicht, methemoglobine en cholinesterase-activiteit.

Zo nodig kan verder klinisch-biochemisch onderzoek worden verricht om het onderzoek van de waargenomen effecten uit te breiden.

1.6.4. Macroscopische necropsie

Bij alle dieren in de studie moet een volledige macroscopische necropsie worden uitgevoerd. Zo spoedig mogelijk na sectie moeten ten minste lever, nieren, bijnieren en testes nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. Organen en weefsels (de normale en de behandelde huid, lever, nieren, milt, testes, bijnieren, hart en alle organen die macroscopisch waarneembare beschadigingen of veranderingen in omvang vertonen moeten in een geschikt medium worden bewaard voor eventueel later histopathologisch onderzoek.

1.6.5. Histopathologisch onderzoek

Bij de dieren in de groep die een hoge dosis heeft ontvangen en bij die in de controlegroep moet histopathologisch onderzoek op de bewaarde organen en weefsels worden verricht. Organen en weefsels die bij het hoogste doseringsniveau door de teststof blijken te zijn beschadigd, moeten in alle groepen met een lagere dosering worden onderzocht. Bij het histopathologisch onderzoek van de dieren in de satellietgroep moet speciaal worden gelet op de organen en weefsels waar, bij de andere behandelde groepen, effecten blijken te zijn opgetreden.

2. GEGEVENS

De volgende gegevens moeten voor iedere proefgroep in tabellen worden samengevat: het aantal dieren bij het begin van het onderzoek en het aantal dieren waarbij ieder type beschadiging voorkomt.

Alle waargenomen resultaten moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden geëvalueerd. Iedere erkende statistische methode kan hiervoor worden gebruikt.

3. RAPPORTAGE

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, dieet, enzovoort;

—proefomstandigheden (met inbegrip van het soort verband: occlusief of niet-occlusief);

—dosisniveaus (met het eventueel medium) en concentraties;

—waar mogelijk het hoogste dosisniveau waarbij geen effect optreedt;

—gegevens over de toxische reactie naar geslacht en dosis;

—tijdstip gedurende de studie waarop de dood intreedt, of aangeven of dieren tot het eind van de proef bleven leven;

—toxische of andere effecten;

—tijdstip waarop een abnormaal verschijnsel werd waargenomen en het verloop hiervan;

—gegevens over voedsel en lichaamsgewicht;

—uitgevoerde hematologische proeven en alle resultaten;

—uitgevoerde klinisch-biochemische proeven en alle resultaten;

—bevindingen bij de necropsie;

—een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevindingen;

—waar mogelijk statistische behandeling van de resultaten;

—bespreking van de resultaten;

—interpretatie van de resultaten.

3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE

Zie algemene inleiding deel B (punt D).

4. LITERATUUR

Zie algemene inleiding deel B (punt E).

B.10. MUTAGENITEIT — IN-VITRO TEST OP CHROMOSOOMAFWIJKINGEN IN ZOOGDIERCELLEN

1. METHODE

Deze methode is overgenomen van TG 473 van de OESO: In-vitro test op chromosoomafwijkingen in zoogdiercellen (1997).

1.1. INLEIDING

De in-vitrotest op chromosoomafwijkingen is bedoeld om te bepalen welke stoffen structurele chromosoomafwijkingen bij gekweekte menselijke cellen veroorzaken (1)(2)(3). Er zijn twee soorten structurele afwijkingen: het chromosoomtype en het chromatidetype. De meeste chemische mutagenen veroorzaken afwijkingen van het chromatidetype, maar ook het chromosoomtype komt voor. Een toename van polyploïdie kan erop wijzen dat een chemische stof numerieke afwijkingen kan veroorzaken. Deze methode is echter niet opgezet om numerieke afwijkingen te meten en wordt normaal gesproken niet voor dat doel gebruikt. Chromosoommutaties en soortgelijke voorvallen veroorzaken veel genetische ziekten bij de mens en het lijkt er sterk op dat chromosoommutaties en soortgelijke voorvallen die veranderingen in oncogenen en tumorsuppressorgenen van somatische cellen veroorzaken, betrokken zijn bij de inductie van kanker bij de mens en bij proefdieren.

Bij de in-vitrotest op chromosoomafwijkingen kunnen culturen van permanente cellijnen, celstammen of primaire celculturen worden gebruikt. De gebruikte cellen worden geselecteerd op basis van het groeivermogen in een cultuur, de stabiliteit van het karyotype, het aantal chromosomen, de verscheidenheid van de chromosomen en de frequentie van spontane chromosoomafwijkingen.

Bij in vitro uitgevoerde tests moet er meestal een exogene metabole activeringsbron worden gebruikt. Dit metabole activeringssysteem kan de omstandigheden in een zoogdiercel in vivo niet volledig nabootsen. Er moet goed op worden gelet dat omstandigheden die kunnen leiden tot positieve resultaten die niet het gevolg zijn van intrinsieke mutageniteit maar door veranderingen in de pH of de osmolaliteit of een sterke cytotoxiciteit worden veroorzaakt, worden vermeden (4)(5).

Deze test wordt gebruikt voor de screening op mogelijke mutagenen en carcinogenen voor zoogdieren. Veel stoffen die positief op deze test reageren, zijn carcinogeen voor zoogdieren, maar er is geen absolute correlatie tussen deze test en carcinogeniteit. De correlatie is afhankelijk van de chemische klasse en het lijkt er steeds meer op dat er carcinogenen zijn die met deze test worden gesignaleerd omdat ze blijkbaar via andere mechanismen dan directe DNA-beschadiging werken.

Zie ook de algemene inleiding van deel B.

1.2. DEFINITIES

Afwijking van het chromatidetype: structurele chromosoombeschadiging waarbij breuken in individuele chromatiden ontstaan, eventueel gevolgd door recombinatie.

Afwijking van het chromosoomtype: structurele chromosoombeschadiging waarbij breuken in beide chromatiden op dezelfde plaats ontstaan, eventueel gevolgd door recombinatie.

Endoreduplicatie: een proces waarbij de kern na een S-fase met DNA-replicatie niet tot mitose overgaat, maar opnieuw een S-fase begint. Het resultaat is chromosomen met 4, 8, 16, ... chromatiden.

Hiaat: een achromatische beschadiging die kleiner is dan de breedte van één chromatide en waarbij de fout in de uitlijning van de chromatiden minimaal is.

Mitotische index: de verhouding tussen het aantal cellen in de metafase en het totale aantal cellen in een populatie: deze index geeft een indicatie van de snelheid waarmee deze populatie zich voortplant.

Numerieke afwijking: een verandering in het aantal chromosomen ten opzichte van het normale aantal dat kenmerkend is voor de gebruikte cellen.

Polyploïdie: het voorkomen van een ander veelvoud van het haploïde aantal chromosomen (n) dan het diploïde aantal (d.w.z. 3n, 4n, enz.).

Structurele afwijking: een verandering in de chromosoomstructuur die bij microscopisch onderzoek tijdens de metafase van de celdeling kan worden waargenomen in de vorm van deleties, fragmenten en intra- of interchromosomale uitwisselingen.

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

Celculturen worden zowel met als zonder metabole activering aan de teststof blootgesteld. Op vooraf bepaalde tijdstippen na de blootstelling van de celculturen aan de teststof worden ze met een metafasestopper (bv. Colcemid® of colchicine) behandeld, geoogst en gekleurd en worden de cellen in de metafase microscopisch onderzocht op de aanwezigheid van chromosoomafwijkingen.

1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.4.1. Voorbereiding

1.4.1.1. Cellen

Er kunnen verschillende soorten cellijnen, stammen of primaire celculturen worden gebruikt, waaronder ook menselijke cellen (bv. fibroblasten van Chinese hamsters of menselijke of van andere zoogdieren afkomstige perifere bloedlymfocyten).

1.4.1.2. Media en kweekomstandigheden

Er moet worden gezorgd voor geschikte kweekmedia en incubatieomstandigheden (kweekvat, CO2-concentratie, temperatuur en vochtigheid) voor de culturen. Permanente cellijnen en stammen moeten geregeld worden gecontroleerd om na te gaan of het modale aantal chromosomen stabiel is en er geen besmetting met mycoplasma heeft plaatsgevonden; indien dit laatste het geval is, mogen ze niet worden gebruikt. De normale tijd voor de celcyclus bij de gebruikte cellen en kweekomstandigheden moet bekend zijn.

1.4.1.3. Bereiding van de culturen

Permanente cellijnen en stammen: cellen uit stamculturen worden met een zodanige dichtheid in een kweekmedium geënt dat de kolonies voor het oogsten niet aaneengroeien, en bij 37 oC geïncubeerd.

Lymphocyten: met een stollingsremmer (bv. heparine) behandeld volledig bloed of geïsoleerde lymfocyten van gezonde proefpersonen worden toegevoegd aan het kweekmedium met een mitogeen (bv. fytohemagglutinine) en bij 37 oC geïncubeerd.

1.4.1.4. Metabole activering

De cellen dienen zowel met als zonder een geschikt metabool activeringssysteem aan de teststof te worden blootgesteld. Het meest gebruikte systeem is een post-mitochondriale fractie aangevuld met een cofactor (S9), verkregen uit de lever van knaagdieren die zijn behandeld met enzym-inducerende stoffen als Aroclor 1254 (6)(7)(8)(9) of een mengsel van fenobarbiton en ß-naftoflavon (10)(11)(12).

De post-mitochondriale fractie wordt meestal gebruikt bij een concentratie van 1-10 % (v/v) in het uiteindelijke medium. De omstandigheden voor het gebruik van een metabool activeringssysteem kunnen afhankelijk zijn van de aard van de geteste chemische verbinding. In sommige gevallen zal wellicht meer dan een concentratie van de post-mitochondriale fractie moeten worden gebruikt.

Een aantal ontwikkelingen, bijvoorbeeld de opbouw van genetisch aangepaste cellijnen waarin specifieke activeringsenzymen tot expressie komen, kan endogene activering mogelijk maken. Voor de keuze van de gebruikte cellijnen moet een wetenschappelijke verantwoording worden gegeven (bv. aan de hand van de relevantie van het cytochroom P450-isoenzym voor het metabolisme van de teststof).

1.4.1.5. Teststof/Bereiding

Vaste teststoffen moeten in geschikte oplosmiddelen of media worden opgelost of gesuspendeerd en eventueel vóór de behandeling van de cellen worden verdund. Vloeibare teststoffen kunnen rechtstreeks aan het testsysteem worden toegediend en/of vóór de behandeling worden verdund. Tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aanvaardbaar is, moeten verse bereidingen van de teststof worden gebruikt.

1.4.2. Testomstandigheden

1.4.2.1. Oplosmiddel/Medium

Chemische reacties tussen het oplosmiddel/medium en de teststof moeten uitgesloten zijn en het oplosmiddel/medium moet verenigbaar zijn met het overleven van de cellen en de S9-activiteit. Als er andere dan gangbare oplosmiddelen/media worden gebruikt, moeten gegevens worden verstrekt waaruit blijkt dat ze geen problemen opleveren. Aanbevolen wordt waar mogelijk eerst te bezien of een waterig oplosmiddel/medium kan worden gebruikt. Wanneer stoffen worden getest die in water instabiel zijn, moeten de gebruikte organische oplosmiddelen watervrij zijn. Water kan door toevoeging van een moleculaire zeef worden verwijderd.

1.4.2.2. Blootstellingsconcentraties

Bij de bepaling van de hoogste concentratie moet onder andere rekening worden gehouden met de cytotoxiciteit, de oplosbaarheid in het testsysteem en veranderingen in de pH of de osmolaliteit.

De cytotoxiciteit moet met en zonder metabole activering in het hoofdexperiment worden bepaald aan de hand van adequate indicaties omtrent de integriteit en de groei van de cellen, zoals de mate van confluentie. het aantal levensvatbare cellen of de mitotische index. Het kan nuttig zijn vooraf een apart experiment uit te voeren om de cytotoxiciteit en de oplosbaarheid te bepalen.

Er moeten ten minste drie analyseerbare concentraties worden gebruikt. Wanneer er cytotoxiciteit optreedt, moeten deze concentraties een interval van de maximale tot geen of vrijwel geen toxiciteit bestrijken; dit betekent meestal dat de concentraties niet meer dan een factor 2 tot √10 uit elkaar mogen liggen. Bij het oogsten moet de hoogste concentratie een significante verlaging van de mate van confluentie, het aantal cellen of de mitotische index veroorzaken (voor alle parameters meer dan 50 %). De mitotische index is slechts een indirecte maat voor de cytotoxische/cytostatische effecten en is afhankelijk van het tijdstip na de behandeling. De mitotische index is echter aanvaardbaar voor culturen in suspensie, waarbij andere metingen van de toxiciteit omslachtig en onpraktisch kunnen zijn. Informatie over de kinetiek van de celcyclus, zoals de gemiddelde generatietijd (GGT), kan als aanvulling worden gebruikt. De GGT is echter een algeheel gemiddelde waaruit niet altijd blijkt of er achterblijvende deelpopulaties zijn en zelfs een geringe stijging van de GGT kan samengaan met een zeer aanzienlijke vertraging op het moment waarop de hoeveelheid afwijkingen maximaal is.

Bij stoffen met een betrekkelijk geringe cytotoxiciteit moet de maximale concentratie 5 μl/ml, 5 mg/ml of 0,01 M (de laagste van deze drie) zijn.

Bij betrekkelijk onoplosbare stoffen die bij lagere concentraties dan de oplosbaarheidsgrens niet toxisch zijn, moet de hoogste dosis een concentratie boven de oplosbaarheidsgrens in het uiteindelijke kweekmedium aan het eind van de behandelingsperiode zijn. In sommige gevallen (bv. wanneer de toxiciteit alleen optreedt bij hogere concentraties dan de oplosbaarheidsgrens, is het raadzaam bij meer dan één concentratie met zichtbaar neerslag te testen. Het kan nuttig zijn de oplosbaarheid aan het begin en het eind van de behandeling te bepalen, aangezien de oplosbaarheid tijdens de blootstelling in het testsysteem door de aanwezigheid van bijvoorbeeld cellen, S9 of serum kan veranderen. Onoplosbaarheid kan met het blote oog worden geconstateerd. Het neerslag mag niet storen bij het scoren.

1.4.2.3. Negatieve en positieve controles

Bij elk experiment moeten tegelijkertijd positieve en negatieve (oplosmiddel of medium) controles worden uitgevoerd, zowel met als zonder metabole activering. Wanneer metabole activering wordt gebruikt, moet de voor de positieve controle gebruikte chemische stof activering vereisen om een mutagene reactie te veroorzaken.

Voor de positieve controles moet een bekend klastogeen worden gebruikt, waarvan op het blootstellingsniveau een reproduceerbare en detecteerbare stijging ten opzichte van het achtergrondniveau kan worden verwacht om de gevoeligheid van het testsysteem aan te tonen.

De concentraties van de positieve controle moeten zodanig worden gekozen dat de effecten duidelijk zijn maar de gecodeerde objectglaasjes niet onmiddellijk als zodanig herkenbaar zijn. Als positieve controle kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt:



Metabole activering

Stof

CAS-nr.

Einecs-nr.

Zonder exogene metabole activering

Methylmethaansulfonaat

66-27-3

200-625-0

Ethylmethaansulfonaat

62-50-0

200-536-7

Ethylnitrosoureum

759-73-9

212-072-2

Mitomycine C

50-07-7

200-008-6

4-Nitrochinoline-N-oxide

56-57-5

200-281-1

Met exogene metabole activering

Benzo[a]pyreen

50-32-8

200-028-5

Cyclofosfamide

Cyclofosfamide monohydraat

50-18-0

6055-19-2

200-015-4

Ook andere geschikte stoffen kunnen als positieve controle worden gebruikt. Waar mogelijk dient het gebruik van stoffen uit een verwante chemische klasse als positieve controle te worden overwogen.

Voor elk oogsttijdstip dienen negatieve controles in het experiment te worden opgenomen, waaraan uitsluitend het oplosmiddel of het medium wordt toegediend en die verder op dezelfde manier als de culturen met teststof worden behandeld. Daarnaast moeten er ook controles worden gebruikt waaraan niets wordt toegediend, tenzij in het verleden reeds is aangetoond dat het gekozen oplosmiddel geen schadelijke of mutagene effecten veroorzaakt.

1.4.3. Uitvoering

1.4.3.1. Behandeling met de teststof

Delende cellen worden zowel met als zonder metabool activeringssysteem met de teststof behandeld. De behandeling van lymfocyten moet ongeveer 48 uur na de mitogene stimulering beginnen.

1.4.3.2.Normaal gesproken moeten voor elke concentratie twee culturen worden gebruikt en voor culturen met negatieve/oplosmiddelcontrole wordt dit sterk aanbevolen. Wanneer aan de hand van gegevens uit het verleden kan worden aangetoond dat de verschillen tussen duploculturen minimaal zijn (13)(14), kan het gebruik van één cultuur voor elke concentratie aanvaardbaar zijn.

Bij het testen van gassen of vluchtige stoffen moet een daarvoor geschikte methode worden gevolgd, bijvoorbeeld in een gesloten kweekvat (15)(16).

1.4.3.3. Oogsttijdstippen

Bij het eerste experiment moeten de cellen zowel met als zonder metabole activering gedurende drie tot zes uur aan de teststof worden blootgesteld en wordt op een tijdstip dat overeenkomt met ongeveer 1,5-maal de normale lengte van een celcyclus na het begin van de behandeling bemonsterd (12). Als op deze wijze zowel met als zonder activering negatieve resultaten worden verkregen, wordt een nieuw experiment zonder activering uitgevoerd, waarbij de behandeling wordt voortgezet totdat op een tijdstip dat overeenkomt met ongeveer 1,5-maal de normale lengte van een celcyclus wordt bemonsterd. Voor sommige stoffen gaat de detectie beter bij een behandelings/bemonsteringstijd van meer dan 1,5-maal de lengte van de celcyclus. Negatieve resultaten met metabole activering moeten per geval worden bevestigd. Wanneer bevestiging van negatieve resultaten niet nodig wordt geacht, moet hiervoor een motivering worden gegeven.

1.4.3.4. Chromosoompreparaten

De celculturen worden meestal gedurende één tot drie uur vóór het oogsten behandeld met Colcemid® of colchicine. Elke celcultuur wordt afzonderlijk geoogst en behandeld voor het maken van chromosoompreparaten. Dit houdt in dat de cellen een hypotone behandeling krijgen, gevolgd door fixatie en kleuring.

1.4.3.5. Analyse

Alle objectglaasjes, ook die van de positieve en negatieve controles, worden vóór de microscopische analyse onafhankelijk gecodeerd. Aangezien bij de fixatie vaak een gedeelte van de metafasecellen breekt, waarbij chromosomen verloren gaan, moeten de gescoorde cellen voor alle celtypes het modale aantal ± 2 centromeren bevatten. Per concentratie en controle moeten minimaal 200 goed gespreide metafasen worden gescoord, indien van toepassing gelijkelijk verdeeld over de duplobepalingen. Wanneer een groot aantal afwijkingen wordt geconstateerd, kan dit aantal worden verlaagd.

Hoewel de test bedoeld is om structurele chromosoomafwijkingen op te sporen, is het belangrijk dat bij waarneming van polyploïdie en endoreduplicatie ook deze verschijnselen worden geregistreerd.

2. GEGEVENS

2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN

Aangezien de cel bij dit experiment de eenheid is, moet het percentage cellen met één of meer structurele chromosoomafwijkingen worden bepaald. Er moet een overzicht worden gegeven van de verschillende soorten structurele chromosoomafwijkingen met de aantallen en de frequentie waarmee ze in de behandelde en controleculturen voorkomen. Hiaten worden apart geregistreerd en gerapporteerd, maar worden meestal niet in de totale frequentie van de afwijkingen opgenomen.

Gelijktijdige metingen van de cytotoxiciteit voor alle behandelde en negatieve controleculturen bij de hoofdexperimenten dienen ook te worden geregistreerd.

De gegevens moeten voor elke cultuur apart worden verstrekt. Daarnaast moet er een overzicht van alle gegevens in tabelvorm worden samengesteld.

Een duidelijk positieve reactie behoeft niet te worden bevestigd. Bij onduidelijke resultaten moet nader onderzoek worden gedaan, bij voorkeur onder gewijzigde experimentele omstandigheden. De noodzakelijke bevestiging van negatieve resultaten is al onder punt 1.4.3.3. besproken. Bij vervolgexperimenten dient wijziging van parameters te worden overwogen om de bepaling uit te breiden tot een breder scala van omstandigheden. Parameters die voor wijziging in aanmerking komen zijn bijvoorbeeld de concentratie-intervallen en de omstandigheden bij metabole activering.

2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN

Er zijn verschillende criteria om tot een positief resultaat te besluiten, zoals een concentratieafhankelijke of een reproduceerbare stijging van het aantal cellen met chromosoomafwijkingen. In eerste instantie moet naar de biologische relevantie van de resultaten worden gekeken. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de testresultaten kunnen statistische methoden worden gebruikt (3)(13). Statistische significantie mag echter niet de enige bepalende factor voor een positieve reactie zijn.

Een stijging van het aantal polyploïde cellen kan erop wijzen dat de teststof in staat is mitotische processen te remmen en numerieke chromosoomafwijkingen te induceren. Een stijging van het aantal cellen met endoreduplicatie van chromosomen kan erop wijzen dat de teststof in staat is de voortgang van de celcyclus te remmen (17)(18).

Indien de resultaten voor een teststof niet aan bovenstaande criteria voldoen, wordt de stof in dit systeem als niet-mutageen beschouwd.

Hoewel de meeste experimenten duidelijk positieve of negatieve resultaten zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de effecten van de teststof in uitzonderingsgevallen onmogelijk zijn. De resultaten kunnen, hoe vaak het experiment ook wordt herhaald, onduidelijk of twijfelachtig blijven.

Positieve resultaten bij de in-vitrotest op chromosoomafwijkingen wijzen erop dat de teststof in gekweekte somatische zoogdiercellen structurele chromosoomafwijkingen induceert. Negatieve resultaten wijzen erop dat de stof onder de testomstandigheden in gekweekte somatische zoogdiercellen geen chromosoomafwijkingen induceert.

3. RAPPORTAGE

TESTVERSLAG

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

Oplosmiddel/Medium:

—motivering voor de keuze van het medium;

—oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/medium, indien bekend.

Cellen:

—aard en herkomst van de cellen;

—kenmerken van het karyotype en bruikbaarheid van het gebruikte celtype;

—afwezigheid van mycoplasma, indien van toepassing;

—informatie over de lengte van de celcyclus;

—geslacht van de bloeddonors, volledig bloed of geïsoleerde lymfocyten, gebruikt mitogeen;

—aantal overentingen, indien van toepassing;

—methoden om de celcultuur in leven te houden, indien van toepassing;

—modaal aantal chromosomen.

Testomstandigheden:

—naam van de metafasestopper, gebruikte concentratie en blootstellingsduur;

—achtergrond voor de keuze van de concentraties en het aantal culturen, bijvoorbeeld gegevens over de cytotoxiciteit en beperkte oplosbaarheid, indien beschikbaar;

—samenstelling van het medium en CO2-concentratie, indien van toepassing;

—concentratie van de teststof;

—toegevoegd volume medium en teststof;

—incubatietemperatuur;

—incubatietijd;

—duur van de behandeling;

—celdichtheid bij het enten, indien van toepassing;

—aard en samenstelling van het metabole activeringssysteem. met inbegrip van aanvaardbaarheidscriteria;

—positieve en negatieve controles;

—methoden voor de bereiding van de objectglaasjes;

—criteria voor het scoren van afwijkingen:

—aantal geanalyseerde metafases;

—methoden voor de meting van de toxiciteit;

—criteria om te bepalen of het resultaat positief, negatief of onduidelijk is.

Resultaten:

—tekenen van toxiciteit, bijvoorbeeld de mate van confluentie, gegevens over de celcyclus, het aantal cellen en de mitotische index;

—neerslagverschijnselen:

—gegevens over de pH en de osmolaliteit van het behandelingsmedium, indien bepaald;

—definitie voor afwijkingen, met inbegrip van hiaten;

—het aantal cellen met chromosoomafwijkingen en de aard van de chromosoomafwijkingen, afzonderlijk vermeld voor elke behandelde en controlecultuur;

—veranderingen in de ploïdie, indien waargenomen;

—indien mogelijk het verband tussen dosis en respons;

—eventuele statistische analyses;

—gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde negatieve (oplosmiddel/medium) en positieve controles;

—gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve (oplosmiddel/medium) en positieve controles met vermelding van spreiding, gemiddelde en standaardafwijking.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies.

4. REFERENTIES

(1)Evans, H.J. (1976). Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Prin-ciples and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press. New York and Lon-don, pp. 1-29.

(2)Ishidate, M.Jr. and Sofuni, T. (1985). The in Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427-432.

(3)Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C Colman. S., Brown, B., Cannon, C, Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, M.A., Anderson, G. and Zeiger, E. (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl.10), pp. 1-175.

(4)Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate. M.Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr. B.C. (1991). Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from)CPEMC Task Group 9. Mutation Res.. 257, pp. 147-204.

(5)Morita. T., Nagaki, T.. Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, pp. 297-305.

(6)Ames, B.N., McCann. J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, pp. 347-364.

(7)Maron, D.M. and Ames. B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, pp. 17 3-215.

(8)Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, pp. 83-90.

(9)Matsuoka, A., Hayashi, M and Ishidate, M. Jr. (1979). Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66, pp. 277-290.

(10)Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe. C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay,].M. and Wolf, R.C. (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, pp. 175-177.

(11)Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds) In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

(12)Galloway, S.M., Aardema. M.J.. Ishidate, M.Jr., Ivett, J.L., Kirkland, DJ., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994). Report from Working Group on In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312, pp. 241-261.

(13)Richardson, C, Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D.O. and Phillips, B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.

(14)Soper, K.A. and Galloway, S.M, (1994). Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, pp. 139-149.

(15)Krahn. D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103.

(16)Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels of Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis. 5, pp. 795-801.

(17)Locke-Huhle. C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, pp. 403-413.

(18)Huang, Y., Change, C. and Trosko. J.E. (1983). Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.

B.11. MUTAGENITEIT — IN-VIVO TEST OP CHROMOSOOMAFWIJKINGEN IN BEENMERGCELLEN VAN ZOOGDIEREN

1. METHODE

Deze methode is overgenomen van TG 475 van de OESO: Test op chromosoomafwijkingen in beenmergcellen van zoogdieren (1997).

1.1. INLEIDING

De in-vivotest op chromosoomafwijkingen bij zoogdieren wordt gebruikt om te bepalen welke stoffen structurele chromosoomafwijkingen bij beenmergcellen van dieren, meestal knaagdieren, veroorzaken (1) (2) (3) (4). Er zijn twee soorten structurele afwijkingen: het chromosoomtype en het chromatidetype. Een toename van polyploïdie kan erop wijzen dat een chemische stof numerieke afwijkingen kan veroorzaken. De meeste chemische mutagenen veroorzaken afwijkingen van het chromatidetype, maar ook het chromosoomtype komt voor. Chromosoommutaties en soortgelijke voorvallen veroorzaken veel genetische ziekten bij de mens en het lijkt er sterk op dat chromosoommutaties en soortgelijke voorvallen die veranderingen in oncogenen en tumorsuppressorgenen veroorzaken, betrokken zijn bij de inductie van kanker bij de mens en bij proefdieren.

Voor deze test worden meestal knaagdieren gebruikt. Het doelweefsel is het beenmerg aangezien dit een sterk doorbloed weefsel is en een populatie snel delende cellen bevat die gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd en verwerkt. De methode is niet geschikt voor andere diersoorten en doelweefsels.

Deze test op chromosoomafwijkingen is bijzonder geschikt om het gevaar van mutagene effecten te evalueren, aangezien rekening kan worden gehouden met factoren die samenhangen met het metabolisme in vivo, de farmacokinetiek en de DNA-herstelsynthese, hoewel deze aspecten van soort tot soort en van weefsel tot weefsel kunnen verschillen. Een in-vivotest is ook geschikt om een in vitro gesignaleerd mutageen effect nader te onderzoeken.

Als er aanwijzingen zijn dat de teststof of een reactieve metaboliet daarvan niet in het doelweefsel terechtkomt, is deze test niet geschikt.

Zie ook de algemene inleiding van deel B.

1.2. DEFINITIES

Afwijking van het chromatidetype: structurele chromosoombeschadiging waarbij breuken in individuele chromatiden ontstaan, eventueel gevolgd door recombinatie.

Afwijking van het chromosoomtype: structurele chromosoombeschadiging waarbij breuken in beide chromatiden op dezelfde plaats ontstaan, eventueel gevolgd door recombinatie.

Endoreduplicatie: een proces waarbij de kern na een S-fase met DNA-replicatie niet tot mitose overgaat, maar opnieuw een S-fase begint. Het resultaat is chromosomen met 4, 8, 16, ... chromatiden.

Hiaat: een achromatische beschadiging die kleiner is dan de breedte van één chromatide en waarbij de fout in de uitlijning van de chromatiden minimaal is.

Numerieke afwijking: een verandering in het aantal chromosomen ten opzichte van het normale aantal dat kenmerkend is voor de gebruikte cellen.

Polyploïdie: het voorkomen van een ander veelvoud van het haploïde aantal chromosomen (n) dan het diploïde aantal (d.w.z. 3n, 4n. enz.).

Structurele afwijking: een verandering in de chromosoomstructuur die bij microscopisch onderzoek tijdens de metafase van de celdeling kan worden waargenomen in de vorm van deleties, fragmenten en intra- of interchromosomale uitwisselingen.

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

De dieren worden langs een geschikte weg aan de teststof blootgesteld en op geschikte tijdstippen na de behandeling gedood. Voordat de dieren worden gedood, worden ze behandeld met een metafasestopper (bv. colchicine of Colcemid®). Vervolgens worden chromosoompreparaten van de beenmergcellen gemaakt, die worden gekleurd; de cellen in de metafase worden geanalyseerd op chromosoomafwijkingen.

1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.4.1. Voorbereiding

1.4.1.1. Keuze van de diersoort

Meestal worden ratten, muizen of Chinese hamsters gebruikt, maar in principe komt elke geschikte zoogdiersoort in aanmerking. Er dient gebruik te worden gemaakt van jonge gezonde volwassen dieren van in het laboratorium gangbare stammen. Bij het begin van de studie moet het gewichtsverschil tussen de dieren zo klein mogelijk zijn en mag dit maximaal ± 20 % van het gemiddelde gewicht van elk geslacht bedragen.

1.4.1.2. Huisvesting en voeding

De in de algemene inleiding van deel B genoemde algemene omstandigheden worden aangehouden, maar voor de luchtvochtigheid wordt gestreefd naar 50-60 %.

1.4.1.3. Voorbereiding van de dieren

Gezonde jonge volwassen dieren worden aselect ingedeeld in de behandelde en controlegroepen. De kooien moeten zodanig worden geplaatst dat mogelijke effecten daarvan tot een minimum worden beperkt. De dieren krijgen een unieke identificatie. Ze krijgen minimaal vijf dagen de tijd om in het laboratorium te acclimatiseren.

1.4.1.4. Bereiding van de doseringen

Vaste teststoffen moeten in geschikte oplosmiddelen of media worden opgelost of gesuspendeerd en eventueel vóór de toediening aan de dieren worden verdund. Vloeibare teststoffen kunnen rechtstreeks worden toegediend of vóór de toediening worden verdund. Tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aanvaardbaar is, moeten verse bereidingen van de teststof worden gebruikt.

1.4.2. Testomstandigheden

1.4.2.1. Oplosmiddel/Medium

Het oplosmiddel/medium mag bij de gebruikte dosisniveaus geen toxische effecten veroorzaken en chemische reacties met de teststof moeten uitgesloten zijn. Als er andere dan gangbare oplosmiddelen/media worden gebruikt, moeten gegevens worden verstrekt waaruit blijkt dat ze geen problemen opleveren. Aanbevolen wordt waar mogelijk eerst te bezien of een waterig oplosmiddel/medium kan worden gebruikt.

1.4.2.2. Controles

Bij elk experiment moeten tegelijkertijd positieve en negatieve (oplosmiddel/medium) controles voor elk geslacht worden uitgevoerd. Afgezien van de behandeling met de teststof moeten de dieren in de controlegroepen op identieke wijze worden behandeld als de dieren in de andere groepen.

Voor de positieve controles moet een stof worden gebruikt die in vivo structurele afwijkingen veroorzaakt op een blootstellingsniveau waarbij een detecteerbare stijging ten opzichte van het achtergrondniveau kan worden verwacht. De doseringen van de positieve controles moeten zodanig worden gekozen dat de effecten duidelijk zijn maar de gecodeerde objectglaasjes niet onmiddellijk ais zodanig herkenbaar zijn. Het is aanvaardbaar de positieve controle langs een andere weg toe te dienen dan de teststof en slechts op één tijdstip te bemonsteren. Waar mogelijk kan het gebruik van stoffen uit een verwante chemische klasse als positieve controle worden overwogen. Als positieve controle kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt:



Stof

CAS-nr.

Einecs-nr.

Ethylmethaansulfonaat

62-50-0

200-536-7

Ethylnitrosoureum

759-73-9

212-072-2

Mitomycine C

50-07-7

200-008-6

Cyclofosfamide

Cyclofosfamide monohydraat

50-18-0

605 5-19-2

200-015-4

Triethyleenmelamine

51-18-3

200-083-5

Voor elk bemonsteringstijdstip dienen negatieve controles in het experiment te worden opgenomen, waaraan uitsluitend het oplosmiddel of het medium wordt toegediend en die verder op dezelfde manier als de andere groepen worden behandeld, tenzij uit in het verleden uitgevoerde controles aanvaardbare gegevens beschikbaar zijn over de spreiding over de dieren en de frequentie van cellen met chromosoomafwijkingen. Als voor de negatieve controles één bemonsteringstijdstip wordt gebruikt, kan hiervoor het beste het eerste bemonsteringstijdstip worden gekozen. Daarnaast moeten er ook onbehandelde controles worden gebruikt, tenzij in het verleden of in de literatuur reeds is aangetoond dat het gekozen oplosmiddel of medium geen schadelijke of mutagene effecten veroorzaakt.

1.5. UITVOERING

1.5.1. Aantal en geslacht van de dieren

Elke behandelde en controlegroep moet minimaal vijf analyseerbare dieren per geslacht bevatten. Als er bij de uitvoering van de studie gegevens uit studies bij dezelfde soort en met dezelfde blootstellingsweg beschikbaar zijn waaruit blijkt dat er geen significante verschillen in toxiciteit tussen de geslachten zijn, is het voldoende de test bij één geslacht uit te voeren. Wanneer de blootstelling aan een chemische stof bij de mens door het geslacht wordt bepaald, zoals bijvoorbeeld bij sommige geneesmiddelen het geval is, moet de test bij dieren van het desbetreffende geslacht worden uitgevoerd.

1.5.2. Behandelingsschema

De teststof wordt bij voorkeur in één dosis toegediend. De dosis kan eventueel worden gesplitst, waarbij de twee porties op dezelfde dag met een interval van niet meer dan enkele uren worden toegediend, om de toediening van een groot volume te vergemakkelijken. Voor een ander doseringsschema moet een wetenschappelijke motivering worden gegeven.

De monsters worden op twee aparte tijdstippen na de behandeling op één dag genomen. Voor knaagdieren ligt het eerste bemonsteringstijdstip op 1,5 maal de normale lengte van een celcyclus (deze cyclus duurt meestal 12 tot 18 uur) na de behandeling. Aangezien de voor de opname en het metabolisme van de teststof vereiste tijd en de effecten op de kinetiek van de celcyclus gevolgen kunnen hebben voor het optimale tijdstip om chromosoomafwijkingen te detecteren, verdient het aanbeveling 24 uur na het eerste bemonsteringstijdstip opnieuw te bemonsteren. Indien het doseringsschema meer dan één dag beslaat, moet één bemonsteringstijdstip op 1,5 maal de normale lengte van een celcyclus na de laatste toediening worden gebruikt.

Voordat de dieren worden gedood, worden ze intraperitoneaal geïnjecteerd met een adequate dosis metafasestopper (bv. Colcemid® of colchicine). De dieren worden na een adequate pauze bemonsterd. Voor muizen moet er ongeveer drie tot vijf uur worden gewacht en voor Chinese hamsters ongeveer vier tot vijf uur. De cellen worden uit het beenmerg gehaald en op chromosoomafwijkingen geanalyseerd.

1.5.3. Dosisniveaus

Als er een oriënterend onderzoek wordt uitgevoerd omdat er geen bruikbare gegevens over de dosering beschikbaar zijn, moet dit in hetzelfde laboratorium gebeuren met dezelfde soort, dezelfde stam, hetzelfde geslacht en hetzelfde behandelingsschema als bij het hoofdonderzoek (5). Als er sprake is van toxiciteit, worden er voor het eerste bemonsteringstijdstip drie dosisniveaus gebruikt. Deze dosisniveaus moeten een interval van de maximale tot geen of vrijwel geen toxiciteit bestrijken. Op het latere bemonsteringstijdstip behoeft alleen de hoogste dosis te worden gebruikt. De hoogste dosis wordt gedefinieerd als de dosis die zodanige toxiciteitsverschijnselen veroorzaakt dat er bij hogere doses met hetzelfde doseringsschema waarschijnlijk sterfte zal optreden. Stoften met een specifieke biologische activiteit bij lage niet-toxische doses (zoals hormonen en mitogenen) kunnen een uitzondering vormen op deze criteria om de dosering te bepalen en moeten per geval worden beoordeeld. De hoogste dosis kan ook worden gedefinieerd als een dosis die enigerlei aanwijzing van toxiciteit voor het beenmerg oplevert (bv. een daling van de mitotische index met meer dan 50 %).

1.5.4. Limiettest

Als een test met één dosis van minimaal 2 000 mg/kg lichaamsgewicht, in één keer of in twee porties op dezelfde dag toegediend, geen waarneembare toxische effecten veroorzaakt en op basis van gegevens over stoffen met een verwante structuur geen genotoxiciteit te verwachten valt, zal het wellicht niet nodig zijn een volledig onderzoek met drie dosisniveaus uit te voeren. Voor studies met een langere duur is de limietdosis 2 000mg/kg lichaamsgewicht/dag bij toediening gedurende maximaal 14 dagen en 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag bij toediening gedurende meer dan 14 dagen. Op grond van gegevens omtrent de verwachte blootstelling van de mens kan het gebruik van een hoger dosisniveau bij de limiettest nodig worden geacht.

1.5.5. Toediening van de doses

De teststof wordt meestal met behulp van een maagsonde of een geschikte intubatiecanule of door intraperitoneale injectie toegediend. Ook andere toedieningswegen kunnen aanvaardbaar zijn, als daarvoor een motivering kan worden gegeven. Het maximale volume vloeistof dat in één keer met een sonde of injectie kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het proefdier. Het volume mag niet groter zijn dan 2ml/100g lichaamsgewicht. Voor het gebruik van grotere volumes moet een motivering worden gegeven. Behalve bij prikkelende of bijtende stoffen, die in hogere concentraties meestal hevigere effecten veroorzaken, moeten volumeverschillen tot een minimum worden beperkt door de concentratie aan te passen, zodat op alle dosisniveaus hetzelfde volume kan worden gebruikt.

1.5.6. Chromosoompreparaten

Onmiddellijk nadat het dier is gedood wordt beenmerg verwijderd, in een hypotone oplossing gebracht en gefixeerd. De cellen worden vervolgens op objectglaasjes uitgesmeerd en gekleurd.

1.5.7. Analyse

Als maat voor de cytotoxiciteit wordt in ten minste 1 000 cellen per dier voor alle behandelde dieren (ook de positieve controles) en onbehandelde dieren voor de negatieve controle de mitotische index bepaald.

Voor elk dier worden minimaal 100 cellen geanalyseerd. Wanneer een groot aantal afwijkingen wordt geconstateerd, kan dit aantal worden verlaagd. Alle objectglaasjes, ook die van de positieve en negatieve controles, worden vóór de microscopische analyse onafhankelijk gecodeerd. Aangezien bij de bereiding van de objectglaasjes vaak een gedeelte van de metafasecellen breekt, waarbij chromosomen verloren gaan, moeten de gescoorde cellen 2n ± 2 centromeren bevatten.

2. GEGEVENS

2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN

De gegevens moeten voor elk dier apart in tabelvorm worden verstrekt. De eenheid bij dit experiment is het dier. Voor elk dier moet het aantal gescoorde cellen, het aantal afwijkingen per cel en het percentage cellen met een of meer structurele chromosoomafwijkingen worden bepaald. Er moet een overzicht worden gegeven van de verschillende soorten structurele chromosoomafwijkingen met de aantallen en de frequentie waarmee ze in de behandelde en controlegroepen voorkomen. Hiaten worden apart geregistreerd en gerapporteerd maar meestal niet in de totale frequentie van de afwijkingen opgenomen. Als er geen aanwijzingen zijn voor verschillen in reactie tussen de geslachten, kunnen de gegevens van beide geslachten voor de statistische analyse worden gecombineerd.

2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN

Er zijn verschillende criteria om tot een positief resultaat te besluiten, zoals een dosisafhankelijke stijging van het relatieve aantal cellen met chromosoomafwijkingen of een duidelijke stijging van het aantal cellen met afwijkingen in één dosisgroep bij één bemonsteringstijd. In eerste instantie moet naar de biologische relevantie van de resultaten worden gekeken. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de testresultaten kunnen statistische methoden worden gebruikt (6). Statistische significantie mag echter niet de enige bepalende factor voor een positieve reactie zijn. Bij onduidelijke resultaten moet nader onderzoek worden gedaan, bij voorkeur onder gewijzigde experimentele omstandigheden.

Een toename van polyploïdie kan erop wijzen dat de teststof in staat is numerieke chromosoomafwijkingen te induceren. Een toename van endoreduplicatie kan erop wijzen dat de teststof in staat is de voortgang van de celcyclus te remmen (7)(8).

Indien de resultaten voor een teststof niet aan bovenstaande criteria voldoen, wordt de stof bij deze test als niet-mutageen beschouwd.

Hoewel de meeste experimenten duidelijk positieve of negatieve resultaten zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de effecten van de teststof in uitzonderingsgevallen onmogelijk zijn. De resultaten kunnen, hoe vaak het experiment ook wordt uitgevoerd, onduidelijk of twijfelachtig blijven.

Positieve resultaten bij de in-vivotest op chromosoomafwijkingen wijzen erop dat een stof in het beenmerg van de geteste soort chromosoomafwijkingen induceert. Negatieve resultaten wijzen erop dat de stof onder de testomstandigheden in het beenmerg van de geteste soort geen chromosoomafwijkingen induceert.

De waarschijnlijkheid dat de teststof of de metabolieten daarvan in de grote bloedsomloop of specifiek het doelweefsel terechtkomen (systemische toxiciteit), dient te worden besproken.

3. RAPPORTAGE

3.1. TESTVERSLAG

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

Oplosmiddel/Medium:

—motivering voor de keuze van het medium;

—oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/medium, indien bekend.

Proefdieren:

—gebruikte soort/stam:

—aantal, leeftijd en geslacht van de dieren:

—herkomst, huisvesting, voeding, enz.;

—het gewicht van elk dier aan het begin van de test, met vermelding van de spreiding, het gemiddelde en de standaardafwijking van het lichaamsgewicht voor elke groep.

Testomstandigheden:

—positieve en negatieve (oplosmiddel/medium) controles:

—gegevens uit het oriënterend onderzoek, indien dit is uitgevoerd:

—achtergrond voor de keuze van de dosisniveaus;

—gegevens over de bereiding van de teststof;

—gegevens over de toediening van de teststof;

—achtergrond voor de keuze van de toedieningsweg;

—methoden om na te gaan of de teststof in de grote bloedsomloop of het doelweefsel is terechtgekomen, indien van toepassing;

—omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/drinkwater (in ppm) in de dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing;

—gegevens over de kwaliteit van het voer en het drinkwater;

—een gedetailleerde beschrijving van het behandelings- en bemonsteringsschema;

—methoden voor de meting van de toxiciteit;

—naam van de metafasestopper, gebruikte concentratie en blootstellingsduur;

—methoden voor de bereiding van de objectglaasjes;

—criteria voor het scoren van afwijkingen;

—aantal geanalyseerde cellen per dier;

—criteria om te bepalen of het resultaat positief, negatief of onduidelijk is.

Resultaten:

—tekenen van toxiciteit;

—mitotische index;

—aard en aantal van de afwijkingen, afzonderlijk vermeld voor elk dier;

—totaal aantal afwijkingen per groep, met vermelding van het gemiddelde en de standaardafwijking;

—aantal cellen met afwijkingen per groep, met vermelding van het gemiddelde en de standaardafwijking;

—veranderingen in de ploïdie, indien waargenomen;

—indien mogelijk het verband tussen dosis en respons;

—eventuele statistische analyses;

—gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde negatieve controles;

—gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve controles, met vermelding van spreiding, gemiddelde en standaardafwijking;

—gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde positieve controles.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies.

4. REFERENTIES

(1)Adler, I.D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J.M. Parry (Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., pp. 275-306.

(2)Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189, pp. 157-165.

(3)Richold, M., Chandley, A., Ashby,)., Gatehouse, D.G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990). In In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.

(4)Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Simada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). Report from the Working Group on the in Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test. Mutation Res., 312, pp. 305-312.

(5)Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe. J., Esdaile, DJ., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, pp. 31 3-319.

(6)Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese. R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In \'ivo Cytogenetic Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part. III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University Press. Cambridge. pp. 184-232.

(7)Locke-Huhle, C. (198 3). Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res. 119, pp. 403-413.

(8)Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res.. 43, pp. 1362-1364.

B.12. MUTAGENITEIT — IN-VIVO MICRONUCLEUSTEST BIJ ERYTROCYTEN VAN ZOOGDIEREN

1. METHODE

Deze methode is overgenomen van TG 474 van de OESO: Micronuleustest bij erytrocyten van zoogdieren (1997).

1.1. INLEIDING

De in-vivo micronuleustest bij zoogdieren wordt gebruikt om na te gaan of de teststof schade toebrengt aan de chromosomen of het mitotisch apparaat van erytroblasten door de analyse van erytrocyten die worden verkregen uit het beenmerg en/of de perifere bloedcellen van dieren, meestal knaagdieren.

De micronuleustest is bedoeld om stoften te signaleren die cytogenetische schade veroorzaken waarbij micro-nuclei ontstaan met achtergebleven chromosoomfragmenten of volledige chromosomen.

Wanneer een erytroblast uit het beenmerg zich ontwikkelt tot een polychromatische erytrocyt, wordt de hoofdkern uitgestoten: wanneer een micronucleus is ontstaan, kan deze in het overigens kernloze cytoplasma achterblijven. Omdat deze cellen geen hoofdkern bevatten, zijn de micronuclei gemakkelijker zichtbaar te maken. Een stijging van de frequentie waarmee bij behandelde dieren polychromatische erytrocyten met micronuclei worden aangetroffen, wijst op chromosoombeschadiging.

Voor deze test wordt meestal het beenmerg van knaagdieren gebruikt, aangezien in dit weefsel polychromatische erytrocyten worden gevormd. Het is ook aanvaardbaar het aantal onrijpe (polychromatische) erytrocyten met micronuclei in perifeer bloed te bepalen bij soorten waarvan is aangetoond dat de milt niet in staat is erytrocyten met micronuclei op te ruimen of dat de gevoeligheid om stoffen die structurele of numerieke chromosoomafwijkingen veroorzaken te detecteren afdoende is. Micronuclei kunnen aan de hand van een aantal criteria worden onderscheiden, bijvoorbeeld op grond van de aan- of afwezigheid van een kinetochoor-of centromeer-DNA in de micronuclei. Het belangrijkste eindpunt is de frequentie van onrijpe (polychromatische) erytrocyten met micronuclei. Het aantal rijpe (normochromatische) erytrocyten in het perifere bloed met micronuclei, bepaald bij een bekend aantal rijpe erytrocyten, kan ook als eindpunt van de bepaling worden gebruikt wanneer de dieren gedurende ten minste vier weken ononderbroken worden behandeld.

Deze in-vivo micronucleustest bij zoogdieren is bijzonder geschikt om het gevaar van mutagene effecten te evalueren, aangezien rekening kan worden gehouden met factoren die samenhangen met het metabolisme in vivo, de farmacokinetiek en de DNA-herstelsynthese, hoewel deze aspecten van soort tot soort, van weefsel tot weefsel en voor de verschillende genetische eindpunten kunnen verschillen. Een in-vivo bepaling is ook geschikt om een in vitro gesignaleerd mutageen effect nader te onderzoeken.

Als er aanwijzingen zijn dat de teststof of een reactieve metaboliet daarvan niet in het doelweefsel terechtkomt, is deze test niet geschikt.

Zie ook de algemene inleiding van deel B.

1.2. DEFINITIES

Centromeer (kinetochoor): het deel of de delen van een chromosoom waar tijdens de celdeling de spoeldraden aan vastzitten, zodat de verplaatsing van de dochterchromosomen naar de polen van de dochtercellen regelmatig kan verlopen.

Micronucleus: een kleine kern die buiten en naast de hoofdkern van cellen tijdens de telofase van de mitose (meiose) ontstaat door achtergebleven chromosoomfragmenten of volledige chromosomen.

Normochromatische erytrocyt: een rijpe erytrocyt zonder ribosomen die van onrijpe polychromatische erytrocyten kan worden onderscheiden door de selectieve kleuring van ribosomen.

Polychromatische erytrocyt: een onrijpe erytrocyt in een tussentijdse ontwikkelingsfase die nog ribosomen bevat en derhalve van rijpe normochromatische erytrocyten kan worden onderscheiden door de selectieve kleuring van ribosomen.

1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

De dieren worden langs een geschikte weg aan de teststof blootgesteld. Als beenmerg wordt gebruikt, worden de dieren op geschikte tijdstippen na de behandeling gedood, wordt het beenmerg verwijderd en worden er preparaten gemaakt die worden gekleurd (l)(2)(3)(4)(5)(6)(7). Wanneer perifeer bloed wordt gebruikt, wordt op geschikte tijdstippen na de behandeling bloed afgenomen en worden er uitstrijkpreparaten gemaakt die worden gekleurd (4)(8)(9)(10). Bij studies met perifeer bloed moet er zo weinig mogelijk tijd verstrijken tussen de laatste blootstelling en het oogsten van de cellen. De preparaten worden onderzocht op de aanwezigheid van micronuclei.

1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.4.1. Voorbereiding

1.4.1.1. Keuze van de diersoort

Als beenmerg wordt gebruikt, worden muizen of ratten aanbevolen, maar in principe komt elke geschikte zoogdiersoort in aanmerking. Wanneer perifeer bloed wordt gebruikt, worden muizen aanbevolen. In principe komt elke geschikte zoogdiersoort echter in aanmerking, mits het een soort is waarvan de milt niet in staat is erytrocyten met micronuclei op te ruimen of een soort waarvan is aangetoond dat de gevoeligheid om stoffen die structurele of numerieke chromosoomafwijkingen veroorzaken te detecteren afdoende is. Er dient gebruik te worden gemaakt van jonge gezonde dieren van in het laboratorium gangbare stammen. Bij het begin van de studie moet het gewichtsverschil tussen de dieren zo klein mogelijk zijn en mag dit maximaal ± 20 % van het gemiddelde gewicht van elk geslacht bedragen.

1.4.1.2. Huisvesting en voeding

De in de algemene inleiding van deel B genoemde algemene omstandigheden worden aangehouden, maar voor de luchtvochtigheid wordt gestreefd naar 50-60 %.

1.4.1.3. Voorbereiding van de dieren

Gezonde jonge volwassen dieren worden aselect ingedeeld in de behandelde en controlegroepen. De dieren krijgen een unieke identificatie. Ze krijgen minimaal vijf dagen de tijd om in het laboratorium te acclimatiseren. De kooien moeten zodanig worden geplaatst dat mogelijke effecten daarvan tot een minimum worden beperkt.

1.4.1.4. Bereiding van de doseringen

Vaste teststoffen moeten in geschikte oplosmiddelen of media worden opgelost of gesuspendeerd en eventueel vóór de toediening aan de dieren worden verdund. Vloeibare teststoffen kunnen rechtstreeks worden toegediend of vóór de toediening worden verdund. Tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aanvaardbaar is, moeten verse bereidingen van de teststof worden gebruikt.

1.4.2. Testomstandigheden

1.4.2.1. Oplosmiddel/Medium

Het oplosmiddel/medium mag bij de gebruikte dosisniveaus geen toxische effecten veroorzaken en chemische reacties met de teststof moeten uitgesloten zijn. Als er andere dan gangbare oplosmiddelen/media worden gebruikt, moeten referentiegegevens worden verstrekt waaruit blijkt dat ze geen problemen opleveren. Aanbevolen wordt waar mogelijk eerst te bezien of een waterig oplosmiddel/medium kan worden gebruikt.

1.4.2.2. Controles

Bij elk experiment moeten tegelijkertijd positieve en negatieve (oplosmiddel/medium) controles voor elk geslacht worden uitgevoerd. Afgezien van de behandeling met de teststof moeten de dieren in de controlegroepen op identieke wijze worden behandeld als de dieren in de andere groepen.

Voor de positieve controles moet een stof worden gebruikt die in-vivo micronuclei veroorzaakt op een blootstellingsniveau waarbij een detecteerbare stijging ten opzichte van het achtergrondniveau kan worden verwacht. De doseringen van de positieve controles moeten zodanig worden gekozen dat de effecten duidelijk zijn maar de gecodeerde objectglaasjes niet onmiddellijk als zodanig herkenbaar zijn. Het is aanvaardbaar de positieve controle langs een andere weg toe te dienen dan de teststof en slechts op één tijdstip te bemonsteren. Waar mogelijk kan bovendien het gebruik van stoffen uit een verwante chemische klasse als positieve controle worden overwogen. Als positieve controle kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt:



Stof

CAS-nr.

Einecs-nr.

Ethylmethaansulfonaat

62-50-0

200-536-7

N-Ethyl-N-nitrosoureum

759-73-9

212-072-2

Mitomycine C

50-07-7

200-008-6

Cyclofosfamide

Cyclofosfamide monohydraat

50-18-0

60 5 5-19-2

200-015-4

Triethyleenmelamine

51-18-3

200-083-5

Voor elk bemonsteringstijdstip dienen negatieve controles in het experiment te worden opgenomen, waaraan uitsluitend het oplosmiddel of het medium wordt toegediend en die verder op dezelfde manier als de andere groepen worden behandeld, tenzij uit in het verleden uitgevoerde controles aanvaardbare gegevens beschikbaar zijn over de spreiding over de dieren en de frequentie van cellen met micronuclei. Als voor de negatieve controles één bemonsteringstijdstip wordt gebruikt, kan hiervoor het beste het eerste bemonsteringstijdstip worden gekozen. Daarnaast moeten er ook onbehandelde controles worden gebruikt, tenzij in het verleden of in de literatuur reeds is aangetoond dat het gekozen oplosmiddel of medium geen schadelijke of mutagene effecten veroorzaakt.

Als perifeer bloed wordt gebruikt, kan een monster dat vóór de behandeling wordt genomen ook aanvaardbaar zijn als gelijktijdige negatieve controle, maar alleen wanneer het gaat om een korte studie met perifeer bloed (bv. één tot drie behandelingen) en het resultaat binnen het verwachte interval door de in het verleden uitgevoerde controle ligt.

1.5. UITVOERING

1.5.1. Aantal en geslacht van de dieren

Elke behandelde en controlegroep moet minimaal vijf analyseerbare dieren per geslacht bevatten (11). Als er bij de uitvoering van de studie gegevens uit studies bij dezelfde soort en met dezelfde blootstellingsweg beschikbaar zijn waaruit blijkt dat er geen significante verschillen in toxiciteit tussen de geslachten zijn, is het voldoende de test bij één geslacht uit te voeren. Wanneer de blootstelling aan een chemische stof bij de mens door het geslacht wordt bepaald, zoals bijvoorbeeld bij sommige geneesmiddelen het geval is, moet de test bij dieren van het desbetreffende geslacht worden uitgevoerd.

1.5.2. Behandelingsschema

Er kan geen standaardbehandelingsschema (d.w.z. één, twee of meer behandelingen met een interval van 24 uur) worden aanbevolen. De monsters van verlengde doseringsschema's zijn aanvaardbaar, mits een positief effect voor deze studie is aangetoond of, voor een negatieve studie, mits toxiciteit is aangetoond of de limietdosis is gebruikt, en de toediening tot het bemonsteringstijdstip is voortgezet. De dosis kan eventueel worden gesplitst, waarbij de twee porties op dezelfde dag met een interval van niet meer dan enkele uren worden toegediend, om de toediening van een groot volume te vergemakkelijken.

De test kan op twee manieren worden uitgevoerd:

a)De dieren worden eenmaal met de teststof behandeld. Beenmergmonsters worden ten minste tweemaal genomen, de eerste keer niet eerder dan 24 uur na de behandeling en de laatste keer uiterlijk 48 uur na de behandeling, met een afdoende interval tussen de monsters. Voor het gebruik van een bemonsteringstijdstip binnen 24 uur na de behandeling moet een motivering worden gegeven. Monsters van perifeer bloed worden ten minste tweemaal genomen, de eerste keer niet eerder dan 36 uur na de behandeling, met een afdoende interval na het eerste monster, en de laatste keer uiterlijk 72 uur na de behandeling. Wanneer op één bemonsteringstijdstip een positieve reactie wordt gesignaleerd, behoeven er geen verdere monsters meer te worden genomen.

b)Als twee of meer dagelijkse behandelingen worden gebruikt (bv. twee of meer behandelingen met een interval van 24 uur), moet de bemonstering voor het beenmerg eenmaal gebeuren tussen 18 en 24 uur na de laatste behandeling en voor het perifere bloed eenmaal tussen 36 en 48 uur na de laatste behandeling (12).

Indien dit nuttig is, kunnen daarnaast ook andere bemonsteringstijdstippen worden gebruikt.

1.5.3. Dosisniveaus

Als er een oriënterend onderzoek wordt uitgevoerd omdat er geen bruikbare gegevens over de dosering beschikbaar zijn, moet dit in hetzelfde laboratorium gebeuren met dezelfde soort, dezelfde stam, hetzelfde geslacht en hetzelfde behandelingsschema als bij het hoofdonderzoek (13). Als er sprake is van toxiciteit, worden er voor het eerste bemonsteringstijdstip drie dosisniveaus gebruikt. Deze dosisniveaus moeten een interval van de maximale tot geen of vrijwel geen toxiciteit bestrijken. Op het latere bemonsteringstijdstip behoeft alleen de hoogste dosis te worden gebruikt. De hoogste dosis wordt gedefinieerd als de dosis die zodanige toxiciteitsverschijnselen veroorzaakt dat er bij hogere doses met hetzelfde doseringsschema waarschijnlijk sterfte zal optreden. Stoffen met een specifieke biologische activiteit bij lage niet-toxische doses (zoals hormonen en mitogenen) kunnen een uitzondering vormen op deze criteria om de dosering te bepalen en moeten per geval worden beoordeeld. De hoogste dosis kan ook worden gedefinieerd als een dosis die enigerlei aanwijzing van toxiciteit voor het beenmerg oplevert (bv. een daling van de verhouding tussen het aantal onrijpe erytrocyten en het totale aantal erytrocyten in het beenmerg of het perifere bloed).

1.5.4. Limiettest

Als een test met één dosis van minimaal 2 000 mg/kg lichaamsgewicht, in één keer of in twee porties op dezelfde dag toegediend, geen waarneembare toxische effecten veroorzaakt en op basis van gegevens over stoffen met een verwante structuur geen genotoxiciteit te verwachten valt, zal het wellicht niet nodig zijn een volledig onderzoek met drie dosisniveaus uit te voeren. Voor studies met een langere duur is de limietdosis 2 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag bij toediening gedurende maximaal 14 dagen en 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag bij toediening gedurende meer dan 14 dagen. Op grond van gegevens omtrent de verwachte blootstelling van de mens kan het gebruik van een hoger dosisniveau bij de limiettest nodig worden geacht.

1.5.5. Toediening van de doses

De reststof wordt meestal met behulp van een maagsonde of een geschikte intubatiecanule of door intraperitoneale injectie toegediend. Ook andere toedieningswegen kunnen aanvaardbaar zijn, als daarvoor een motivering kan worden gegeven. Het maximale volume vloeistof dat in één keer met een sonde of injectie kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het proefdier. Het volume mag niet groter zijn dan 2 ml/100 g lichaamsgewicht. Voor het gebruik van grotere volumes moet een motivering worden gegeven. Behalve bij prikkelende of bijtende stoffen, die in hogere concentraties meestal heviger effecten veroorzaken, moeten volumeverschillen tot een minimum worden beperkt door de concentratie aan te passen, zodat op alle dosisniveaus hetzelfde volume kan worden gebruikt.

1.5.6. Beenmerg/bloedpreparaten

De beenmergcellen worden meestal volgens gangbare methoden uit het dijbeen of scheenbeen van pas gedode dieren verwijderd, geprepareerd en gekleurd. Perifeer bloed wordt uit de staartader of een ander geschikt bloedvat afgenomen. De bloedcellen worden onmiddellijk supravitaal gekleurd (8)(9)(10) of er wordt een uitstrijkpreparaat gemaakt dat vervolgens wordt gekleurd. Door het gebruik van een DNA-specifieke kleurstof (bv. acridine oranje (14) of Hoechst 33258 plus pyronine-Y (15)) kunnen sommige artefacten die zich bij het gebruik van niet voor DNA specifieke kleurstoffen kunnen voordoen, worden voorkomen. Dit neemt niet weg dat ook klassieke kleurstoffen (zoals Giemsa) kunnen worden gebruikt. Ook andere systemen (zoals cellulosekolommen om cellen die een kern bevatten te verwijderen (16)) kunnen worden gebruikt, mits is aangetoond dat deze methoden geschikt zijn voor micronucleuspreparaten in het laboratorium.

1.5.7. Analyse

Voor elk dier wordt de verhouding tussen het aantal onrijpe erytrocyten en het totale aantal (onrijpe + rijpe) erytrocyten bepaald door in totaal voor het beenmerg ten minste 200 erytrocyten en voor het perifere bloed ten minste 1 000 erytrocyten te tellen (17). Alle objectglaasjes, ook die van de negatieve en positieve controles, worden vóór de microscopische analyse onafhankelijk gecodeerd. Voor de bepaling van de frequentie waarmee onrijpe erytrocyten met micronuclei voorkomen, worden ten minste 2 000 rijpe erytrocyten per dier gescoord. Aanvullende informatie kan worden verkregen door rijpe erytrocyten op micronuclei te scoren. Bij de analyse van de objectglaasjes mag de verhouding tussen het aantal onrijpe erytrocyten en het totale aantal erytrocyten niet lager dan 20 % van de controlewaarde zijn. Wanneer de dieren onafgebroken gedurende ten minste vier weken zijn behandeld, kunnen ook ten minste 2 000 rijpe erytrocyten per dier op het voorkomen van micronuclei worden gescoord. Geautomatiseerde analysesystemen (beeldanalyse en celsuspensiedoorstroomcytometrie) zijn aanvaardbaar als alternatief voor handmatige beoordeling, indien ze afdoende zijn gemotiveerd en gevalideerd.

2. GEGEVENS

2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN

De gegevens moeten voor elke dier apart in tabelvorm worden verstrekt. De eenheid bij dit experiment is het dier. Voor elk onderzocht dier worden het aantal gescoorde onrijpe erytrocyten, het aantal onrijpe erytrocyten met micronuclei en het aantal onrijpe erytrocyten op het totale aantal apart vermeld. Wanneer de dieren onafgebroken gedurende ten minste vier weken zijn behandeld, moeten de gegevens over rijpe erytrocyten ook worden vermeld als deze zijn verzameld. Voor elk dier worden de verhouding tussen het aantal onrijpe erytrocyten en het totale aantal erytrocyten en, indien dit zinnig wordt geacht, het percentage van de erytrocyten met micronuclei vermeld. Als er geen aanwijzingen zijn voor verschillen in reactie tussen de geslachten, kunnen de gegevens van beide geslachten voor de statistische analyse worden gecombineerd.

2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN

Er zijn verschillende criteria om tot een positief resultaat te besluiten, zoals een dosisafhankelijke stijging van het aantal cellen met micronuclei of een duidelijke stijging van het aantal cellen met micronuclei in één dosis-groep bij één bemonsteringstijd. In eerste instantie moet naar de biologische relevantie van de resultaten worden gekeken. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de testresultaten kunnen statistische methoden worden gebruikt (18)(19). Statistische significantie mag echter niet de enige bepalende factor voor een positieve reactie zijn. Bij onduidelijke resultaten moet nader onderzoek worden gedaan, bij voorkeur onder gewijzigde experimentele omstandigheden.

Indien de resultaten voor een teststof niet aan bovenstaande criteria voldoen, wordt de stof bij deze test als niet-mutageen beschouwd.

Hoewel de meeste experimenten duidelijk positieve of negatieve resultaten zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de effecten van de teststof in uitzonderingsgevallen onmogelijk zijn. De resultaten kunnen, hoe vaak het experiment ook wordt herhaald, onduidelijk of twijfelachtig blijven.

Positieve resultaten bij de micronucleustest wijzen erop dat de stof micronuclei induceert die ontstaan door chromosoombeschadigingen of beschadiging van het mitotisch apparaat in de erytroblasten van de geteste soort. Negatieve resultaten wijzen erop dat de stof onder de testomstandigheden geen micronuclei in de onrijpe erytrocyten van de geteste soort veroorzaakt.

De waarschijnlijkheid dat de teststof of de metabolieten daarvan in de grote bloedsomloop of specifiek het doelweefsel terechtkomen (systemische toxiciteit), dient te worden besproken.

3. RAPPORTAGE

TESTVERSLAG

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

Oplosmiddel/Medium:

—motivering voor de keuze van het medium;

—oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/medium, indien bekend.

Proefdieren:

—gebruikte soort/stam;

—aantal, leeftijd en geslacht van de dieren:

—herkomst, huisvesting, voeding enz.:

—het gewicht van elk dier aan het begin van de test, met vermelding van de spreiding, het gemiddelde en de standaardafwijking van het lichaamsgewicht voor elke groep.

Testomstandigheden:

—gegevens over positieve en negatieve (oplosmiddel/medium) controles;

—gegevens uit het oriënterend onderzoek, indien dit is uitgevoerd:

—achtergrond voor de keuze van de dosisniveaus;

—gegevens over de bereiding van de teststof;

—gegevens over de toediening van de reststof;

—achtergrond voor de keuze van de toedieningsweg;

—methoden om na te gaan of de teststof in de grote bloedsomloop of het doelweefsel is terechtgekomen, indien van toepassing;

—omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/drinkwater (in ppm) in de dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing;

—gegevens over de kwaliteit van het voer en het drinkwater;

—een gedetailleerde beschrijving van het behandelings- en bemonsteringsschema;

—methoden voor de bereiding van de objectglaasjes;

—methoden voor de meting van de toxiciteit;

—criteria voor het scoren van onrijpe erytrocyten met micronuclei;

—aantal geanalyseerde cellen per dier;

—criteria om te bepalen of het resultaat positief, negatief of onduidelijk is.

Resultaten:

—tekenen van toxiciteit;

—verhouding tussen het aantal onrijpe erytrocyten en het totale aantal erytrocyten;

—aantal onrijpe erytrocyten met micronuclei, afzonderlijk vermeld voor elk dier;

—gemiddelde ± standaardafwijking van het aantal onrijpe erytrocyten met micronuclei per groep;

—indien mogelijk het verband tussen dosis en respons;

—statistische analyses en gevolgde methodes;

—gegevens over tegelijkertijd en in het verleden uitgevoerde negatieve controles;

—gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde positieve controles.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies.

4. REFERENTIES

(1)Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190.

(2)Schmid, W. (1975). The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9-15.

(3)Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res. 123, pp. 61-118.

(4)Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and Heddle, J.A. (1990). The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res.. 239, pp. 29-80.

(5)MacGregor, J.T., Schlegel, R., Choy, W.N., and Wehr, C.M. (1983). Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. In: „Developments in Science and Practice of Toxicology”, Hd. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558.

(6)MacGregor, J.T., Heddle. J.A. Hite. M., Margolin, G.H.. Ramel, C, Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D. (1987). Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res. 189, pp. 103-122.

(7)MacGregor, J.T., Wehr, CM., Henika, P.R., and Shelby, M.E. (1990). The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522.

(8)Hayashi, M., Morita, T.. Kodama. Y., Sofuni. T. and Ishidate, M. Jr. (1990). The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coates Slides. Mutation Res., 245, pp. 245-249.

(9)The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., 278, pp. 83-98.

(10)The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, pp. 153-159.

(11)Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr.F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res., 312, pp. 293-304.

(12)Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, pp. 313-319.

(13)Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, pp. 313-319.

(14)Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res., 120, pp. 241-247.

(15)MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y., Mutation Res., 120, pp. 269-275.

(16)Romagna, F. and Staniforth, C.D. (1989). The automated bone marrow micronucleus test. Mutation Res.. 213, pp. 91-104.

(17)Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995). Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, pp. 97-99.

(18)Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assay. In: D.J. Kirkland (lid.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York. Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.

(19)Lovell, D.P., Anderson. D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.

B.13/14.MUTAGENITEIT — TERUGMUTATIETEST MET BACTERIËN

1. METHODE

Deze methode is overgenomen van TG 471 van de OESO: Terugmutatietest met bacteriën (1997).

1.1. INLEIDING

Bij de terugmutatietest met bacteriën worden aminozuurafhankelijke stammen van Salmonella typhimurium en Eschenchia coli gebruikt voor de detectie van puntmutaties, waarbij vervanging, toevoeging of deletie van een of enkele DNA-basenparen optreedt (1)(2)(3). Deze terugmutatietest met bacteriën is gebaseerd op het beginsel dat mutaties worden gedetecteerd die ertoe leiden dat in de teststammen aanwezige mutaties en daarmee de functionele capaciteit van de bacteriën om een essentieel aminozuur te synthetiseren worden hersteld. Deze teruggemuteerde bacteriën worden zichtbaar doordat ze kunnen groeien zonder het aminozuur dat de ouderstam nodig heeft.

Puntmutaties veroorzaken veel genetische ziekten bij de mens en het lijkt er sterk op dat puntmutaties in oncogenen en tumorsuppressorgenen van somatische cellen betrokken zijn bij het ontstaan van tumoren bij de mens en bij proefdieren. De terugmutatietest met bacteriën is snel, goedkoop en betrekkelijk gemakkelijk uit te voeren. Veel van de teststammen hebben verschillende kenmerken waardoor ze gevoeliger zijn voor de detectie van mutaties, zoals reactieve DNA-sequenties op de terugmutatieplaatsen, een verhoogde permeabiliteit van de cel voor grote moleculen en de afwezigheid van DNA-herstelsystemen of de stimulering van fout-gevoelige DNA-herstelprocessen. De specificiteit van de teststammen kan enige nuttige informatie opleveren over de aard van de mutaties die door genotoxische stoffen worden geïnduceerd. Er zijn zeer veel gegevens beschikbaar over de resultaten van de terugmutatietest met bacteriën voor een grote verscheidenheid van structuren en er zijn betrouware mehtodologieën ontwikkeld voor het testen van chemische stoffen met uiteenlopende fysisch-chemische eigenschappen, waaronder ook vluchtige stoffen.

Zie ook de algemene inleiding van deel B.

1.2. DEFINITIES

Terugmutatietest bij Salmonella typhimurium of Escherichia coli: een test voor de detectie van mutaties in een aminozuurafhankelijke stam (respectievelijk histidine of tryptofaan), waarbij een stam ontstaat die onafhankelijk is van een externe aminozuurbron.

Mutageen met basenpaarvervanging: een stof die een wijziging van een base in het DNA veroorzaakt. Bij een terugmutatietest kan dit op de plaats van de oorspronkelijke mutatie of op een andere plaats in het bacteriële genoom gebeuren.

Mutageen met leesraamverschuiving: een stof die invoeging of deletie van een of meer basenparen in het DNA veroorzaakt, waardoor het leesraam in het RNA wijzigt.

1.3. TOELICHTING

Voor de terugmutatietest met bacteriën worden prokaryote cellen gebruikt, die in bijvoorbeeld opname, metabolisme, chromosoomstructuur en DNA-herstelprocessen van zoogdiercellen verschillen. Bij in vitro uitgevoerde tests moet er meestal een exogene metabole activeringsbron worden gebruikt. Dit metabole activeringssysteem kan de omstandigheden in een zoogdiercel in vivo niet volledig nabootsen. De test levert dan ook geen directe informatie op over de potentiële mutagene en carcinogene werking van een stof bij zoogdieren.

De terugmutatietest met bacteriën wordt meestal gebruikt als een eerste screening voor een genotoxische werking en met name de inductie van puntmutaties. Op basis van een groot aantal gegevens is gebleken dat veel stoffen die bij deze test positief reageren, ook bij andere tests een mutagene werking vertonen. Er zijn voorbeelden van mutagene stoffen die met deze test niet worden gesignaleerd; dit kan wellicht worden toegeschreven aan de specifieke aard van het gedetecteerde eindpunt, verschillen in metabole activering of verschillen in biologische beschikbaarheid. Anderzijds kunnen factoren die de gevoeligheid van de terugmutatietest met bacteriën bevorderen, leiden tot een te hoge inschatting van de mutagene werking.

De terugmutatietest met bacteriën zal wellicht niet geschikt zijn voor de beoordeling van bepaalde klassen chemische stoffen zoals sterk bactericide verbindingen (bv. bepaalde antibiotica) en stoffen waarvan vermoed wordt (of bekend is) dat ze specifiek het replicatiesysteem van zoogdiercellen storen (bv. bepaalde topoisomeraseremmers en bepaalde nucleosideanalogen). In deze gevallen zullen mutatietests met zoogdiercellen wellicht geschikter zijn.

Hoewel veel stoffen die positief op deze test reageren, ook carcinogeen voor zoogdieren zijn, is de correlatie niet absoluut. De correlatie is afhankelijk van de chemische klasse en er zijn carcinogenen die niet met deze test worden gesignaleerd omdat ze via andere niet-genotoxische mechanismen werken of via mechanismen die in bacteriecellen ontbreken.

1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

Suspensies van bacteriecellen worden zowel met als zonder een exogeen metabool activeringssysteem aan de teststof blootgesteld. Bij de methode met geïntegreerde voedingsbodem worden deze suspensies met een topagar vermengd en direct op minimaal medium uitgeplaat. Bij de preïncubatiemethode wordt het behandelde mengsel geïncubeerd en vervolgens met een topagar vermengd voordat het op minimaal medium wordt uitgeplaat. Bij beide technieken worden na twee of drie dagen incuberen de terugmutantkolonies geteld en wordt dit aantal vergeleken met het aantal spontane terugmutantkolonies op controleplaten met oplosmiddel.

Er zijn verschillende procedures voor de uitvoering van de terugmutatietest met bacteriën beschreven. Het meest gebruikt worden de methode met geïntegreerde voedingsbodem (1)(2)(3)(4), de preïncubatiemethode (2)(3)(5)(6)(7)(8), de fluctuatiemethode (9)(10) en de suspensiemethode (11). Ook wijzigingen voor het testen van gassen of dampen zijn beschreven (12).

De hier beschreven procedures gelden vooral voor de methode met geïntegreerde voedingsbodem en de preïncubatiemethode. Beide zijn aanvaarbaar voor de uitvoering van experimenten zowel met als zonder metabole activering. Bij sommige stoffen verloopt de detectie efficiënter met de preïncubatiemethode. Deze stoffen behoren tot chemische klassen als alifatische nitrosamines met een korte keten, divalente metalen, aldehyden, azokleurstoffen en diazoverbindingen, pyrollizidine-alkaloïden, allylverbindingen en nitroverbindingen (3). Tevens is het bekend dat bepaalde klassen mutagene verbindingen niet altijd met standaardprocedures als de methode met geïntegreerde voedingsbodem of de preïncubatiemethode worden gesignaleerd. Deze moeten als „speciale gevallen” worden beschouwd en voor de signalering daarvan wordt sterk aangeraden andere procedures te gebruiken. De volgende „speciale gevallen” kunnen worden genoemd (met voorbeelden van procedures die voor deze stoffen kunnen worden gebruikt): azokleurstoffen en diazoverbindingen (3)(5)(6)(13), gassen en vluchtige stoffen (12)(14)(15)(16) en glycosiden (17)(18). Voor een afwijking van de standaardprocedure moet een wetenschappelijke motivering worden gegeven.

1.5. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE

1.5.1. Voorbereiding

1.5.1.1. Bacteriën

Verse bacterieculturen worden gekweekt tot het laat-exponentiële of vroeg-stationaire groeistadium (ongeveer 109 cellen per ml). Culturen in de laat-stationaire fase mogen niet worden gebruikt. Het is van essentieel belang dat de bij het experiment gebruikte culturen een hoog gehalte aan levensvatbare bacteriën bevatten. De titer kan aan de hand van gegevens over groeicurves uit in het verleden uitgevoerde controles worden bepaald of door met behulp van een uitplaatexperiment het aantal levensvatbare cellen te bepalen.

De aanbevolen incubatietemperatuur is 37 oC.

Er moeten ten minste vijf bacteriestammen worden gebruikt. Daarbij moeten vier stammen van S. typhimurium zijn (TA 1535, TA 1537, TA 97a of TA 97; Ta 98: en TA 100) waarvan is aangetoond dat de resultaten betrouwbaar en in verschillende laboratoria reproduceerbaar zijn. Deze vier stammen van S. typhimunum hebben GC-basenparen op de primaire terugmutatieplaats en het is bekend dat bepaalde oxiderende mutagenen, cross-linkende stoffen en hydrazines daarmee niet altijd worden gesignaleerd. Voor deze stoffen kunnen de stammen WP2 van E. coli of TA 102 van S. typhimurium worden gebruikt (19), die een AT-basenpaar op de primaire terugmutatieplaats hebben. Als combinatie van stammen wordt derhalve aanbevolen:

—TA 1535 van S. typhimurium en

—TA 1537 of TA 97 of TA 97a van S. typhimurium en

—TA 98 van S. typhimurium en

—TA 100 van S. typhimurium en

—WP2 uvrA van E. coli of WP2 uvrA (pKM101) van E. coli of TA 102 van S. typhimurium.

Om cross-linkende mutagenen te signaleren kan het de voorkeur verdienen TA 102 of een stam van E. coli die bedreven is in DNA-herstel (bv. WP2 (pKM101) van E. coli) te gebruiken.

Er moeten erkende procedures voor de bereiding van voorraadculturen, markercontrole en opslag worden gebruikt. Voor elk preparaat van de ingevroren voorraadcultuur moet de aminozuurafhankelijkheid voor de groei worden aangetoond (histidine voor stammen van S. typhimurium en tryptofaan voor stammen van E. coli). Ook ander fenotypekenmerken moeten worden gecontroleerd, namelijk: de aan- of afwezigheid van plasmiden met de R-factor, indien van toepassing (bv. resistentie tegen ampicilline bij de stammen TA 98, TA 100 en TA 97a of TA 97, WP2 uvrA en WP2 uvrA (pKM101) en resistentie tegen ampicilline en tetracycline bij stam TA 102); de aanwezigheid van karakteristieke mutaties (bv. de rfa-mutatie bij S. typhimurium door de gevoeligheid voor kristalviolet en de uvrA-mutatie bij E. coli of de uvrB-mutatie bij S. typhimurium door de gevoeligheid voor ultraviolet licht) (2)(3). Bij de stammen moeten ook spontane terugmutantkolonies voorkomen met een frequentie die ligt binnen het interval dat op grond van controlegegevens van het laboratorium uit het verleden kan worden verwacht en bij voorkeur binnen het interval dat in de literatuur wordt opgegeven.

1.5.1.2. Medium

Er wordt gebruikgemaakt van een geschikte minimale agar (bv. met minimaal medium E van Vogel-Bonner en glucose) en een topagar met histidine en bioline of tryptofaan om een aantal celdelingen mogelijk te maken (1)(2)(9).

1.5.1.3. Metabole activering

De bacteriën dienen zowel met als zonder een geschikt metabool activeringssysteem aan de teststof te worden blootgesteld. Het meest gebruikte systeem is een post-mitochondriale fractie aangevuld met een cofactor (S9), verkregen uit de lever van knaagdieren die zijn behandeld met enzym-inducerende stoffen als Aroclor 1254 (1)(2) of een combinatie van fenobarbiton en ß-naftoflavon (18)(20)(21). De post-mitochondriale fractie wordt meestal gebruikt bij een concentratie van 5 tot 30 % (v/v) in het S9-mengsel. De keuze en de omstandigheden voor het gebruik van een metabool activeringssysteem kunnen afhankelijk zijn van de aard van de geteste chemische verbinding. In sommige gevallen kan het nuttig zijn meer dan een concentratie van de post-mitochondriale fractie te gebruiken. Voor azokleurstoffen en diazoverbindingen kan wellicht beter een reductief metabool activeringssysteem worden gebruikt (6)(13).

1.5.1.4. Teststof/Bereiding

Vaste teststoffen moeten in geschikte oplosmiddelen of media worden opgelost of gesuspendeerd en eventueel vóór de behandeling van de bacteriën worden verdund. Vloeibare teststoffen kunnen rechtstreeks aan het test-systeem worden toegediend en/of vóór behandeling worden verdund. Tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aanvaardbaar is, moeten verse bereidingen worden gebruikt.

Chemische reacties tussen het oplosmiddel/medium en de teststof moeten uitgesloten zijn en het oplosmiddel/medium moet verenigbaar zijn met het overleven van de bacteriën en de S9-activiteit (22). Als er andere dan gangbare oplosmiddelen/media worden gebruikt, moeten gegevens worden verstrekt waaruit blijkt dat ze geen problemen opleveren. Aanbevolen wordt waar mogelijk eerst te bezien of een waterig oplosmiddel/medium kan worden gebruikt. Wanneer stoffen worden getest die in water instabiel zijn, moeten de gebruikte organische oplosmiddelen watervrij zijn.

1.5.2. Testomstandigheden

1.5.2.1. Teststammen (zie punt 1.5.1.1)

1.5.2.2. Blootstellingsconcentraties

Bij de bepaling van de grootste te gebruiken hoeveelheid teststof moet onder andere rekening worden gehouden met de cytotoxiciteit en de oplosbaarheid in het uiteindelijke behandelingsmengsel.

Het kan nuttig zijn vooraf een apart experiment uit te voeren om de toxiciteit en de oplosbaarheid te bepalen. De cytotoxiciteit kan worden bepaald aan de hand van een daling in het aantal terugmutantkolonies, een opheldering of afname van de achtergrond of de mate waarin de behandelde culturen overleven. De cytotoxiciteit van een stof kan in aanwezigheid van een metabool activeringssysteem veranderen. De oplosbaarheid moet worden beoordeeld aan de hand van het met het blote oog zichtbare neerslaggedrag in het uiteindelijke mengsel onder de feitelijke testomstandigheden.

De aanbevolen maximale concentratie voor oplosbare niet-cytotoxische stoffen is 5 mg/plaat of 5 μl/plaat. Voor niet-cytotoxische stoffen die bij 5 mg/plaat of 5 μl/plaat niet oplosbaar zijn, moet een of meer van de geteste concentraties in het uiteindelijke behandelingsmengsel onoplosbaar zijn. Teststoffen die al bij lagere concentraties dan 5 mg/plaat of 5 μl/plaat cytotoxisch zijn, moeten tot een cytotoxische concentratie worden getest. Het neerslag mag niet storen bij het scoren.

Er moeten ten minste vijf analyseerbare concentraties van de teststof worden gebruikt met ongeveer een half log-interval (d.w.z. een factor √10) tussen de concentraties voor een eerste experiment. Kleinere intervallen kunnen nuttig zijn wanneer het verband tussen concentratie en respons wordt onderzocht. Hogere concentraties dan 5 mg/plaat of 5 μl/plaat kunnen worden overwogen bij de beoordeling van stoffen die significante hoeveelheden potentieel mutagene verontreinigingen bevatten.

1.5.2.3. Negatieve en positieve controles

Bij elke bepaling moeten tegelijkertijd stamspecifieke positieve en negatieve (oplosmiddel of medium) controles worden uitgevoerd, zowel met als zonder metabole activering. De concentraties van de positieve controle moeten zodanig worden gekozen dat voor elke bepaling wordt aangetoond dat deze correcte resultaten oplevert.

Voor bepalingen waarbij een metabool activeringssysteem wordt gebruikt, moet(en) de voor de positieve controle gebruikte referentiestof(fen) op basis van de aard van de gebruikte bacteriestam worden gekozen.

Voor bepalingen met metabole activering kunnen als positieve controle bijvoorbeeld worden gebruikt:



Stof

Cas-nr

Einecs-nr.

9,10-dimethylanthraceen

78l-43-l

212-308-4

7,12-dimethylbenz[a]anthraceen

57-97-6

200-359-5

Benzo[a]pyreen

50-32-8

200-028-5

2-aminoantraceen

613-13-8

210-330-9

Cyclofosfamide

50-18-0

200-015-4

Cyclofosfamide monohydraat

6055-19-2

Voor de methode met reductieve metabole activering kan als positieve controle worden gebruikt:



Stof

CAS-nr.

Einecs-nr.

Kongo rood

5 7 3-58-0

209-358-4

2-aminoantraceen mag niet als enige indicator voor de werkzaamheid van het S9-mengsel worden gebruikt. Als 2-aminoantraceen wordt gebruikt, moet elke charge S9 ook worden gekarakteriseerd met een mutageen waarvoor metabole activering met microsomale enzymen nodig is, zoals benzo[a]pyreen of dimethylbenzant-raceen.

Voor bepalingen zonder exogeen metabool activeringssysteem kunnen als stamspecifieke positieve controle bijvoorbeeld worden gebruikt:



Stof

CAS-nr.

Einecs-nr.

Stam

Natriumazide

26628-22-S

247-852-1

TA 1535 en TA 100

2-nitrofluoreen

607-57-8

210-138-5

TA 98

9-aminoacridine

90-45-9

201-995-6

TA 1537, TA 97 en TA 97a

ICR 191

1 7070-4 5-0

241-129-4

TA 1537, TA 97 en TA 97a

Cumeenhydroperoxide

80-15-9

201-254-7

TA 102

Mitomycine C

50-07-7

200-008-6

WP2 uvrA en TA 102

N-ethyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine

70-25-7

200-730-1

WP2, WP2 uvrA en WP2 uvrA(pKM101)

4-nitroquinoline-1-oxide

56-5 7-5

200-281-1

WP2, WP2 uvrA en WP2 uvrA(pKM101)

Furylfuramide (AF2)

3688-53-7

Stammen die plasmiden bevatten

Ook andere geschikte stoffen kunnen als positieve controle worden gebruikt. Waar mogelijk dient het gebruik van stoffen uit een verwante chemische klasse als positieve controle te worden overwogen.

In het experiment dienen negatieve controles te worden opgenomen, waaraan uitsluitend het oplosmiddel of het medium zonder teststof wordt toegediend en die verder op dezelfde manier als de andere groepen worden behandeld. Daarnaast moeten er ook controles worden gebruikt waaraan niets wordt toegediend, tenzij in het verleden reeds is aangetoond dat het gekozen oplosmiddel geen schadelijke of mutagene effecten veroorzaakt.

1.5.3. Uitvoering

Voor de methode met geïntegreerde voedingsbodem (1)(2)(3)(4) zonder metabole activering wordt meestal 0,05 ml of 0,1 ml testoplossing, 0,1 ml verse bacteriecultuur (met ongeveer 108 levensvatbare cellen) en 0,5 ml steriele buffer gemengd met 2,0 ml topagar. Voor de bepaling met metabole activering wordt meestal 0,5 ml van het metabool activeringsmengsel met een afdoende hoeveelheid post-mitochondriale fractie (tussen 5 en 30 % (v/v) in het metabole activeringsmengsel) gemengd met de topagar (2,0 ml), de bacteriën en de test-stof/testoplossing. De inhoud van elke buis wordt gemengd en uitgegoten over het oppervlak van een minimale agarplaat. De topagar krijgt voor de incubatie de gelegenheid te stollen.

Voor de preïncubatiemethode (2)(3)(5)(6) wordt de teststof/testoplossing gepreïncubeerd met de teststam (met ongeveer 108 levensvatbare cellen) en steriele buffer of het metabole activeringssysteem (0,5 ml), meestal gedurende minimaal 20 minuten bij 30-37 oC, en vervolgens gemengd met de topagar en uitgegoten over het oppervlak van een minimale agarplaat. Meestal wordt 0,05 ml of 0,1 ml teststof/testoplossing, 0,1 ml bacteriën en 0,5 ml S9-mengsel of steriele buffer gemengd met 2,0 ml topagar. De buizen dienen gedurende de preïncubatie met behulp van een schudmachine te worden belucht.

Om een adequate raming van de spreiding te kunnen maken moeten voor elk dosisniveau drie platen worden gebruikt. Het gebruik van twee platen is aanvaardbaar wanneer daarvoor een wetenschappelijke motivering wordt gegeven. Wanneer nu en dan een plaat verloren gaat, maakt dit de bepaling niet noodzakelijkerwijs onbruikbaar.

Bij het testen van gassen of vluchtige stoffen moet een daarvoor geschikte methode worden gevolgd, bijvoorbeeld in een gesloten kweekvat (12)(14)(15)(16).

1.5.4. Incubatie

Alle platen voor een bepaling worden gedurende 48-72 uur bij 37 oC geïncubeerd. Na de incubatieperiode wordt het aantal terugmutantkolonies per plaat geteld.

2. GEGEVENS

2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN

De gegevens worden vermeld als het aantal terugmutantkolonies per plaat. Daarnaast moet ook het aantal terugmutantkolonies op de platen voor zowel negatieve (oplosmiddel en zonder behandeling, indien gebruikt) als positieve controle worden vermeld. Voor zowel de teststof als de positieve en negatieve (zonder behandeling en/of oplosmiddel) controle, moeten de tellingen per plaat, het gemiddelde aantal terugmutantkolonies per plaat en de standaardafwijking worden vermeld.

Een duidelijk positieve reactie behoeft niet te worden bevestigd. Bij onduidelijke resultaten moet nader onderzoek worden gedaan, bij voorkeur onder gewijzigde experimentele omstandigheden. Negatieve resultaten moeten per geval worden bevestigd. Wanneer een bevestiging van negatieve resultaten niet nodig wordt geacht, moet daarvoor een motivering worden gegeven. Bij vervolgexperimenten dient wijziging van parameters te worden overwogen om de bepaling uit te breiden tot een breder scala van omstandigheden. Parameters die voor wijziging in aanmerking komen zijn bijvoorbeeld de concentratie-intervallen, de wijze van behandeling (geïntegreerde voedingsbodem of preïncubatie in vloeistof) en de omstandigheden bij metabole activering.

2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN

Er zijn verschillende criteria om tot een positief resultaat te besluiten, zoals een concentratieafhankelijke stijging op het geteste interval en/of een reproduceerbare stijging bij een of meer concentraties van het aantal terugmutantkolonies per plaat bij ten minste één stam met of zonder metabool activeringssysteem (23). In eerste instantie moet naar de biologische relevantie van de resultaten worden gekeken. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de testresultaten kunnen statistische methoden worden gebruikt (24). Statistische significantie mag echter niet de enige bepalende factor voor een positieve reactie zijn.

Indien de resultaten voor een teststof niet aan bovenstaande criteria voldoen, wordt de stof bij deze test als niet-mutageen beschouwd.

Hoewel de meeste experimenten duidelijk positieve of negatieve resultaten zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de effecten van de teststof in uitzonderingsgevallen onmogelijk zijn. De resultaten kunnen, hoe vaak het experiment ook wordt herhaald, onduidelijk of twijfelachtig blijven.

Positieve resultaten bij de terugmutatietest met bacteriën wijzen erop dat de teststof puntmutaties door basen-paarvervanging of leesraamverschuiving in het genoom van Salmonella typhimurium en/of Escherichia coli induceeert. Negatieve resultaten wijzen erop dat de stof onder de testomstandigheden bij de geteste soort niet mutageen is.

3. RAPPORTAGE

TESTVERSLAG

In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

Oplosmiddel/Medium:

—motivering voor de keuze van het oplosmiddel/medium;

—oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/medium, indien bekend.

Stammen:

—gebruikte stammen;

—aantal cellen per cultuur;

—kenmerken van de stam.

Testomstandigheden:

—hoeveelheid teststof per plaat (in mg/plaat of (μl/plaat) met vermelding van de achtergrond voor de keuze van de dosis en het aantal platen per concentratie;

—gebruikte media;

—aard en samenstelling van het metabool activeringssysteem, met inbegrip van aanvaardbaarheidscriteria;

—procedures voor de behandeling.

Resultaten:

—tekenen van toxiciteit;

—neerslagverschijnselen;

—tellingen per plaat;

—gemiddeld aantal terugmutantkolonies per plaat met de standaardafwijking;

—indien mogelijk het verband tussen dosis en respons;

—eventuele statistische analyses;

—gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde negatieve (oplosmiddel/medium) en positieve controles met vermelding van spreiding, gemiddelde en standaardafwijking;

—gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve (oplosmiddel/medium) en positieve controles met vermelding van spreiding, gemiddelde en standaardafwijking.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies.

4. REFERENTIES

(1)Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, pp. 347-364.

(2)Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, pp. 173-215.

(3)Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994). Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation Res., 312, pp. 217-233.

(4)Kier, L.D., Brusick, D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray, V. (1986). The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 168, pp. 69-240.

(5)Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975). Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, pp. 91-96.

(6)Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao. M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980). Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests. In: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens. Ed. Norpoth K.H. and Garner. R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York. pp. 273-285.

(7)Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. and Foster, R. (1980). Bacterial Mutation Assays. In: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed. D.J. Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13-61.

(8)Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987). Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety, 8, pp. 167-177.

(9)Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A. (1976). Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens. Mutation Res., 38, pp. 33-42.

(10)Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and Bridges, J.W. (1984). The Fluctuation Test in Bacteria. In: Handbook of Mutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J., Legator, M, Nichols, W. and Ramel, C. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161.

(11)Thompson, E.D. and Melampy, P.J. (1981). An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium. Environmental Mutagenesis, 3, pp. 453-465.

(12)Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994). lmproved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307, pp. 335-344.

(13)Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and Vaughan, V.L. (1984). Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay. Mutation Res., 136, pp. 33-47.

(14)Zeiger. E., Anderson, B.E.. Haworth. S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992). Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2-141.

(15)Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G. (1977). Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water. In Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. Sobels (Eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249-258.

(16)Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, L.D. (1987). Vaporization Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay. Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421-441.

(17)Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M. and Sugimura, T. (1979). Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium. Cancer Res., 39, pp. 3780-3782.

(18)Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N. (1980). Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961-4965.

(19)Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G. (1990). Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains. Mutagenesis. 5, pp. 285-291.

(20)Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems. In: „In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing”. Eds. F.J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88.

(21)Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, (21) pp. 175-177.

(22)Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N. (1981). Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test. Mutation Res., 88. pp. 343-350.

(23)Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987). Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity. Mutation Res. 189, pp. 83-91.

(24)Mahon, G.A.T., Green, M.H.L, Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W.D. and Tweats, D.J. (1989). Analysis of Data from Microbial Colony Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J., Cambridge University Press, pp. 28-65.

B.15. MUTAGENITEITSONDERZOEK EN SCREENING OP CARCINOGENESEGENMUTATIE — SACCHAROMYCES CEREVISIAE

1. METHODE

1.1. INLEIDING

Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.2. DEFINITIE

Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Geen.

1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE

Er kunnen verschillende haploïde en diploïde stammen van de gist Saccharomyces cerevisiae worden gebruikt om de door chemische stoffen geïnduceerde genmutaties te meten, dit zowel met als zonder metabole activering.

Voorwaartse mutatiesystemen bij haploïde stammen zoals de meting van mutatie van rode mutanten met adeninebehoefte (ade-1, ade-2) naar witte mutanten met dubbele adeninebehoefte en selectieve systemen zoals de inductie van canavanine- en cycloheximideresistentie zijn gebruikt.

Het meest uitgebreid gevalideerde terugwaartse mutatiesysteem maakt gebruik van de haploïde stam XV 185-14C welke de oker nonsens mutaties ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 en trp 5-48 draagt die omkeerbaar zijn door basesubstitutiemutagenen die plaatsspecifieke mutaties of oker suppressor mutaties induceren. XV 185-14C heeft ook het his 1-7 kenmerk, een „missense” mutatie die hoofdzakelijk wordt gereverteerd door tweede-plaatsmutaties, en het hom 3-10 kenmerk, dat wordt gereverteerd door „frame shift”-mutagenen (verschuivingen in het leeskader).

Van de diploïde stammen van S.cerevisiae wordt alleen D7, die homozygoot is voor ilv 1-92, uitgebreid gebruikt.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

Geen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE

V oorbereidingen

De oplossingen van de teststof en van controle- of referentiestoffen dienen kort voor het uitvoeren van de test te worden bereid met behulp van een geschikt medium. Voor niet in water oplosbare organische stoffen moet een oplossing van niet meer dan 2 % v/v organische oplosmiddelen, zoals ethanol, aceton of dimethylsulfoxyde (DMSO) worden gebruikt. De eindconcentratie van het oplosmiddel dient de levensvatbaarheid en de groeikarakteristieken van de cel niet significant te beïnvloeden.

De cellen moeten met en zonder een geschikt exogeen metabool activeringssysteem aan de teststoffen worden blootgesteld.

Het meest gebruikte systeem is een met een cofactor aangevulde postmitochondriale fractie bereid uit levers van knaagdieren die met enzyminducerende agentia zijn voorbehandeld. Het gebruik van andere diersoorten, weefsels, postmitochondriale fracties of procedures kan ook geschikt zijn voor het verkrijgen van metabole activering.

Proefomstandigheden

De haploïde stam XV 185-14 C en de diploïde stam D7 zijn het meest gebruikt voor onderzoek naar genmutaties. Andere stammen kunnen eveneens geschikt zijn.

Er worden geschikte media gebruikt voor de bepaling van overleving en het aantal mutaties.

Positieve, onbehandelde en oplosmiddelencontroles moeten parallel worden uitgevoerd. Voor elk specifiek mutatie-eindpunt moeten geschikte positieve controlechemicaliën worden gebruikt.

Er zijn ten minste vijf behoorlijk gespreide concentraties van de teststof vereist. Voor toxische stoffen mag de hoogste geteste concentratie het overlevingspercentage niet tot minder dan 5 à 10 % verlagen. In water relatief onoplosbare stoffen dienen met behulp van geschikte methoden tot de uiterste oplosbaarheidsgrens te worden onderzocht. Voor volledig in water oplosbare niet-toxische stoffen dient de hoogste concentratie per geval te worden bepaald.

De platen worden gedurende vier tot zeven dagen bij 28 tot 30 oC in het donker geïncubeerd.

Er dienen subculturen te worden gebruikt met een spontane mutatiefrequentie binnen de normaal aanvaarde grenzen.

Voor de analyse van door genmutatie geproduceerde prototrofen en de levensvatbaarheid van de cellen moeten per concentratie ten minste drie replicaplaten worden gebruikt. Voor proefnemingen met kenmerken zoals hom 3-10 met een laag mutatieniveau moet het aantal gebruikte platen worden verhoogd, teneinde statistisch relevante gegevens te verkrijgen.

Uitvoering

S. cerevisiae-stammen worden gewoonlijk behandeld in een vloeistoftest met hetzij stationaire hetzij groeiende cellen. Het eerste experiment moet worden uitgevoerd met groeiende cellen. 1 — 5 × 107 cellen per ml worden gedurende maximaal achttien uur bij 28 tot 37 oC onder schudden aan de teststof blootgesteld; een passende hoeveelheid van een metabool activeringssysteem wordt tijdens de behandeling toegevoegd, waar dat van toepassing is. Na de behandeling worden de cellen gecentrifugeerd, uitgewassen en uitgezaaid op een geschikt cultuurmedium. Na incubatie worden op de platen overleving en de inductie van genmutaties bepaald. Indien het eerste experiment negatief is, moet een tweede experiment worden uitgevoerd met stationaire cellen. Als het eerste experiment positief is, dient dit in een passend, onafhankelijk experiment te worden bevestigd.

2. GEGEVENS

De gegevens moeten in tabellen worden samengevat met vermelding van het aantal getelde kolonies, het aantal mutanten, overlevings- en mutatiefrequenties. Alle resultaten moeten in een onafhankelijke proef worden bevestigd. De gegevens moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden geëvalueerd.

3. RAPPORTAGE

3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMING

In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen:

—gebruikte stam;

—proefomstandigheden: stationaire fase of groeiende cellen, samenstelling van de media, incubatietemperatuur en -duur, metabool activeringssysteem;

—behandelingsomstandigheden: blootstellingsniveaus, procedure en duur van de behandeling, behandelingstemperatuur, positieve en negatieve controles;

—aantal getelde kolonies, aantal mutanten, overlevings- en mutatiefrequentie, dosis-responsverhouding (waar dat van toepassing is), statistische beoordeling van gegevens;

—bespreking van de resultaten;

—interpretatie van de resultaten.

3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE

Zie Algemene inleiding — Deel B.

4. LITERATUUR

Zie Algemene inleiding — Deel B.

B.16. MITOTISCHE RECOMBINATIE — SACCHAROMYCES CEREVISIAE

1. METHODE

1.1. INLEIDING

Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.2. DEFINITIE

Zie Algemene inleiding — Deel B.

1.3. REFERENTIESTOFFEN

Geen.

1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE

Mitotische recombinatie bij Saccharomyces cerevisiae kan worden vastgesteld tussen genen (of meer algemeen tussen een gen en zijn centromeer) en binnen genen. Het eerste verschijnsel wordt mitotische overkruising genoemd en genereert reciproke producten terwijl het laatste verschijnsel meestal niet reciprook is en genconversie wordt genoemd. Overkruising kan over het algemeen worden vastgesteld door de productie van recessieve homozygote kolonies of sectoren in een heterozygote stam terwijl genconversie wordt vastgesteld door de productie van prototrofe revertanten in een auxotrofe heteroallele stam die twee verschillende defecte allelen van hetzelfde gen draagt. De voor het opsporen van mitotische genconversie meest gebruikte stammen zijn D4 (heteroalleel in ade 2 en trp 5), D7 (heteroalleel in trp 5), BZ34 (heteroalleel in arg 4) en JD1 (heteroalleel in his 4 en trp 5). Mitotische overkruising waarbij rode en roze homozygote sectoren worden geproduceerd, kan worden vastgesteld in D5 of D7 (waarin ook de mitotische genconversie en de terugwaartse mutatie in ilv 1-92 worden gemeten), aangezien beide stammen heteroalleel zijn voor complementerende allelen van ade2.

1.5. KWALITEITSCRITERIA

Geen.

1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE

Voorbereidingen

Oplossingen van de teststof en van controle- of referentiestoffen dienen kort voor het uitvoeren van de test te worden bereid met behulp van een geschikt medium. Voor niet in water oplosbare organische stoffen moet een oplossing van niet meer dan 2 % v/v organische oplosmiddelen, zoals ethanol, aceton en dimethylsulfoxyde (DMSO) worden gebruikt. De eindconcentratie van het oplosmiddel dient de levensvatbaarheid en de groeikarakteristieken van de cel niet significant te beïnvloeden.

De cellen moeten zowel met als zonder een geschikt exogeen metabool activeringssysteem aan de teststoffen worden blootgesteld. Het meest gebruikte systeem is een met cofactor aangevulde postmitochondriale fractie bereid uit de levers van knaagdieren die voorbehandeld zijn met enzyminducerende agentia. Het gebruik van andere diersoorten, weefsels, postmitochondriale fracties of procedures kan eveneens geschikt zijn voor het verkrijgen van metabole activering.

Proefomstandigheden

De meest gebruikte stammen zijn de diploïden D4, D5, D7 en JD1. Andere stammen kunnen ook gebruikt worden.

Er worden geschikte cultuurmedia gebruikt voor de bepaling van overleving en de mitotische recombinatiefrequentie.

Positieve, onbehandelde en oplosmiddelcontroles moeten parallel worden uitgevoerd. Voor elk specifiek recombinatie-eindpunt moeten geschikte positieve controlestoffen worden gebruikt.

Er zijn ten minste vijf behoorlijk gespreide concentraties van de teststof vereist. Factoren waarmee rekening moet worden gehouden zijn cytotoxiciteit en oplosbaarheid. De laagste concentratie mag geen effect hebben op de levensvatbaarheid van de cellen. Voor toxische chemicaliën mag de hoogste geteste concentratie het overlevingspercentage niet tot minder dan 5 a 10 % verlagen. In water relatief onoplosbare chemicaliën dienen met behulp van geschikte methoden tot de uiterste oplosbaarheidsgrens te worden onderzocht. Voor volledig in water oplosbare niet-toxische stoffen dient de hoogste concentratie per geval te worden bepaald.

De cellen kunnen, hetzij in de stationaire fase hetzij tijdens de groei, gedurende perioden van maximaal achttien uur aan de teststof worden blootgesteld. Bij lange behandelingstijden dienen de culturen evenwel microscopisch te worden gecontroleerd op spoorvorming, aangezien de proef daardoor zijn waarde verliest.

De platen worden in het donker gedurende vier tot zeven dagen bij 28 tot 30 oC geïncubeerd. Platen die worden gebruikt voor het opsporen van door mitotische overkruising geproduceerde rode en roze homozygote sectoren dienen voor het tellen nog een à twee dagen in een koelkast te worden bewaard (± 4 oC), teneinde de ontwikkeling van de geschikt gepigmenteerde kolonies te laten plaatsvinden.

Er moeten subculturen worden gebruikt met een spontane mitotische recombinatiefrequentie binnen de normaal aanvaarde grenzen.

Per concentratie moeten ten minste drie replicaplaten worden gebruikt voor de bepaling van het aantal door mitotische genconversie geproduceerde prototrofen en de levensvatbaarheid van de