Verordening (EU) 2019/1390 van de Commissie van 31 juli 2019 tot wijziging, in verband met de aanpassing ervan aan de technische vooruitgang, van de bijlage bij Verordening (EG) nr. 440/2008 houdende vaststelling van testmethoden uit hoofde van Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (Reach) (Voor de EER relevante tekst)

De bijlage bij Verordening (EG) nr. 440/2008 wordt als volgt gewijzigd:

1. In deel B wordt hoofdstuk B.4 vervangen door:

   ACUTE TOXICITEIT: HUIDIRRITATIE/CORROSIE

   INLEIDING

   Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 404 (2015) van de OESO. De richtlijnen van de OESO voor het testen van chemische stoffen worden periodiek herzien om te waarborgen dat ze de beste wetenschappelijke methoden weerspiegelen. Bij de herziening van OESO TG 404 is bijzondere aandacht besteed aan mogelijke verbeteringen met het oog op het welzijn van de dieren en aan de evaluatie van alle bestaande informatie over de teststof om onnodige tests bij proefdieren te vermijden. In de bijgewerkte versie van OESO TG 404 (oorspronkelijk vastgesteld in 1981, herzien in 1992, 2002, 2015), die verwijst naar de OESO-leidraad voor een geïntegreerde test- en beoordelingsbenadering (Integrated Approach on Testing and Assessment, IATA) voor huidcorrosie en -irritatie (1), wordt een modulaire benadering voor het testen op huidirritatie en huidcorrosie voorgesteld. De IATA omvat verschillende modules met gedeelde informatiebronnen en analyse-instrumenten en i) biedt richtsnoeren voor de integratie en het gebruik van bestaande gegevens die zijn verzameld met behulp van test- en niet-testmethoden om het potentieel voor huidirritatie en -corrosie van chemische stoffen te beoordelen en ii) draagt een benadering aan voor wanneer verder testen nodig is (1). Bovendien wordt in die richtlijn aanbevolen om bij de voorlopige in-vivotest de drie testgaasjes waar nodig niet tegelijkertijd maar achtereenvolgens bij het dier aan te brengen.

   De definities van huidirritatie en huidcorrosie zijn opgenomen in het aanhangsel bij deze testmethode.

   INLEIDENDE OVERWEGINGEN

   In het belang van zowel wetenschappelijke kwaliteit als het dierenwelzijn moeten er geen in-vivotests worden uitgevoerd voordat alle beschikbare gegevens over de mogelijke huidcorrosiviteit/-irritatie door de teststof zijn geëvalueerd in een bewijskrachtanalyse zoals beschreven in de OESO-leidraad voor een geïntegreerde test- en beoordelingsbenadering voor huidcorrosie en -irritatie, d.w.z. in de drie delen van deze leidraad en de bijbehorende modules (1). In Deel 1 worden bestaande gegevens behandeld in zeven modules over gegevens verzameld bij mensen, in-vivogegevens, in-vitrogegevens, gegevens over fysisch-chemische eigenschappen (bv. pH, vooral sterke zuurgraad of alkaliniteit) en niet-testmethoden. In Deel 2 wordt een bewijskrachtanalyse uitgevoerd. Als deze bewijskrachtanalyse geen uitsluitsel geeft, moet Deel 3 worden uitgevoerd met aanvullende tests, te beginnen met in-vitromethoden en wordt pas in laatste instantie overgegaan tot het gebruik van in-vivotests. Door een dergelijke analyse zijn er dan ook minder in-vivotests nodig op huidcorrosiviteit/-irritatie door teststoffen waarvoor al voldoende bewijsmateriaal bestaat uit andere onderzoeken met deze twee eindpunten.

   PRINCIPE VAN DEIN-VIVOTEST

   De teststof wordt in één dosis op de huid van een proefdier aangebracht; de onbehandelde huid van het proefdier wordt als controle gebruikt. De mate van irritatie/corrosie wordt op bepaalde tijdstippen afgelezen en ingeschaald en wordt nader beschreven om een volledige evaluatie van de effecten mogelijk te maken. De duur van het onderzoek moet voldoende zijn om te kunnen beoordelen of de waargenomen effecten reversibel of irreversibel van aard zijn.

   Dieren die gedurende een fase van de test voortdurend tekenen van ernstig ongerief en/of hevige pijn vertonen, moeten op humane wijze worden gedood en de teststof moet dienovereenkomstig worden beoordeeld. Criteria voor de beslissing om stervende en hevig lijdende dieren op humane wijze te doden zijn te vinden in een afzonderlijke leidraad (2).

   VOORBEREIDING VAN DEIN-VIVOTEST

   Keuze van de diersoort

   Als proefdier wordt de voorkeur gegeven aan het albinokonijn en er worden gezonde jonge volwassen konijnen gebruikt. Wanneer er een andere soort wordt gebruikt, moet hiervoor een motivering worden gegeven.

   Voorbereiding van de dieren

   Ongeveer 24 uur voor de test wordt het haar op het ruggedeelte van de romp van de dieren door kort afknippen verwijderd. Er moet op worden gelet dat de huid niet wordt geschaafd. Alleen dieren met een gezonde en gave huid mogen worden gebruikt.

   Sommige konijnenstammen hebben plekken met dichte haargroei, die in bepaalde perioden van het jaar meer op de voorgrond treden. De test mag niet op deze plekken met dichte haargroei worden uitgevoerd.

   Huisvesting en voeding

   De dieren worden in aparte kooien gehuisvest. De temperatuur in de proefdierruimte moet 20 °C (± 3 °C) zijn. Hoewel de relatieve luchtvochtigheid ten minste 30 % moet bedragen en, behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte, bij voorkeur niet hoger mag zijn dan 70 %, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Verlichting gebeurt met kunstlicht met een ritme van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater.

   TESTPROCEDURE

   Het aanbrengen van de teststof

   De teststof wordt aangebracht op een klein huidoppervlak (ongeveer 6 cm²) en de plek wordt bedekt met een gaasje dat met behulp van niet-irriterend plakband op zijn plaats wordt gehouden. Wanneer de stof niet direct kan worden aangebracht (bijvoorbeeld bij vloeistoffen of bepaalde pasta’s), wordt de teststof eerst op het gaasje aangebracht en wordt dit daarna op de huid bevestigd. Het gaasje moet gedurende de blootstellingsperiode door middel van een geschikt semi-occlusief verband in licht contact met de huid blijven. Als de teststof op het gaasje wordt aangebracht, moet dit zodanig op de huid worden bevestigd dat er een goed contact en een uniforme verdeling van de teststof op de huid is. Er moet tevens voor worden gezorgd dat het gaasje voor het dier onbereikbaar is en dat inslikken of inademen van de teststof onmogelijk is.

   Vloeibare teststoffen worden in het algemeen onverdund gebruikt. Bij een proef met vaste stoffen (die indien nodig eventueel kunnen worden verpoederd) moet de teststof met een zo klein mogelijke hoeveelheid water (of indien nodig een ander geschikt vehiculum) worden bevochtigd om voor een goed contact met de huid te zorgen. Wanneer een ander vehiculum dan water wordt gebruikt, moet een eventuele invloed van het vehiculum op de irritatie van de huid door de teststof minimaal zijn.

   Aan het einde van de blootstellingsperiode, die normaal gesproken 4 uur bedraagt, moeten de resten van de teststof zo mogelijk met water of met een geschikt oplosmiddel worden verwijderd zonder de bestaande respons of de intacte epidermis te wijzigen.

   Dosisniveau

   Een dosis van 0,5 ml vloeistof of 0,5 g vaste stof of pasta wordt op het testgedeelte van de huid aangebracht.

   Voorlopige test (in-vivotest op huidirritatie/corrosie met één dier)

   Wanneer een teststof op basis van een bewijskrachtanalyse of eerdere in-vitrotests als corrosief, irriterend of niet-ingedeeld wordt beschouwd, zijn verdere in-vivotests normaal gesproken niet nodig. Wanneer aanvullende gegevens nodig worden geacht, wordt de in-vivotest in eerste instantie met één dier uitgevoerd, waarbij de volgende benadering wordt toegepast. Bij het dier worden achtereenvolgens maximaal drie testgaasjes aangebracht. Het eerste gaasje wordt na drie minuten verwijderd. Als er geen ernstige huidreactie wordt waargenomen, wordt op een andere plek een tweede gaasje aangebracht dat na een uur wordt verwijderd. Als de waarnemingen in deze fase erop wijzen dat het niet onmenselijk is de blootstelling tot vier uur te verlengen, wordt een derde gaasje aangebracht, dat na vier uur wordt verwijderd, en wordt de reactie ingeschaald.

   Als er na een van de drie achtereenvolgende blootstellingen een corrosiereactie wordt waargenomen, wordt de test onmiddellijk gestaakt. Als er na de verwijdering van het laatste gaasje geen corrosiereactie wordt waargenomen, wordt het dier gedurende 14 dagen geobserveerd tenzij er vóór die tijd al corrosie ontstaat.

   Wanneer er niet wordt verwacht dat de teststof corrosie veroorzaakt maar deze wel irriterend kan zijn, wordt er één gaasje gedurende vier uur op één dier aangebracht.

   Bevestigende test (in-vivotest op huidirritatie/corrosie met meer dieren)

   Als er bij de voorlopige test geen corrosiereactie wordt waargenomen, moet de irritatie of negatieve reactie worden bevestigd met nog eens twee dieren die elk gedurende vier uur aan één gaasje worden blootgesteld. Als er bij de voorlopige test irritatie wordt waargenomen, kan de bevestigende test op sequentiële wijze worden uitgevoerd of door nog eens twee dieren tegelijkertijd bloot te stellen. Wanneer in een uitzonderlijk geval de voorlopige test niet wordt uitgevoerd, kunnen twee of drie dieren met één gaasje worden behandeld dat na vier uur wordt verwijderd. Wanneer er twee dieren worden gebruikt die beide dezelfde reactie vertonen, is verder testen niet nodig. Als de reactie verschilt, wordt ook het derde dier getest. Er kunnen extra dieren nodig zijn om duidelijkheid te krijgen omtrent moeilijk te interpreteren reacties.

   Observatieperiode

   De duur van de observatieperiode moet voldoende zijn om volledig te kunnen beoordelen of de waargenomen effecten reversibel zijn. Het experiment moet echter worden beëindigd zodra het dier voortdurend tekenen van hevige pijn of ernstig ongerief vertoont. Om te bepalen of de effecten reversibel zijn, moeten de dieren maximaal 14 dagen na de verwijdering van de gaasjes worden geobserveerd. Als al vóór het verstrijken van de 14 dagen wordt geconstateerd dat de effecten reversibel zijn, wordt het experiment op dat moment beëindigd.

   Klinische observatie en inschaling van de huidreacties

   Alle dieren worden op tekenen van erytheem en oedeem onderzocht en de respons wordt 60 minuten en vervolgens 24, 48 en 72 uur na de verwijdering van het gaasje ingeschaald. Bij de voorlopige test bij één dier wordt de huid ook onmiddellijk na de verwijdering van het gaasje onderzocht. De huidreactie wordt in een van de categorieën in de tabel ingeschaald en geregistreerd. Als er sprake is van een beschadiging van de huid die na 72 uur niet als irritatie of corrosie kan worden geïdentificeerd, kan het nodig zijn de observatie tot dag 14 voort te zetten om te bepalen of de effecten reversibel zijn. Naast de observatie van irritatie worden ook alle lokale toxische effecten, zoals ontvetting van de huid, en alle systemische schadelijke effecten (zoals effecten op klinische toxiciteitsverschijnselen en het lichaamsgewicht) volledig beschreven en geregistreerd. Om duidelijkheid te krijgen omtrent moeilijk te interpreteren reacties moet histopathologisch onderzoek worden overwogen.

   De inschaling van huidreacties is per definitie subjectief. Om harmonisatie bij de inschaling van huidreacties te bevorderen en ter ondersteuning van de testlaboratoria en de personen die bij het uitvoeren en het interpreteren van de observatie betrokken zijn, moet het personeel dat de observatie uitvoert afdoende zijn opgeleid in het gebruikte scoresysteem (zie de tabel). Een geïllustreerde leidraad voor de inschaling van huidirritatie en ander letsel kan nuttig zijn (3). De inschaling van de huidreacties moet blind gebeuren.

   GEGEVENS EN RAPPORTAGE

   De resultaten van het onderzoek worden in het eindverslag in tabelvorm vermeld en hierin worden alle onder punt 24 vermelde gegevens opgenomen.

   Evaluatie van de resultaten

   De scores voor de huidirritatie worden in samenhang met de aard en ernst van het letsel en de vraag of dit al dan niet reversibel is, beoordeeld. De individuele scores vormen geen absolute norm voor de irriterende eigenschappen van een materiaal, aangezien ook andere effecten van het testmateriaal worden beoordeeld. De individuele scores moeten veeleer als referentiewaarden worden beschouwd, die in combinatie met alle andere waarnemingen tijdens het onderzoek moeten worden geëvalueerd.

   Bij de beoordeling van de irritatiereactie moet rekening worden gehouden met de reversibiliteit van het huidletsel. Wanneer reacties als haaruitval (beperkt gebied), hyperkeratose, hyperplasie en schilfering tot het einde van de observatieperiode van 14 dagen blijven bestaan, moet de teststof als irriterend worden beschouwd.

   Testverslag

   In het testverslag worden de volgende gegevens opgenomen:

   • Motivering voor in-vivo test:

     • bewijskrachtanalyse van reeds bestaande testgegevens, zoals de resultaten van een sequentiële teststrategie;

     • een beschrijving van de relevante gegevens die van eerdere tests beschikbaar zijn;

     • de gegevens die bij elke fase van de teststrategie verkregen zijn;

     • een beschrijving van de uitgevoerde in-vitrotests met een gedetailleerde beschrijving van de procedures en de resultaten die met test/referentiestoffen verkregen zijn;

     • een bewijskrachtanalyse voor de uitvoering van het in-vivo-onderzoek.

   • Teststof:

     • stof die uit één component bestaat: chemische identificatiegegevens, zoals IUPAC- of CAS-naam, CAS-nummer, SMILES- of InChI-code, structuurformule, zuiverheid, chemische identiteit van onzuiverheden, indien van toepassing en praktisch haalbaar enz.;

     • stof die uit meerdere componenten bestaat, mengsel en stoffen waarvan de samenstelling niet bekend of variabel is, complexe reactieproducten of biologische materialen (UVCB): voor zover mogelijk, karakterisering aan de hand van chemische identiteit (zie hierboven), kwantitatief voorkomen en relevante fysisch-chemische eigenschappen van de bestanddelen;

     • fysisch voorkomen, oplosbaarheid in water en aanvullende relevante fysisch-chemische eigenschappen;

     • bron, partijnummer indien beschikbaar;

     • behandeling van de teststof/controlestof voorafgaand aan het testen, indien van toepassing (bv. opwarming, malen);

     • stabiliteit van de teststof, uiterste gebruiksdatum, of datum voor heranalyse, indien bekend;

     • bewaaromstandigheden.

   • Vehiculum:

     • identificatiegegevens, de concentratie (indien van toepassing) en het gebruikte volume;

     • een motivering voor de keuze van het vehiculum.

   • Proefdier(en):

     • de gebruikte soort(en)/stam(men) en een motivering indien (een) ander(e) dier(en) dan het albinokonijn worden gebruikt;

     • het aantal dieren van elk geslacht;

     • het gewicht van elk dier aan het begin en het eind van de test;

     • de leeftijd aan het begin van het onderzoek;

     • de herkomst van het/de dier(en), de huisvesting, de voeding enz.

   • Testomstandigheden:

     • de techniek voor de voorbereiding van de plaats waarop het gaasje wordt aangebracht;

     • een gedetailleerde beschrijving van het gebruikte verbandmateriaal en de verbandtechniek;

     • gedetailleerde gegevens over het bereiden, het aanbrengen en het verwijderen van de teststof.

   • Resultaten:

     • een tabel met de score van de irritatie/corrosiereactie voor elk dier op elk observatietijdstip;

     • beschrijvingen van alle waargenomen letsels;

     • een beschrijving in woorden van de aard en de ernst van de waargenomen irritatie of corrosie met eventuele histopathologische bevindingen;

     • een beschrijving van andere schadelijke lokale (bijvoorbeeld ontvetting van de huid) en systemische effecten naast de huidirritatie of corrosie.

   • Bespreking van de resultaten

   • Conclusies

   LITERATUUR

   1. OESO (2014). Guidance document on an Integrated Approach on Testing and Assessment (IATA) for Skin Corrosion and Irritation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 203), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   2. OESO (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28^th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, november 1998.

   3. OESO (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 19), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

      Tabel

      Inschaling van de Huidreacties

      Vorming van erytheem en korsten
      Geen erytheem…	0
      Zeer licht erytheem (nauwelijks waarneembaar)…	1
      Duidelijk gedefinieerd erytheem…	2
      Matig tot ernstig erytheem…	3
      Ernstig erytheem (diep rood) tot korstvorming waardoor de inschaling van erytheem onmogelijk is…	4
      Maximale score: 4
      Vorming van oedeem
      Geen oedeem…	0
      Zeer licht oedeem (nauwelijks waarneembaar)…	1
      Licht oedeem (de randen van het gebied zijn goed zichtbaar door duidelijke zwelling)…	2
      Matig oedeem (ongeveer 1 mm zwelling)…	3
      Ernstig oedeem (meer dan 1 mm zwelling tot buiten het blootstellingsgebied)…	4
      Maximale score: 4
      Om duidelijkheid te krijgen omtrent moeilijk te interpreteren reacties kan histopathologisch onderzoek worden uitgevoerd.

   Aanhangsel

   DEFINITIES

   Chemische stof: een stof of mengsel.

   Huidirritatie: het ontstaan van een omkeerbare beschadiging van de huid na het aanbrengen van een teststof gedurende maximaal 4 uur.

   Huidcorrosie: het ontstaan van een irreversibele beschadiging van de huid, namelijk zichtbare necrose door de epidermis heen in de dermis, na het aanbrengen van een teststof gedurende ten hoogste vier uur. Corrosieve reacties worden gekenmerkt door zweren, bloedingen, bloederige korsten en aan het eind van de observatie na 14 dagen door verkleuring ten gevolge van het verbleken van de huid, stukken huidoppervlak die kaal geworden zijn en littekens. Om twijfelachtig letsel te evalueren moet histopathologie worden overwogen.

   Teststof: elke volgens deze testmethode getest(e) stof of mengsel.

   ”

2. In deel B wordt hoofdstuk B.17 vervangen door:

   IN-VITROGENMUTATIETESTS MET ZOOGDIERCELLEN AAN DE HAND VAN DE GENEN VOOR HPRT EN XPRT

   INLEIDING

   Deze testmethode (TM) is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 476 (2016) van de OESO. Testmethoden worden periodiek herzien in het licht van de wetenschappelijke vooruitgang, veranderende regelgevingsbehoeften en dierenwelzijn. In deze herziene versie van TM B.17. is bijna dertig jaar ervaring met deze test verwerkt. Daarnaast is er een afzonderlijke nieuwe methode ontwikkeld voor in-vitrogenmutatietests met zoogdiercellen aan de hand van het gen voor thymidinekinase. TM B.17. maakt deel uit van een reeks testmethoden op het gebied van de genetische toxicologie. De OESO heeft een document opgesteld met beknopte informatie over genetisch-toxicologische tests en een overzicht van de recente wijzigingen van de OESO-testrichtlijnen voor genetische toxiciteit (1).

   De in-vitrogenmutatietest met zoogdiercellen is bedoeld voor de detectie van genmutaties die door chemische stoffen zijn geïnduceerd. In de cellijnen die in deze tests worden gebruikt, worden voorwaartse mutaties gemeten in reportergenen, met name het endogene gen voor hypoxanthine-phosguanine-fosforibosyltransferase (Hprt in knaagdiercellen, HPRT in menselijke cellen; in deze testmethode samen aangeduid als het Hprt-gen en de HPRT-test) en het xanthine-guanine-fosforibosyltransferase-transgen (gpt) (aangeduid als de XPRT-test). Bij de HPRT- en XPRT-mutatietests worden verschillende spectra van genetische gebeurtenissen gedetecteerd. Afgezien van de mutationele gebeurtenissen die door de HPRT-test worden gedetecteerd (bv. basenpaarsubstituties, leesraammutaties en kleine deleties en inserties) kunnen door de ligging van het gpt-transgen op autosomen mutaties worden gedetecteerd die het gevolg zijn van grote deleties en mogelijk mitotische recombinatie en die niet kunnen worden gedetecteerd door de HPRT-test, omdat het Hprt-gen op het X-chromosoom ligt (2) (3) (4) (5) (6) (7). Voor regelgevingsdoeleinden wordt de XPRT-test op dit moment minder algemeen gebruikt dan de HPRT-test.

   Gebruikte definities worden gegeven in aanhangsel 1.

   INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN BEPERKINGEN

   Bij in vitro uitgevoerde tests moet er meestal een exogene metabole activeringsbron worden gebruikt. Het exogene metabole activeringssysteem kan de omstandigheden in vivo niet volledig nabootsen.

   Er moet goed op worden gelet dat omstandigheden die kunnen leiden tot artefactuele positieve resultaten (d.w.z. mogelijke interactie met het testsysteem), die niet het gevolg zijn van directe interactie tussen de teststoffen en het genetische materiaal van de cel, worden vermeden; zulke omstandigheden zijn onder andere veranderingen in de pH of de osmolaliteit (8) (9) (10), interactie met de bestanddelen van het medium (11) (12) of een te sterke cytotoxiciteit (13). Als de cytotoxiciteit de maximaal aanbevolen cytotoxiciteitsniveaus zoals omschreven in punt 19 overschrijdt, wordt deze als te sterk beschouwd voor de HPRT-test.

   Voordat de testmethode wordt gebruikt op een mengsel om gegevens te genereren voor een beoogd regelgevingsdoel, moet worden nagegaan of, en zo ja, waarom deze methode betrouwbare resultaten oplevert voor dat doel. Zulke overwegingen zijn niet nodig wanneer het testen van het mengsel wettelijk vereist is.

   PRINCIPE VAN DE TEST

   Mutantcellen met een deficiëntie aan Hprt-enzymactiviteit in de HPRT-test of xprt-enzymactiviteit in de XPRT-test zijn resistent voor de cytostatische effecten van de purineanaloog 6-thioguanine (TG). Cellen zonder deficiëntie aan Hprt (in de HPRT-test) of xprt (in de XPRT-test) zijn gevoelig voor TG, waardoor het celmetabolisme wordt geremd en er geen celdeling meer plaatsvindt. Dit betekent dat mutantcellen zich in aanwezigheid van TG kunnen voortplanten en normale cellen, die Hprt (in de HPRT-test) of xprt (in de XPRT-test) bevatten, niet.

   Cellen in suspensie of monolaagculturen worden zowel met als zonder een exogene metabole activeringsbron (zie punt 14) gedurende een geschikte periode (3-6 uur) aan de teststof blootgesteld en vervolgens overgeënt om de cytotoxiciteit te bepalen en fenotypische expressie mogelijk te maken alvorens de mutanten te selecteren (14) (15) (16) (17). De cytotoxiciteit wordt bepaald aan de hand van de relatieve overleving (relative survival of RS), d.w.z. de onmiddellijk na behandeling gemeten kloneringsefficiëntie, gecorrigeerd voor eventueel verlies van cellen gedurende de behandeling, vergeleken met de negatieve controle (zie punt 18 en aanhangsel 2). De behandelde culturen blijven een voldoende lange periode, kenmerkend voor elk celtype, in groeimedium om een vrijwel optimale fenotypische expressie van de geïnduceerde mutaties mogelijk te maken (doorgaans ten minste 7-9 dagen). Na fenotypische expressie wordt de mutantfrequentie bepaald door bekende aantallen cellen te enten in medium met de selecterende stof voor de detectie van mutantkolonies en in medium zonder de selecterende stof voor de bepaling van de kloneringsefficiëntie (levensvatbaarheid). Na een geschikte incubatietijd worden de kolonies geteld. De mutantfrequentie wordt bepaald aan de hand van het aantal mutantkolonies, gecorrigeerd voor de kloneringsefficiëntie op het moment van selecteren van de mutanten.

   BESCHRIJVING VAN DE METHODE

   Voorbereidingen

   Cellen

   Van de bij de HPRT-test en de XPRT-test gebruikte cellen moet worden aangetoond dat ze gevoelig zijn voor chemische mutagenen en een hoge kloneringsefficiëntie, een stabiel karyotype en een stabiele spontane mutantfrequentie hebben. De meest gebruikte cellen voor de HPRT-test zijn onder meer de cellijnen CHO, V79 en CHL van Chinese hamsters, L5178Y-muizenlymfoomcellen en humane TK6-lymfoblastoïdcellen (18) (19). Voor de XPRT-test worden CHO-AS52-cellen gebruikt die het gpt-transgen bevatten (en waarbij deletie van het Hprt-gen heeft plaatsgevonden) (20) (21); vanwege de deletie van het Hprt-gen kan de HPRT-test niet worden uitgevoerd bij AS52-cellen. Gebruik van andere cellijnen moet verantwoord en gevalideerd worden.

   De cellijnen moeten geregeld worden gecontroleerd om na te gaan of het modale aantal chromosomen stabiel is en er geen besmetting met mycoplasma heeft plaatsgevonden (22) (23). Indien er wel een besmetting heeft plaatsgevonden of indien het modale aantal chromosomen gewijzigd is, mogen de cellen niet worden gebruikt. De normale tijd voor de in het testlaboratorium gebruikte celcyclus moet worden vastgesteld en moet overeenkomen met de gepubliceerde celkenmerken. Bovendien moet de spontane mutantfrequentie in de voorraad mastercellen worden gecontroleerd. Als de mutantfrequentie niet aanvaardbaar is moet de voorraad niet worden gebruikt.

   Het is wellicht nodig reeds aanwezige mutantcellen uit de cultuur te verwijderen voordat deze voor de test wordt gebruikt, bv. door te kweken in HAT-medium voor de HPRT-test en MPA voor de XPRT-test (5) (24) (zie aanhangsel 1). De overgebleven cellen kunnen worden gecryopreserveerd en vervolgens ontdooid om als werkvoorraad te worden gebruikt. Net ontdooide werkvoorraad kan voor de test worden gebruikt zodra normale verdubbelingstijden worden bereikt. Bij de uitvoering van de XPRT-test moet de gangbare kweek van AS52-cellen plaatsvinden onder omstandigheden waarbij het behoud van het gpt-transgen gewaarborgd is (20).

   Media en kweekomstandigheden

   Er moet worden gezorgd voor geschikte kweekmedia en incubatieomstandigheden voor de culturen (kweekvaten, vochtige atmosfeer van 5 % CO2 en incubatietemperatuur van 37 °C). De celculturen moeten altijd onder zodanige omstandigheden worden gehouden dat ze in log-fase groeien. Het is vooral belangrijk dat de medium- en kweekomstandigheden zodanig worden gekozen dat de celgroei tijdens de expressieperiode en de kloneringsefficiëntie van zowel de mutantcellen als de gewone cellen optimaal zijn.

   Prepareren van de culturen

   Cellijnen uit stamculturen worden met een zodanige dichtheid in een kweekmedium geënt dat de cellen in suspensies of in monolagen tijdens de behandelingsperiode en de expressieperiode exponentieel zullen blijven groeien (voor cellen die in monolagen groeien, moet bijvoorbeeld samenvloeiing worden voorkomen).

   Metabole activering

   Exogene metabole activeringssystemen moeten worden gehanteerd bij het gebruik van cellen met ontoereikende endogene metabole capaciteit. Het meest gebruikte systeem, dat als standaard wordt aanbevolen, tenzij anders wordt gemotiveerd, is een post-mitochondriale fractie aangevuld met een cofactor (S9), verkregen uit de lever van knaagdieren (doorgaans ratten) die zijn behandeld met enzym-inducerende stoffen als Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28) of een combinatie van fenobarbiton en β-naftoflavon (29) (30) (31) (32). De laatste combinatie druist niet in tegen het Verdrag van Stockholm inzake persistente organische verontreinigende stoffen (33). Bovendien is aangetoond dat zij even effectief is als Aroclor 1254 voor de inducering van oxidasen met gemengde functie (29) (31). De S9-fractie wordt meestal gebruikt bij een concentratie van 1 tot 2 % (v/v), maar mag worden verhoogd tot 10 % (v/v) in het uiteindelijke testmedium. De keuze van het type en de concentratie van het exogene metabole activeringssysteem dat of de metabole inductor die wordt gebruikt, kan worden beïnvloed door de klasse van de te testen stoffen (34) (35) (36).

   Teststofbereiding

   Vaste teststoffen moeten in geschikte oplosmiddelen worden bereid en eventueel vóór de behandeling van de cellen worden verdund (zie punt 16). Vloeibare teststoffen kunnen direct aan het testsysteem worden toegevoegd en/of worden verdund vóór de behandeling van het testsysteem. Bij het testen van gassen of vluchtige teststoffen moeten geschikte aanpassingen van de standaardprotocollen worden gevolgd, zoals de behandeling in gesloten kweekvaten (37) (38). Preparaten van de teststof moeten worden bereid vlak vóór de behandeling, tenzij met stabiliteitsgegevens is aangetoond dat bewaren van het preparaat aanvaardbaar is.

   TESTOMSTANDIGHEDEN

   Oplosmiddelen

   Het oplosmiddel wordt zo gekozen dat het de oplosbaarheid van de te testen chemische stoffen vergroot zonder een negatieve invloed te hebben op het verloop van de test, bv. door veranderingen in de celgroei, aantasting van de integriteit van de teststof, reacties met kweekvaten, belemmering van het metabole activeringssysteem. Het wordt aanbevolen waar mogelijk eerst het gebruik van een waterig oplosmiddel (of kweekmedium) te overwegen. Gangbare oplosmiddelen zijn bijvoorbeeld water en dimethylsulfoxide. Organische oplosmiddelen mogen in de regel de 1 % (v/v) en waterige oplosmiddelen (fysiologisch zout of water) de 10 % (v/v) in het uiteindelijke behandelingsmedium niet overschrijden. Als de gebruikte oplosmiddelen geen gangbare oplosmiddelen zijn (bv. ethanol of aceton), moeten gegevens worden verstrekt waaruit blijkt dat ze verenigbaar zijn met de teststof en het testsysteem, en dat zij geen genetische toxiciteit vertonen bij de gebruikte concentratie. Als die gegevens ontbreken, is het belangrijk ook onbehandelde controles toe te voegen (zie aanhangsel 1) om aan te tonen dat het gekozen oplosmiddel geen schadelijke of mutagene effecten induceert.

   Meting van cytotoxiciteit en keuze van blootstellingsconcentraties

   Bij de bepaling van de hoogste te testen concentratie van de teststof moeten concentraties worden vermeden die kunnen leiden tot artefactuele positieve reacties, zoals reacties die bovenmatige cytotoxiciteit (zie punt 20) voortbrengen, neerslag in het kweekmedium (zie punt 21) of uitgesproken wijzigingen in pH of osmolaliteit (zie punt 5). Indien de teststof op het ogenblik van toevoeging een uitgesproken wijziging in de pH van het medium veroorzaakt, kan de pH worden aangepast door het uiteindelijke behandelingsmedium te bufferen zodat artefactuele positieve reacties worden vermeden en passende kweekomstandigheden in stand worden gehouden.

   De concentraties worden gekozen op basis van de cytotoxiciteit en andere overwegingen (zie punten 20-22). Hoewel de evaluatie van cytotoxiciteit in een eerste test nuttig kan zijn om de in het hoofdexperiment te gebruiken concentraties beter te kunnen vaststellen, is een eerste test niet vereist. Ook als er wel een voorevaluatie van cytotoxiciteit wordt uitgevoerd, moet in het hoofdexperiment nog steeds voor elke cultuur de cytotoxiciteit worden gemeten. De cytotoxiciteit moet worden beoordeeld aan de hand van de RS, d.w.z. de kloneringsefficiëntie (cloning efficiency of CE) van onmiddellijk na de behandeling uitgeplate cellen, gecorrigeerd voor eventueel verlies van cellen gedurende de behandeling, op basis van het aantal cellen, vergeleken met de gecorrigeerde kloneringsefficiëntie in negatieve controles (waaraan een overleving van 100 % wordt toegekend) (zie aanhangsel 2 voor de formule).

   Er moeten ten minste vier testconcentraties (exclusief het oplosmiddel en positieve controles) die voldoen aan de aanvaardbaarheidscriteria (passende mate van cytotoxiciteit, aantal cellen enz.), worden geëvalueerd. Hoewel het gebruik van duploculturen raadzaam is, kan bij elke geteste concentratie één behandelde cultuur worden gebruikt, maar ook duploculturen. De resultaten verkregen in de onafhankelijke duploculturen bij een gegeven concentratie moeten afzonderlijk worden gerapporteerd, maar kunnen voor de gegevensanalyse worden gepoold (17). Voor teststoffen die weinig of geen cytotoxiciteit vertonen, zijn intervallen tussen de testconcentraties van ongeveer een factor 2 tot 3 doorgaans passend. Wanneer er cytotoxiciteit optreedt, moeten de geselecteerde testconcentraties een interval bestrijken van een concentratie waarbij cytotoxiciteit optreedt tot concentraties waarbij er matige en geen of vrijwel geen cytotoxiciteit is. Veel teststoffen vertonen een steile concentratie-responscurve, en om het hele cytotoxiciteitsbereik te bestrijken of in detail de concentratie-responsrelatie te bestuderen zullen mogelijk dichter bij elkaar liggende concentraties en meer dan vier concentraties moeten worden gebruikt, in het bijzonder in situaties waarin een herhalingsexperiment vereist is (zie punt 43). Vooral bij gebruik van één cultuur kan het van belang zijn om meer dan vier concentraties te gebruiken.

   Als de maximale concentratie is gebaseerd op cytotoxiciteit, moet voor de hoogste concentratie worden gestreefd naar een RS tussen 20 en 10 %. Bij de interpretatie van positieve resultaten moet ervoor worden gezorgd dat deze niet alleen bij 10 % RS of lager worden gevonden (punt 43).

   Voor slecht oplosbare teststoffen die bij concentraties onder de oplosbaarheidsgrens niet cytotoxisch zijn, moet de hoogste geanalyseerde concentratie troebelheid of een met het oog of met behulp van een omgekeerde microscoop aan het eind van de behandeling met de teststof zichtbaar neerslag opleveren. Zelfs indien cytotoxiciteit optreedt boven de oplosbaarheidsgrens, is het raadzaam de test uit te voeren bij slechts één concentratie die troebelheid of een zichtbaar neerslag oplevert, omdat het neerslag kan leiden tot artefactuele effecten. Bij de concentratie die neerslag oplevert, moet ervoor worden gezorgd dat het neerslag de uitvoering van de test niet verstoort. Het kan nuttig zijn om voorafgaand aan het experiment de oplosbaarheid in het kweekmedium te bepalen.

   Indien geen neerslag of beperkende cytotoxiciteit wordt waargenomen, moet de hoogste testconcentratie overeenkomen met de laagste van de volgende waarden: 10 mM, 2 mg/ml of 2 μl/ml (39) (40). Wanneer de samenstelling van de teststof niet vastgesteld is, bv. in geval van een stof van onbekende of variabele samenstelling, complexe reactieproducten of biologisch materiaal (d.w.z. Chemical Substances of Unknown or Variable Composition of UVCB’s) (41), milieu-extracten enz., moet de hoogste concentratie bij het ontbreken van voldoende cytotoxiciteit mogelijk hoger zijn (bv. 5 mg/ml) om de concentratie van elk van de componenten te verhogen. Er zij echter opgemerkt dat deze eisen voor geneesmiddelen voor menselijk gebruik anders kunnen zijn (42).

   Controles

   Voor elk experimentele omstandigheid dienen gelijktijdige negatieve controles (zie punt 16) in het experiment te worden opgenomen, waaraan uitsluitend het oplosmiddel wordt toegediend en die verder op dezelfde manier worden behandeld als de culturen met teststof.

   Gelijktijdige positieve controles zijn nodig om aan te tonen dat het laboratorium in staat is om onder de omstandigheden van het gebruikte testprotocol en de doeltreffendheid van het exogene metabole activeringssysteem, indien van toepassing, mutagenen te identificeren. Voorbeelden van voor positieve controle gebruikte stoffen worden gegeven in tabel 1 hieronder. Er kunnen ook alternatieve positieve controlestoffen worden gebruikt, indien dat wordt gemotiveerd. Omdat in-vitrogenotoxiciteitstests op zoogdiercellen voldoende gestandaardiseerd zijn, kunnen behandelingen met en zonder exogene metabole activering worden toegepast, met alleen een positieve controle waarvoor metabole activering nodig is. In dat geval zal deze ene positievecontrolerespons zowel de activiteit van het metabole activeringssysteem als de gevoeligheid van het testsysteem aantonen. Elke positieve controle moet worden gebruikt bij een of meer concentraties waarvoor een reproduceerbare en detecteerbare stijging ten opzichte van het achtergrondniveau kan worden verwacht, om de gevoeligheid van het testsysteem aan te tonen, en de respons mag niet in het gedrang komen door een mate van cytotoxiciteit die de in deze testmethode gespecificeerde grenzen overschrijdt (zie punt 20).

   Tabel 1

   Aanbevolen referentiestoffen voor het beoordelen van de bekwaamheid van laboratoria en voor het selecteren van positieve controles

   Metabole activering	Locus	Stof en CAS-nr.
   Zonder exogene metabole activering	Hprt	Ethylmethaansulfonaat [CAS-nr. 62-50-0] Ethylnitrosoureum [CAS-nr. 759-73-9] 4-Nitrochinoline-1-oxide [CAS-nr. 56-57-5]
   	xprt	Streptonigrine [CAS-nr. 3930-19-6] Mitomycine C [CAS-nr. 50-07-7]
   Met exogene metabole activering	Hprt	3-Methylcholantreen [CAS-nr. 56-49-5] 7,12-Dimethylbenzantraceen [CAS-nr. 57-97-6] Benzo[a]pyreen [CAS-nr. 50-32-8]
   	xprt	Benzo[a]pyreen [CAS-nr. 50-32-8]

   PROCEDURE

   Behandeling met teststof

   Delende cellen worden zowel met als zonder metabool activeringssysteem met de teststof behandeld. De blootstelling moet gedurende een geschikte periode worden uitgevoerd (meestal is 3 tot 6 uur voldoende).

   Het minimale aantal cellen dat voor elke testcultuur (controle en behandeld) in elke fase van de test wordt gebruikt, moet worden gekozen op basis van de spontane mutantfrequentie. Een vuistregel is om voldoende cellen te behandelen en over te enten om het aantal spontane mutanten in elke cultuur in alle fasen van de test op 10 te houden (17). De spontane mutantfrequentie ligt meestal tussen de 5 en 20 × 10^-6. Met een spontane mutantfrequentie van 5 × 10^-6 en om ook voor de culturen die worden behandeld met concentraties die tijdens de behandeling 90 % cytotoxiciteit veroorzaken (10 % RS), het aantal spontane mutanten voldoende te houden (10 of meer), moeten er ten minste 20 × 10⁶ cellen worden behandeld. Bovendien moeten er tijdens de expressieperiode voldoende cellen (nooit minder dan 2 miljoen) worden gekweekt en uitgeplaat voor het selecteren van de mutanten (17).

   Fenotypische expressietijd en meting van de mutantfrequentie

   Na de behandelperiode worden de cellen gekweekt om expressie van het mutantfenotype mogelijk te maken. Doorgaans zijn minimaal 7 tot 9 dagen voldoende voor een vrijwel optimale fenotypische expressie van de geïnduceerde Hprt- en xprt-mutanten (43) (44). Tijdens deze periode worden de cellen regelmatig overgeënt om een exponentiële groei te behouden. Na de fenotypische expressie worden de cellen opnieuw uitgeplaat in medium met en zonder de selecterende stof (6-thioguanine) om respectievelijk het aantal mutanten en de kloneringsefficiëntie op het moment van selecteren te bepalen. Hiervoor kunnen schaaltjes worden gebruikt voor monolaagculturen of microtiterplaten voor cellen in suspensie. Voor het selecteren van de mutanten moeten de cellen worden uitgeplaat met een zodanige dichtheid dat de mutanten optimaal geïsoleerd kunnen worden (d.w.z. dat metabole coöperatie wordt vermeden) (17). De platen worden zo lang geïncubeerd als nodig is voor een optimale koloniegroei (bv. 7-12 dagen), waarna de kolonies worden geteld. De mutantfrequentie wordt bepaald aan de hand van het aantal mutantkolonies, gecorrigeerd voor de kloneringsefficiëntie op het moment van selecteren van de mutanten (zie aanhangsel 2 voor formules).

   Bekwaamheid van het laboratorium

   Om voldoende ervaring met de test op te bouwen vooraleer wordt overgegaan tot routinematig gebruik, moet het laboratorium een reeks experimenten hebben verricht met positieve controlestoffen die via verschillende mechanismen werken (ten minste één die actief is met en één die actief is zonder metabole activering, gekozen uit de stoffen die zijn opgesomd in tabel 1) en met verschillende negatieve controles (met verschillende oplosmiddelen/vehicula). Deze positieve en negatieve controleresponsen moeten in overeenstemming zijn met de literatuur. Dit geldt niet voor laboratoria die ervaring hebben, d.w.z. die beschikken over referentiegegevens uit het verleden zoals omschreven in de punten 30 tot en met 33.

   Er moet er een selectie van positieve controlestoffen (zie tabel 1 in punt 25) zowel met als zonder metabole activering worden onderzocht om te bewijzen dat het laboratorium bekwaam is in het detecteren van mutagene chemische stoffen, de doeltreffendheid van het metabole-activeringssysteem te bepalen en de geschiktheid van de celgroeiomstandigheden tijdens behandeling, fenotypische expressie en selectie van de mutanten en de geschiktheid van de scoringsprocedures aan te tonen. Er moet een bereik van concentraties van de geselecteerde stoffen worden gekozen dat reproduceerbare en concentratiegerelateerde stijgingen tot boven het achtergrondniveau oplevert, om de gevoeligheid en het dynamisch bereik van het testsysteem aan te tonen.

   Controlegegevens uit het verleden

   Het laboratorium stelt vast:

   • een historisch bereik en historische spreiding voor de positieve controles;

   • een historisch bereik en historische spreiding voor de negatieve controles (met onbehandelde controlestoffen of oplosmiddelen).

   Wanneer voor het eerst gegevens worden verkregen voor een verdeling van negatieve controles uit het verleden, moeten gelijktijdige negatieve controles consistent zijn met gepubliceerde controlegegevens (22). Naarmate meer gegevens uit experimenten aan de controlespreiding worden toegevoegd, dienen gelijktijdige negatieve controles idealiter binnen de controlegrens van 95 % voor die spreiding te vallen (17) (45) (46).

   De databank met gegevens over negatieve controles uit het verleden van het laboratorium moet aanvankelijk worden samengesteld op basis van minimaal 10 experimenten, maar bestaat bij voorkeur uit ten minste 20 experimenten die onder vergelijkbare experimentele omstandigheden werden uitgevoerd. Laboratoria dienen methoden voor kwaliteitscontrole, zoals regelkaarten (bv. C-kaart of X-kaart (47)), te gebruiken om na te gaan hoe variabel hun gegevens over positieve en negatieve controles zijn en om aan te tonen dat zij de methodologie „onder controle” hebben (46). Verdere aanbevelingen voor het samenstellen en gebruiken van de gegevens uit het verleden (d.w.z. criteria voor het opnemen van gegevens in en het uitsluiten ervan uit de historische gegevens en de aanvaardbaarheidscriteria voor een gegeven experiment) zijn te vinden in de literatuur (45).

   Negatieve controlegegevens moeten bestaan uit de mutantfrequenties van enkelvoudige of bij voorkeur duploculturen zoals beschreven in punt 23. Gelijktijdige negatieve controles liggen idealiter binnen de 95 %-controlegrenzen van de verdeling van de databank met historische negatieve controlegegevens van het laboratorium (17) (45) (46). Wanneer gegevens van gelijktijdige negatieve controles buiten de 95 %-controlegrens vallen, kan opneming ervan in de historische controleverdeling toch aanvaardbaar zijn zolang deze gegevens geen extreme uitschieters zijn en er bewijs is dat het testsysteem „onder controle” is (zie hierboven) en er geen bewijs is van technisch of menselijk falen.

   Bij eventuele wijzigingen in het experimentele protocol moet rekening worden gehouden met hun consistentie met de bestaande databanken met historische controlegegevens van het laboratorium. Eventuele grote inconsistenties moeten leiden tot de oprichting van een nieuwe databank met historische controlegegevens.

   GEGEVENS EN RAPPORTAGE

   Presentatie van de resultaten

   In de presentatie van de resultaten moeten alle gegevens worden opgenomen die nodig zijn om de cytotoxiciteit (uitgedrukt als RS) te berekenen. De gegevens voor zowel behandelde als controleculturen moeten het volgende bevatten: het aantal cellen aan het eind van de behandeling, het aantal onmiddellijk na behandeling uitgeplate cellen en het aantal kolonies (of het aantal putjes zonder kolonies voor de microtiterplaatmethode). De RS voor elke cultuur moet worden uitgedrukt als percentage van de gelijktijdige oplosmiddelcontrole (zie voor definities aanhangsel 1).

   In de presentatie van de resultaten moeten bovendien alle gegevens worden opgenomen die nodig zijn om de mutantfrequentie te berekenen. De gegevens voor zowel behandelde als controleculturen moeten het volgende bevatten: 1) het aantal uitgeplate cellen met en zonder selecterende stof (op het moment dat de cellen worden uitgeplaat voor het selecteren van de mutanten), en 2) het aantal getelde kolonies (of het aantal putjes zonder kolonies voor de microtiterplaatmethode) van de platen met en zonder selecterende stof. De mutantfrequentie wordt bepaald aan de hand van het aantal mutantkolonies (op de platen met selecterende stof), gecorrigeerd voor de kloneringsefficiëntie (van de platen zonder selecterende stof). De mutantfrequentie moet worden uitgedrukt als het aantal mutantcellen per miljoen levensvatbare cellen (zie voor definities aanhangsel 1).

   De gegevens moeten voor elke cultuur apart worden verstrekt. Daarnaast moet een overzicht van alle gegevens in tabelvorm worden gegeven.

   Aanvaardbaarheidscriteria

   Aanvaarding van een test geschiedt aan de hand van de volgende criteria:

   • toevoeging van de gelijktijdige negatieve controle aan de databank met historische negatieve controlegegevens van het laboratorium zoals beschreven in punt 33 wordt aanvaardbaar geacht;

   • gelijktijdige positieve controles (zie punt 24) moeten reacties induceren die verenigbaar zijn met de reacties in de databank met historische positieve controlegegevens en moeten een statistisch significante toename opleveren vergeleken met de gelijktijdige negatieve controle;

   • er zijn twee experimentele omstandigheden (d.w.z. met en zonder metabole activering) onderzocht, tenzij één tot positieve resultaten leidde (zie punt 25);

   • er kan een afdoend aantal cellen en concentraties worden geanalyseerd (punten 25, 26 en 19);

   • de criteria voor de selectie van de hoogste concentratie zijn consistent met de criteria beschreven in de punten 20, 21 en 22.

   Beoordeling en interpretatie van resultaten

   Indien aan alle aanvaardbaarheidscriteria is voldaan, wordt de teststof als duidelijk positief beschouwd als in een of meer van de onderzochte experimentele omstandigheden:

   • ten minste één van de testconcentraties een statistisch significante toename vertoont vergeleken met de gelijktijdige negatieve controle;

   • de toename concentratiegerelateerd is bij evaluatie met een geschikte trendtoets;

   • een of meer van de resultaten buiten de verdeling van de historische negatieve controlegegevens vallen (bv. op Poisson-verdeling gebaseerde 95 %-controlegrens; zie punt 33).

   Wanneer aan al deze criteria is voldaan, wordt de teststof in staat geacht in gekweekte zoogdiercellen in dit testsysteem genmutaties te induceren. Aanbevelingen voor de meest geschikte statistische methoden zijn te vinden in de literatuur (46) (48).

   Indien aan alle aanvaardbaarheidscriteria is voldaan, wordt een teststof als duidelijk negatief beschouwd als in alle onderzochte experimentele omstandigheden:

   • geen van de testconcentraties een statistisch significante toename vertoont vergeleken met de gelijktijdige negatieve controle;

   • er geen concentratiegerelateerde toename is bij evaluatie met een geschikte trendtoets;

   • alle resultaten binnen de verdeling van de historische negatieve controlegegevens vallen (bv. op Poisson-verdeling gebaseerde 95 %-controlegrens; zie punt 33).

   De teststof wordt dan niet in staat geacht in gekweekte zoogdiercellen in dit testsysteem genmutaties te induceren.

   Een duidelijk positieve of negatieve reactie behoeft niet te worden bevestigd.

   In gevallen waarin de reactie noch duidelijk negatief noch duidelijk positief is zoals hierboven beschreven, of om de biologische relevantie van een resultaat te helpen vaststellen, moeten de gegevens door een deskundige en/of nader onderzoek worden beoordeeld. Het uitvoeren van een herhalingsexperiment onder mogelijk aangepaste experimentele omstandigheden (bv. concentratie-intervallen, andere omstandigheden bij metabole activering (d.w.z. S9-concentratie of S9-herkomst)) kan nuttig zijn.

   In zeldzame gevallen zal op basis van de gegevens, zelfs na nader onderzoek, niet kunnen worden geconcludeerd dat de resultaten positief of negatief zijn. De reactie op de teststof moet dan als moeilijk te interpreteren worden beschouwd (geïnterpreteerd als even waarschijnlijk positief als negatief).

   Testverslag

   In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

   • Teststof:

     • bron, partijnummer, uiterste gebruiksdatum, indien beschikbaar;

     • stabiliteit van de teststof, indien bekend;

     • oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel, indien bekend;

     • meting van pH, osmolaliteit en neerslag in het kweekmedium waaraan de teststof werd toegevoegd, indien van toepassing.

   • Stof die uit één component bestaat:

     • fysisch voorkomen, oplosbaarheid in water en aanvullende relevante fysisch-chemische eigenschappen;

     • chemische identificatiegegevens, zoals IUPAC- of CAS-naam, CAS-nummer, SMILES- of InChI-code, structuurformule, zuiverheid, chemische identiteit van onzuiverheden, indien van toepassing en praktisch haalbaar enz.

   • Stof die uit meerdere componenten bestaat, UVCB’s en mengsels:

     • voor zover mogelijk, karakterisering aan de hand van chemische identiteit (zie hierboven), kwantitatief voorkomen en relevante fysisch-chemische eigenschappen van de bestanddelen.

   • Oplosmiddel:

     • motivering van de keuze van het oplosmiddel;

     • percentage oplosmiddel in het uiteindelijke kweekmedium.

   • Cellen:

   • Voor de voorraadculturen van het laboratorium:

     • aard en herkomst van de cellijnen;

     • aantal overentingen, indien beschikbaar, en geschiedenis in het laboratorium;

     • kenmerken van het karyotype en/of modaal aantal chromosomen;

     • methoden om de celculturen in leven te houden;

     • afwezigheid van mycoplasma;

     • verdubbelingstijden.

   • Testomstandigheden:

     • achtergrond voor de keuze van de concentraties en het aantal culturen, bijvoorbeeld gegevens over de cytotoxiciteit en beperkte oplosbaarheid;

     • samenstelling van het medium, CO2-concentratie, vochtigheidsgraad;

     • concentratie van de teststof uitgedrukt als uiteindelijke concentratie in het kweekmedium (bv. μg of mg/ml of mM van kweekmedium);

     • toegevoegde concentratie (en/of volume) van het oplosmiddel en de teststof in het kweekmedium;

     • incubatietemperatuur;

     • incubatietijd;

     • duur van de behandeling;

     • celdichtheid bij de behandeling;

     • aard en samenstelling van het metabool activeringssysteem (bron van S9, methode voor de bereiding van de S9-mix, de concentratie of het volume van de S9-mix en S9 in het uiteindelijke kweekmedium, kwaliteitscontroles van S9); positieve en negatieve controlestoffen, uiteindelijke concentraties voor elke behandelingsomstandigheid;

     • duur van de expressieperiode (met vermelding van het aantal geënte cellen en schema’s voor enting en overenting, indien van toepassing;

     • identiteit en concentratie van de selecterende stof;

     • criteria voor de aanvaardbaarheid van de tests;

     • methoden die zijn gebruikt om het aantal levensvatbare en mutantcellen te bepalen;

     • methoden die zijn gebruikt om de cytotoxiciteit te meten;

     • eventuele aanvullende informatie die betrekking heeft op de cytotoxiciteit en gebruikte methode;

     • duur van de incubatietijden na uitplating;

     • criteria om te bepalen of het resultaat positief, negatief of onduidelijk is;

     • gebruikte methoden voor het bepalen van de pH, osmolaliteit en neerslag.

   • Resultaten:

     • aantal behandelde cellen en aantal overgeënte cellen voor elke cultuur;

     • metingen van de cytotoxiciteit en eventuele andere waarnemingen;

     • tekenen van neerslag en tijdstip van de bepaling;

     • aantal uitgeplate cellen in selectief en niet-selectief medium;

     • aantal kolonies in niet-selectief medium en aantal resistente kolonies in selectief medium en bijbehorende mutantfrequenties;

     • indien mogelijk het verband tussen concentratie en respons;

     • gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde negatieve (oplosmiddel) en positieve controles (concentraties en oplosmiddelen);

     • gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve (oplosmiddel) en positieve controles met vermelding van spreiding, gemiddelde en standaardafwijking en betrouwbaarheidsinterval (bv. 95 %), alsook het aantal gegevens;

     • statistische analyses (voor afzonderlijke culturen en gepoolde duplo’s indien van toepassing), en eventuele p-waarden.

   • Bespreking van de resultaten.

   • Conclusie

   LITERATUUR

   1. OESO (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, nr. 234, OESO, Parijs.

   2. Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York.

   3. Chu E.H.Y. and Malling H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro , Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306-1312.

   4. Moore M.M., Harrington-Brock K., Doerr C.L. and Dearfield K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394-403.

   5. Aaron C.S. and Stankowski Jr. L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res.,223, 121-128.

   6. Aaron C.S., Bolcsfoldi G., Glatt H.R., Moore M., Nishi Y., Stankowski L., Theiss J. and Thompson E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res.,312, 235-239.

   7. Li A.P., Gupta R.S., Heflich R.H. and Wasson J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program.Mutation Res., 196, 17-36.

   8. Scott D., Galloway S.M., Marshall R.R., Ishidate M., Brusick D., Ashby J. and Myhr B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-204.

   9. Morita T., Nagaki T., Fukuda I. and Okumura K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297-305.

   10. Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886.

   11. Nesslany F., Simar-Meintieres S., Watzinger M., Talahari I. and Marzin D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutation Res., 49, 439-452.

   12. Long L.H., Kirkland D., Whitwell J. and Halliwell B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634, 177-183.

   13. Kirkland D., Aardema M., Henderson L., and Müller L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 5841-256.

   14. Li A.P., Carver J.H., Choy W.N., Hsie A.W., Gupta R.S., Loveday K.S., O’Neill J.P., Riddle J.C., Stankowski L.F. Jr. and Yang L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135-141.

   15. Liber H.L., Yandell D.W. and Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.

   16. Stankowski L.F. Jr., Tindall K.R. and Hsie A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.

   17. Arlett C.F., Smith D.M., Clarke G.M., Green M.H.L., Cole J., McGregor D.B. and Asquith J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Eds.), CambridgeUniversity Press, pp. 66-101.

   18. Hsie A.W., Casciano D.A., Couch D.B., Krahn D.F., O’Neill J.P., and Whitfield B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193-214.

   19. Li A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165-175.

   20. Tindall K.R., Stankowski Jr., L.F., Machanoff R., and Hsie A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411-1415.

   21. Hsie A. W., Recio L., Katz D. S., Lee C. Q., Wagner M., and Schenley R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24): 9616–9620.

   22. Lorge E., Moore M., Clements J., Donovan M. O., Honma M., Kohara A., Van Benthem J., Galloway S., Armstrong M.J., Thybaud V., Gollapudi B., Aardema M., Kim J., Sutter A., Kirkland D.J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Manuscript in voorbereiding).

   23. Coecke S., Balls M., Bowe G., Davis J., Gstraunthaler G., Hartung T., Hay R., Merten O.W., Price A., Schechtman L., Stacey G. and Stokes W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, 261-287.

   24. Rosen M.P., San R.H.C. and Stich H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. 8, 299-305.

   25. Natarajan A.T., Tates A.D, Van Buul P.P.W., Meijers M. and de Vogel N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83-90.

   26. Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N. and Mazzaccaro A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.

   27. Ames B.N., McCann J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.

   28. Maron D.M. and Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173, 215.

   29. Elliott B.M., Combes R.D., Elcombe C.R., Gatehouse D.G., Gibson G.G., Mackay J.M. and Wolf R.C. (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175-177.

   30. Matsushima T., Sawamura M., Hara K. and Sugimura T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres F.J., Fouts J.R., Bend J.R. and Philpot R.M. (Eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

   31. Ong T.-m., Mukhtar M., Wolf C.R. and Zeiger E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.

   32. Johnson T.E., Umbenhauer D.R. and Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.

   33. UNEP. (2001). Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Beschikbaar op: [http://www.pops.int.html].

   34. Tan E.-L. and Hsie A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147-156.

   35. O’Neill J.P., Machanoff R., San Sebastian J.R., Hsie A.W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7-18.

   36. Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation, 4, 7-18.

   37. Krahn D.F., Barsky F.C. and McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds.) Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103.

   38. Zamora P.O., Benson J.M., Li A.P. and Brooks A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen.,5, 795-801.

   39. OESO (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). Op aanvraag verkrijgbaar bij de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling.

   40. Brookmire L., Chen J.J. and Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation, 54, 36-43.

   41. EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances,

   42. USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Beschikbaar op: [https://federalregister.gov/a/2012-13774].

   43. O’Neill J.P. and Hsie A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109-118.

   44. Chiewchanwit T., Ma H., El Zein R., Hallberg L., and Au W.W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutation, Res., 1335(2):121-8.

   45. Hayashi M., Dearfield K., Kasper P., Lovell D., Martus H.J., and Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation,Res., 723, 87-90.

   46. OESO (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 199), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   47. Richardson C., Williams D.A., Allen J.A., Amphlett G., Chanter D.O., and Phillips B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (Ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.

   48. Fleiss J. L., Levin B., and Paik M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, Third Edition, New York: John Wiley & Sons.

   Aanhangsel 1

   DEFINITIES

   Chemische stof:
   een stof of een mengsel.
   Concentraties:
   verwijzen naar uiteindelijke concentraties van de teststof in het kweekmedium.
   Cytotoxiciteit:
   voor de bepalingen bestreken in deze testmethode is cytotoxiciteit gelijkgesteld aan een vermindering van de relatieve overleving van de behandelde cellen vergeleken met de negatieve controle (zie het desbetreffende punt).
   Fenotypische expressietijd:
   de tijd na behandeling waarin de genetische verandering gefixeerd wordt in het genoom en ongewijzigde genproducten verdwijnen zodat het fenotypische kenmerk verandert.
   Genotoxisch:
   een algemene term die alle typen DNA- of chromosoombeschadiging omvat, waaronder DNA-breuken, adductherschikkingen, mutaties, chromosoomafwijkingen en aneuploïdie. Niet alle soorten genotoxische effecten leiden tot mutaties of stabiele chromosoombeschadiging.
   HAT-medium:
   medium dat Hypoxanthine, Aminopterine en Thymidine bevat en dat wordt gebruikt voor het verwijderen van Hprt-mutanten.
   Kloneringsefficiëntie:
   percentage van in lage dichtheid uitgeplate cellen die in staat zijn om uit te groeien tot een kolonie die geteld kan worden.
   Mitotische recombinatie:
   recombinatie tussen homologe chromatiden tijdens de mitose, die mogelijk leidt tot de inductie van breuken in het dubbelstrengig DNA of verlies van heterozygotie.
   MPA-medium:
   medium dat Xanthine, Adenine, Thymidine, Aminopterine en Mycofenolinezuur bevat en dat wordt gebruikt voor het verwijderen van xprt-mutanten.
   Mutageen:
   produceert een erfelijke wijziging van DNA-basenpaarsequentie(s) in genen of van de structuur van chromosomen (chromosoomafwijkingen).
   Mutagenen met basenpaarvervanging:
   chemische stoffen die vervanging van een of meer basenparen in het DNA veroorzaken.
   Mutagenen met leesraamverschuiving:
   chemische stoffen die invoeging of deletie van een of meer basenparen in het DNA-molecuul veroorzaken.
   Mutantfrequentie (MF):
   het aantal waargenomen mutantkolonies gedeeld door het aantal uitgeplate cellen in het selectieve medium, gecorrigeerd voor de kloneringsefficiëntie (of levensvatbaarheid) op het moment van selecteren.
   Onbehandelde controle:
   culturen die geen behandeling ondergaan (d.w.z. noch teststof noch oplosmiddel), maar gelijktijdig met en op dezelfde wijze worden verwerkt als de culturen die de teststof ontvangen.
   Oplosmiddelcontrole:
   algemene term om de controleculturen aan te duiden die uitsluitend het oplosmiddel ontvangen dat wordt gebruikt om de teststof op te lossen.
   Relatieve overleving (RS):
   wordt gebruikt als maat voor behandelingsgerelateerde cytotoxiciteit. De RS is de kloneringsefficiëntie (CE) van onmiddellijk na de behandeling uitgeplate cellen, gecorrigeerd voor eventueel verlies van cellen gedurende de behandeling, vergeleken met de kloneringsefficiëntie in negatieve controles (waaraan een overleving van 100 % wordt toegekend).
   S9-leverfractie:
   supernatant van leverhomogenaat na centrifugering bij 9 000 g, d.w.z. ruw leverextract.
   S9-mix:
   mix van de S9-leverfractie en cofactoren die nodig zijn voor de metabole enzymactiviteit.
   Teststof:
   alle volgens deze testmethode geteste stoffen of mengsels.
   UVCB:
   chemische stoffen waarvan de samenstelling niet bekend of variabel is, complexe reactieproducten of biologische materialen.
   Voorwaartse mutatie:
   een genmutatie van het oudertype naar de mutantvorm die leidt tot wijziging of verlies van de enzymactiviteit of de functie van het gecodeerde eiwit.

   Aanhangsel 2

   FORMULES VOOR DE BEOORDELING VAN CYTOTOXICITEIT EN MUTANTFREQUENTIE

   De cytotoxiciteit wordt beoordeeld aan de hand van de relatieve overleving, d.w.z. de kloneringsefficiëntie (CE) van onmiddellijk na de behandeling uitgeplate cellen, gecorrigeerd voor eventueel verlies van cellen gedurende de behandeling, vergeleken met de gecorrigeerde kloneringsefficiëntie in negatieve controles (waaraan een overleving van 100 % wordt toegekend) (zie formule voor RS hieronder).

   De gecorrigeerde CE voor een met een teststof behandelde cultuur wordt berekend als:

   Gecorriseerde CE = Aantal cellen aan het einde van de behandeling Aantal cellen aan het begin van de behandeling

   De RS voor een met een teststof behandelde cultuur wordt berekend als:

   RS = Gecorrigeerde CE in behandelde cultuur Gecorrigeerde CE in de oplosmiddelcontrole × 100

   De mutantfrequentie is de kloneringsefficiëntie van mutantkolonies in selectief medium gedeeld door de kloneringsefficiëntie in niet-selectief medium gemeten voor dezelfde cultuur op het moment van selecteren.

   Mutantfrequentie = Kloneringsefficiëntie van mutantkolonies in selectief medium Kloneringsefficiëntie in niet-selectief medium

   Wanneer voor de kloneringsefficiëntie platen worden gebruikt:

   • CE = aantal kolonies / aantal uitgeplate cellen.

   Wanneer voor de kloneringsefficiëntie microtiterplaten worden gebruikt:

   • Het aantal kolonies per putje in microtiterplaten volgt een Poisson-verdeling.

   • CE = -LnP(0) / aantal uitgeplate cellen per putje

   • Waarbij -LnP(0) het waarschijnlijke aantal lege putjes is van de geënte putjes en wordt beschreven door de volgende formule:

   • LnP(0)= -Ln (aantal lege putjes / aantal geënte putjes).

   ”

3. In deel B wordt hoofdstuk B.22 vervangen door:

   ONDERZOEK NAAR DOMINANTE LETALE MUTATIES BIJ KNAAGDIEREN

   INLEIDING

   Deze testmethode (TM) is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 478 (2016) van de OESO. Testmethoden worden periodiek herzien in het licht van de wetenschappelijke vooruitgang, veranderende regelgevingsbehoeften en overwegingen met het oog op dierenwelzijn. In deze gewijzigde versie van de testmethode is meer dan dertig jaar ervaring met dit onderzoek verwerkt, alsook het potentieel om dit onderzoek te integreren in of te combineren met andere toxiciteitsonderzoeken zoals onderzoeken naar ontwikkelingstoxiciteit, reproductietoxiciteit of genotoxiciteit. Vanwege de beperkingen ervan en het gebruik van een groot aantal dieren is deze bepaling echter niet bestemd om als primaire methode te worden gebruikt, maar veeleer als aanvullende testmethode die alleen mag worden gebruikt als er geen alternatief is om aan wettelijke voorschriften te voldoen. Door toxiciteitstests te combineren hoeven mogelijk veel minder dieren in toxiciteitstests te worden gebruikt. De OESO heeft een document opgesteld met beknopte informatie over genetisch-toxicologische tests en een overzicht van de recente wijzigingen van de OESO-testrichtlijnen voor genetische toxiciteit (1).

   Het doel van het onderzoek naar dominante letale (DL) mutaties is om na te gaan of chemische stoffen mutaties veroorzaken die tot chromosoomafwijkingen in kiemcellen leiden. Bovendien is de DL-test van belang voor de beoordeling van genotoxiciteit, omdat factoren van het in-vivometabolisme, de farmacokinetiek en de DNA-herstelprocessen actief zijn en bijdragen aan de reactie op de test, hoewel deze aspecten per soort kunnen verschillen. De inductie van een DL-mutatie door blootstelling aan een teststof wijst erop dat de stof het geslachtsweefsel van het proefdier heeft aangetast.

   DL-mutaties veroorzaken de dood van het embryo of van de foetus. De inductie van een DL-mutatie door blootstelling aan een teststof wijst erop dat de stof de kiemcellen van het proefdier heeft aangetast.

   Een DL-bepaling is nuttig ter bevestiging van positieve resultaten van tests met somatische in-vivo-eindpunten en is een relevant eindpunt ter voorspelling van gevaren voor de mens en het risico van genetische ziekten die worden overgedragen via de kiembaan. Deze bepaling vergt echter een groot aantal dieren en is arbeidsintensief; daarom is de uitvoering ervan heel duur en tijdrovend. Omdat de spontane frequentie van DL-mutaties tamelijk hoog is, is de gevoeligheid van deze bepaling voor het detecteren van kleine toenamen in de frequentie van mutaties over het algemeen beperkt.

   De definities van kernbegrippen worden uiteengezet in aanhangsel 1.

   INLEIDENDE OVERWEGINGEN

   De test wordt meestal uitgevoerd bij muizen (2) (3) (4) maar in sommige gevallen kunnen andere diersoorten, zoals ratten (5) (6) (7) (8), geschikt zijn indien wetenschappelijk gerechtvaardigd. DL-mutaties zijn doorgaans het gevolg van grove chromosoomafwijkingen (structurele en numerieke anomalieën) (9) (10) (11) maar genmutaties kunnen niet worden uitgesloten. Een DL-mutatie is een mutatie die in een kiemcel op zichzelf optreedt of na de bevruchting in het jonge embryo gefixeerd wordt, en die niet tot dysfunctie van de gameet leidt, maar dodelijk is voor de bevruchte eicel of het zich ontwikkelende embryo.

   Men laat individuele mannetjes opeenvolgend en met geschikte intervallen paren met nog niet-gedekte vrouwtjes. Het aantal paringen na de behandeling is afhankelijk van het uiteindelijke doel van het DL-onderzoek (punt 23) en moet voldoende zijn om te zorgen dat alle fasen van de rijping van mannelijke kiemcellen op DL’s worden beoordeeld (12).

   Als er aanwijzingen zijn dat de teststof, of een of meer metabolieten daarvan, niet in de testis terechtkomt, is deze test niet geschikt.

   PRINCIPE VAN DE TEST

   In het algemeen worden mannetjes langs een geschikte weg aan de teststof blootgesteld en met niet-behandelde, niet-gedekte vrouwtjes gepaard. Door middel van geregelde intervallen in de paring kunnen verschillende typen kiemcellen worden onderzocht. Een passende tijd na de paring worden de vrouwtjes gedood en wordt hun uterus onderzocht om het aantal implantaten en het aantal dode en levende embryo’s te bepalen. De dominante letaliteit van een teststof wordt bepaald door de levende implantaties per vrouwtje in de behandelde groep te vergelijken met de levende implantaten per vrouwtje in de vehiculum-/oplosmiddelcontrolegroep. De toename van het aantal dode implantaten per vrouwtje in de behandelde groep in vergelijking met het aantal dode implantaten per vrouwtje in de controlegroep geeft het door de teststof geïnduceerde verlies na implantatie weer. Het verlies na implantatie wordt berekend door de verhouding te bepalen tussen het aantal dode implantaten en het totale aantal implantaten in de behandelde groep vergeleken met dezelfde verhouding bij de controlegroep. Het verlies voor implantatie kan worden geschat door de tellingen van de corpora lutea minus het totale aantal implantaten, of het totale aantal implantaten per vrouwtje in de behandelde en de controlegroep met elkaar te vergelijken.

   VERIFICATIE VAN DE BEKWAAMHEID VAN LABORATORIA

   Laboratoria tonen aan bekwaam te zijn in deze bepaling als zij bewijzen in staat te zijn DL-frequenties uit gepubliceerde gegevens (bv. (13) (14) (15) (16) (17) (18)) te reproduceren met positieve controlestoffen (waaronder zwakke responsen) zoals de stoffen vermeld in tabel 1 en mediumcontroles en negatieve controlefrequenties te verkrijgen die consistent zijn met het aanvaardbare gegevensbereik (zie bovenstaande referenties) of met de historische controleverdeling van het laboratorium, indien beschikbaar.

   BESCHRIJVING VAN DE METHODE

   Voorbereidingen

   Keuze van de diersoort

   Er moet gebruik worden gemaakt van gezonde geslachtsrijpe dieren van in het laboratorium gangbare stammen. Meestal worden muizen gebruikt, maar ratten kunnen ook geschikt zijn. Een andere geschikte zoogdiersoort kan ook in aanmerking komen, mits in het verslag een wetenschappelijke motivering wordt gegeven.

   Huisvestings- en voedingsomstandigheden van de dieren

   De temperatuur in de proefdierruimte moet voor knaagdieren 22 °C (±3 °C) zijn. Hoewel de relatieve vochtigheid idealiter 50-60 % is, moet deze minimaal 40 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % zijn, behalve bij het reinigen van de ruimte. Verlichting gebeurt met kunstlicht met een ritme van 12 uur licht gevolgd door 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende mengbaarheid met de teststof te zorgen, wanneer de stof via het voer wordt toegediend. Voorafgaand aan de behandeling of de paring moeten de knaagdieren worden gehuisvest in kleine groepen (van niet meer dan vijf dieren) van hetzelfde geslacht als geen agressief gedrag wordt verwacht of waargenomen, bij voorkeur in stevige kooien met passende milieuverrijking. De dieren kunnen individueel worden gehuisvest als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is.

   Voorbereiding van de dieren

   Gezonde en geslachtsrijpe volwassen mannetjes en vrouwtjes worden aselect ingedeeld in de controle- en behandelgroepen. De afzonderlijke dieren krijgen op humane, minimaal invasieve wijze een unieke identificatie (bv. door het aanbrengen van een ring, tag, microchip of door biometrische identificatie, maar niet door het afknippen van tenen of oren) en krijgen minimaal vijf dagen de tijd om in het laboratorium te acclimatiseren. De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. Kruisverontreiniging door de positieve controle en de teststof moet worden vermeden. Bij aanvang van het onderzoek moet het gewichtsverschil tussen de dieren zo klein mogelijk zijn en mag dit maximaal ± 20 % van het gemiddelde gewicht van elk geslacht bedragen.

   Voorbereiding van de doses

   Vaste chemische teststoffen moeten worden opgelost of gesuspendeerd in geschikte oplosmiddelen of vehicula of worden vermengd met voedsel of drinkwater voordat dit aan de dieren wordt gegeven. Vloeibare chemische teststoffen kunnen direct worden gegeven of eerst worden verdund. Voor blootstelling via inhalatie kunnen teststoffen worden toegediend als gas, damp of een vaste/vloeibare aerosol, naargelang van de fysisch-chemische eigenschappen ervan. Er dienen verse preparaten van de teststof te worden toegepast, tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat bewaren van de preparaten aanvaardbaar is en blijkt wat de juiste bewaaromstandigheden zijn.

   Testomstandigheden

   Oplosmiddel/vehiculum

   Het oplosmiddel/vehiculum mag bij de gebruikte dosisvolumes geen toxische effecten veroorzaken en chemische reacties met de chemische teststof moeten uitgesloten zijn. Als andere oplosmiddelen/vehicula worden gebruikt dan de algemeen bekende, moet het gebruik ervan worden ondersteund met referentiegegevens die wijzen op de verenigbaarheid ervan. Het wordt aanbevolen waar mogelijk eerst het gebruik van een waterig oplosmiddel/vehiculum te overwegen. Voorbeelden van vaak gebruikte compatibele oplosmiddelen/vehicula zijn water, fysiologische zoutoplossing, methylcelluloseoplossing, natriumcarboxymethylcellulose-zoutoplossing, olijfolie en maïsolie.

   Positieve controles

   Er moeten altijd tegelijkertijd positievecontroledieren worden gebruikt, tenzij het laboratorium aantoonbare bekwaamheid heeft in het uitvoeren van de test en de test in het recente verleden (bv. de afgelopen 5 jaar) routinematig heeft uitgevoerd. Het is echter niet nodig om de dieren voor de positieve controle via dezelfde toedieningsroute te behandelen als de dieren die de teststof krijgen, of om monsters te nemen voor alle intervallen in de paring. Van de positieve controlestoffen moet bekend zijn dat ze onder de voor de test gebruikte omstandigheden DL’s veroorzaken. Afgezien van de behandeling moeten de dieren in de controlegroepen op identieke wijze worden behandeld als de dieren in de andere groepen.

   De doses van de positieve controlestoffen dienen zodanig te worden gekozen, dat zwakke of matige effecten worden geproduceerd waarmee de prestatie en gevoeligheid van de bepaling kritisch worden beoordeeld, maar die wel altijd positieve dominante letale effecten veroorzaken. Voorbeelden van positieve controlestoffen en geschikte doses staan vermeld in tabel 1.

   Tabel 1

   Voorbeelden van positieve controlestoffen

   Stof [CAS-nr.] (referentienr.)	Effectief doseringsbereik (mg/kg) (knaagdiersoort)	Toedieningsperiode (dagen)
   Triëthyleenmelamine [51-18-3] (15)	0,25 (muizen)	1
   Cyclofosfamide [50-18-0] (19)	50-150 (muizen)	5
   Cyclofosfamide [50-18-0] (5)	25-100 (ratten)	1
   Ethylmethaansulfonaat [62-50-0] (13)	100-300 (muizen)	5
   Acrylamide-monomeer [79-06-1] (17)	50 (muizen)	5
   Chlorambucil [305-03-3] (14)	25 (muizen)	1

   Negatieve controles

   Voor elk monsternamepunt moeten er dieren voor negatieve controle worden meegenomen die zijn behandeld met alleen oplosmiddel of vehiculum en verder op dezelfde wijze als de behandelgroepen (20). Bij het ontbreken van historische of gepubliceerde controlegegevens waaruit blijkt dat het gekozen oplosmiddel/vehiculum geen DL’s of andere schadelijke effecten induceert, moeten er voor elk monsternamepunt ook onbehandelde controledieren worden meegenomen om vast te stellen dat de vehiculumcontrole aanvaardbaar is.

   PROCEDURE

   Aantal dieren

   Men laat individuele mannetjes opeenvolgend en met geschikte, vooraf bepaalde intervallen (bv. wekelijkse intervallen, punten 21 en 23) paren met bij voorkeur één nog niet-gedekt vrouwtje. Het aantal mannetjes per groep moet vooraf zodanig worden bepaald dat het voldoende is (in combinatie met het aantal gedekte vrouwtjes voor elk paringsinterval) voor het benodigde statistisch onderscheidingsvermogen om ten minste een verdubbeling van de DL-frequentie te kunnen detecteren (punt 44).

   Het aantal vrouwtjes per paringsinterval moet ook vooraf worden bepaald aan de hand van berekeningen van het statistisch onderscheidingsvermogen dat nodig is om ten minste een verdubbeling van de DL-frequentie te kunnen detecteren (d.w.z. voldoende drachtige vrouwtjes voor in totaal ten minste 400 implantaten) (20) (21) (22) (23) en zodat ten minste één dood implantaat per analyse-eenheid (d.w.z. paringsgroep per dosering) verwacht wordt (24).

   Toedieningsperiode en paringsintervallen

   Het aantal paringsintervallen na de behandeling is afhankelijk van het behandelingsschema en moet groot genoeg zijn om alle fasen van de rijping van mannelijke kiemcellen na de behandeling te beoordelen op DL-inductie (12) (25). Voor één behandeling waarbij dagelijks tot vijf doses worden toegediend, moeten er na de laatste behandeling 8 (muizen) of 10 (ratten) paringen plaatsvinden met intervallen van een week. Voor toediening van meerdere doses kan het aantal paringsintervallen evenredig worden teruggebracht met de toegenomen duur van de toedieningsperiode, waarbij echter wel wordt vastgehouden aan het doel om alle fasen van de spermatogenese te beoordelen (bv. bij muizen kan na een blootstelling van 28 dagen worden volstaan met slechts 4 paringen per week om alle fasen van de spermatogenese te beoordelen). Alle behandelings- en paringsschema’s moeten wetenschappelijk verantwoord worden.

   De vrouwtjes moeten bij de mannetjes worden gelaten gedurende ten minste één volledige oestruscyclus (bij muizen en ratten komt bijvoorbeeld één week overeen met één oestruscyclus). Vrouwtjes die in een eenweeks interval niet gepaard hebben kunnen voor een volgend paringsinterval worden gebruikt. Of de vrouwtjes blijven bij de mannetjes tot op het ogenblik dat de paring heeft plaatsgevonden, hetgeen wordt bepaald door de aanwezigheid van sperma in de vagina of door de aanwezigheid van een vaginale plug.

   Het gebruikte blootstellings- en paringsschema is afhankelijk van het uiteindelijke doel van het DL-onderzoek. Als het doel is om te bepalen of een bepaalde chemische stof op zichzelf DL-mutaties induceert, behelst de aanvaarde methode de blootstelling van een volledige spermatogenesecyclus (bv. 7 weken bij muizen, 5-7 behandelingen per week) en één paring aan het einde daarvan. Is het doel echter om het type kiemcel vast te stellen dat gevoelig is voor DL-inductie, dan gaat de voorkeur uit naar een enkele blootstelling of een blootstelling van 5 dagen, gevolg door wekelijkse paring.

   Dosisniveaus

   Als er een voorbereidend bereikbepalingsonderzoek wordt uitgevoerd omdat er nog geen bruikbare gegevens over de dosering beschikbaar zijn, moet dit in hetzelfde laboratorium gebeuren met dezelfde soort, dezelfde stam, hetzelfde geslacht en hetzelfde behandelingsschema als bij het hoofdonderzoek (26). Het onderzoek moet erop gericht zijn de maximaal verdraagbare dosis (maximum tolerated dose, MTD) vast te stellen, dat wil zeggen, de hoogste dosis die zal worden verdragen zonder aanwijzingen voor onderzoeksbeperkende toxiciteit, in verhouding tot de duur van de onderzoeksperiode (bv. afwijkend gedrag of afwijkende reacties, licht gewichtsverlies of cytotoxiciteit voor het hematopoïetisch systeem), maar geen dood of aanwijzingen voor pijn, lijden of nood die humane doding noodzakelijk maken (27).

   De MTD mag ook geen negatieve invloed hebben op het succes van de paring (21).

   Teststoffen met specifieke biologische activiteit bij lage niet-toxische doses (zoals hormonen en mitogenen) en chemische stoffen die verzadiging van toxicokinetische eigenschappen vertonen kunnen uitzonderingen zijn op de doseringscriteria en moeten per geval worden beoordeeld.

   Om dosisresponsinformatie te krijgen, moet een volledig onderzoek een negatieve controlegroep omvatten en minimaal drie dosisniveaus die in het algemeen een factor 2, maar niet meer dan een factor 4, uit elkaar liggen. Als in een bereikbepalingsonderzoek of op basis van bestaande gegevens geen aanwijzingen voor toxiciteit van de teststof worden gevonden, moet de hoogste dosis voor een enkele toediening 2 000 mg/kg lichaamsgewicht zijn. Als de teststof echter wel toxiciteit veroorzaakt, moet de MTD de hoogste toegediende dosis zijn en moeten de gebruikte dosisniveaus bij voorkeur een bereik dekken van maximale tot weinig of geen toxiciteit. Voor niet-toxische chemische stoffen is de limietdosis voor een toedieningsperiode van 14 dagen of meer 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag en voor toedieningsperioden van minder dan 14 dagen 2 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag.

   Toediening van de doses

   Bij de opzet van een bepaling moet rekening worden gehouden met de verwachte blootstellingsroute bij mensen. Daarom kunnen andere blootstellingsroutes zoals voeding, drinkwater, subcutaan, intraveneus, topicaal, inhalatie, oraal (via een sonde) of implantatie worden gekozen, als deze onderbouwd worden. De route moet in elk geval zodanig worden gekozen dat adequate blootstelling van het (de) doelweefsel(s) is gewaarborgd. Intraperitoneale injectie wordt normaal gesproken niet aanbevolen, omdat zij bij mensen geen beoogde blootstellingsroute is, en zij mag uitsluitend worden toegepast met een specifieke wetenschappelijke motivering. Als de teststof wordt vermengd met voedsel of drinkwater, met name in geval van één toediening, moet ervoor worden gezorgd dat de tijdsduur tussen de consumptie van voedsel en water en de paring voldoende is om de effecten te kunnen detecteren (punt 31). Het maximale vloeistofvolume dat via sonde of injectie per keer kan worden toegediend, hangt af van de grootte van het proefdier. Het volume mag normaal gesproken niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht. Bij een waterige oplossing kan echter maximaal 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden gebruikt. Hogere volumes dan dit (mits toegestaan volgens wetgeving inzake dierenwelzijn) moeten worden onderbouwd. Variaties in het testvolume moeten geminimaliseerd worden door het aanpassen van de concentratie zodat op alle dosisniveaus hetzelfde constante volume in verhouding tot het lichaamsgewicht kan worden gebruikt.

   Waarnemingen

   Algemene klinische waarnemingen van de proefdieren moeten ten minste eenmaal per dag plaatsvinden en klinische tekenen moeten ten minste eenmaal per dag worden geregistreerd, bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip en met inachtneming van de piekperiode van de te verwachten effecten na toediening. Gedurende de doseringsperiode moeten alle dieren ten minste tweemaal per dag worden geobserveerd op ziekteverschijnselen en sterfte. Elk dier moet bij aanvang van het onderzoek en tijdens onderzoeken met herhaalde toediening ten minste eenmaal per week worden gewogen, alsook op het moment dat het dier wordt gedood. Ook het voedselverbruik moet ten minste wekelijks worden gemeten. Als de teststof met het drinkwater wordt toegediend, moet het waterverbruik bij elke verversing van water en ten minste wekelijks worden gemeten. Dieren die niet-letale indicatoren van excessieve toxiciteit vertonen moeten voor afloop van de testperiode worden gedood (27).

   Verzameling en verwerking van weefsel

   De vrouwtjes worden in de tweede helft van de dracht gedood op drachtdag (gestation day, GD) 13 voor muizen en GD 14-15 voor ratten. De uteri worden op dominante letale effecten onderzocht door het aantal implantaten, dode en levende embryo’s en corpora lutea te bepalen.

   De baarmoederhoorns en eierstokken worden blootgelegd voor het tellen van de corpora lutea en de foetussen worden verwijderd, geteld en gewogen. De uteri moeten zorgvuldig worden onderzocht op resorpties die door levende foetussen aan het oog worden onttrokken en om er zeker van te zijn dat alle resorpties geteld worden. De foetale sterfte wordt geregistreerd, alsmede het aantal succesvol bevruchte vrouwtjes en het totale aantal implantaties, het aantal verloren vruchten voor implantatie en de sterfte na implantatie (met inbegrip van vroege en late resorpties). Bovendien kunnen de zichtbare foetussen ten minste 2 weken lang worden geconserveerd in Bouin-fixeermiddel gevolgd door onderzoek naar ernstige uitwendige misvormingen (28) om aanvullende informatie te verkrijgen over de effecten van de teststof op de voortplanting en de ontwikkeling.

   GEGEVENS EN RAPPORTAGE

   Verwerking van de resultaten

   De volgende gegevens moeten in tabellen worden weergegeven: aantal mannetjes dat gepaard heeft, aantal drachtige vrouwtjes en aantal niet-drachtige vrouwtjes. De resultaten van elke paring, met inbegrip van de identiteit van elk mannetje en elk vrouwtje, moeten afzonderlijk worden gerapporteerd. Voor elk vrouwtje moeten het paringsinterval, het dosisniveau voor de behandelde mannetjes en de aantallen levende implantaten en dode implantaten worden vermeld.

   Het verlies na implantatie wordt berekend door de verhouding te bepalen tussen het aantal dode implantaten en het totale aantal implantaten in de behandelde groep vergeleken met dezelfde verhouding bij de vehiculum-/oplosmiddelcontrolegroep.

   Het verlies vóór implantatie wordt berekend als het verschil tussen het aantal corpora lutea en het aantal implantaten of als een daling van het gemiddelde aantal implantaten per vrouwtje in vergelijking met controleparingen. Wanneer het verlies vóór implantatie wordt geschat, moet dat worden gerapporteerd.

   De Dominante Letale factor wordt geschat als: (sterfte na implantatie/totaal aantal implantaties per vrouwtje) × 100.

   Gegevens over toxiciteit en klinische tekenen moeten volgens punt 29 worden gemeld.

   Aanvaardbaarheidscriteria

   Voor de aanvaardbaarheid van een test gelden de volgende criteria:

   • de gelijktijdige negatieve controle komt overeen met de gepubliceerde normen voor historische negatieve controlegegevens en de historische controlegegevens van het laboratorium indien beschikbaar (zie punten 10 en 18);

   • de gelijktijdige positieve controles induceren responsen die overeenkomen met de gepubliceerde normen voor historische positieve controlegegevens en de databank met historische positieve controlegegevens van het laboratorium indien beschikbaar, en leiden tot een statistisch significante toename vergeleken met de negatieve controle (zie punten 17 en 18);

   • er zijn een voldoende totaal aantal implantaten en aantal doses geanalyseerd (punt 20);

   • de criteria voor de selectie van de hoogste dosis zijn consistent met de criteria beschreven in de punten 24 en 27.

   Beoordeling en interpretatie van resultaten

   Minstens drie behandelde dosisgroepen moeten worden geanalyseerd om voldoende gegevens voor een dosisresponsanalyse te verkrijgen.

   Indien aan alle aanvaardbaarheidscriteria is voldaan, wordt een teststof als duidelijk positief beschouwd als:

   • minstens één van de testdoses een statistisch significante toename vertoont vergeleken met de gelijktijdige negatieve controle;

   • de toename verband houdt met de dosis in ten minste een experimentele omstandigheid (bv. een wekelijks paringsinterval) bij beoordeling met een passende trendtoets, en

   • een of meer van de resultaten buiten het aanvaardbare gegevensbereik voor de negatieve controle vallen, of buiten de verdeling van de historische negatieve controlegegevens van het laboratorium (bv. op Poisson-verdeling gebaseerde 95 %-controlegrens), indien beschikbaar.

   De teststof wordt dan in staat geacht om DL-mutaties te induceren in de kiemcellen van de proefdieren. Aanbevelingen voor de meest passende statistische methoden worden beschreven in punt 44; andere aanbevolen statistische benaderingen zijn ook terug te vinden in de literatuur (20) (21) (22) (24) (29). De gebruikte statistische toetsen moeten het dier als de proefeenheid beschouwen.

   Indien aan alle aanvaardbaarheidscriteria is voldaan, wordt een teststof als duidelijk negatief beschouwd als:

   • geen van de testdoses een statistisch significante toename vertoont vergeleken met de gelijktijdige negatieve controle;

   • er in geen enkele experimentele omstandigheid een toename gevonden wordt die verband houdt met de dosis, en

   • alle resultaten binnen het aanvaardbare gegevensbereik voor de negatieve controle vallen, of binnen de historische negatieve controlegegevens van het laboratorium (bv. op Poisson-verdeling gebaseerde 95 %-controlegrens), indien beschikbaar.

   De teststof wordt dan niet in staat geacht om DL-mutaties te induceren in de kiemcellen van de proefdieren.

   Een duidelijk positieve of een duidelijk negatieve reactie behoeft niet te worden bevestigd.

   Indien de reactie noch duidelijk negatief noch duidelijk positief is en om de biologische relevantie van een resultaat te helpen vaststellen (bv. een zwakke of zeer lichte toename), moeten de gegevens door een deskundige en/of nader onderzoek op basis van de bestaande testgegevens worden beoordeeld, bijvoorbeeld om nader vast te stellen of het positieve resultaat buiten het aanvaardbare gegevensbereik voor de negatieve controle valt, of buiten de historische negatieve controlegegevens van het laboratorium (30).

   In zeldzame gevallen zal op basis van de gegevens, zelfs na nader onderzoek, niet kunnen worden geconcludeerd dat de resultaten positief of negatief zijn, en zullen ze daarom als moeilijk te interpreteren worden beschouwd.

   De gebruikte statistische toetsen moeten het mannetje als de proefeenheid beschouwen. Hoewel het mogelijk is dat de tellingsgegevens (bv. het aantal implantaten per vrouwtje) een Poisson-verdeling volgen en/of percentages (bv. het percentage dode implantaten) binomiaal verdeeld zijn, komt het vaak voor dat dergelijke gegevens overdispersie vertonen (31). Bij de statistische analyse moet dan ook eerst getoetst worden op over- en onderdispersie aan de hand van variantietests zoals de binomiale variantietoets van Cochran (32) of de C(α)-toets van Tarone op binomiale overdispersie (31) (33). Als er geen afwijking van de binomiale dispersie wordt gevonden, kunnen de trends in de verhoudingen in de verschillende dosisniveaus worden getoetst aan de hand van de trendtoets van Cochran-Armitage (34) en kunnen paarsgewijze vergelijkingen met de controlegroep worden getoetst aan de hand van de exacte toets van Fisher (35). Als er geen afwijking van de Poisson-dispersie wordt gevonden, kunnen de trends in tellingen worden getoetst aan de hand van Poisson-regressie (36) en kunnen paarsgewijze vergelijkingen met de controlegroep worden getoetst in het kader van het Poisson-model, aan de hand van paarsgewijze contrasten (36). Als er significante over- of onderdispersie wordt gevonden, worden non-parametrische methoden aanbevolen (23) (31). Dit zijn onder meer op rangorde gebaseerde toetsen, zoals de Jonckheere-Terpstra-trendtoets (37) en Mann-Whitney-toetsen (38) op paarsgewijze vergelijkingen met de vehiculum-/oplosmiddelcontrolegroep, evenals permutatie-, hertrekkings- of bootstraptoetsen op trend en paarsgewijze vergelijkingen met de controlegroep (31) (39).

   Een positieve DL-bepaling levert bewijs voor de genotoxiciteit van de teststof in de kiemcellen van de behandelde mannetjes van de testsoort.

   Bij beoordeling van de biologische significantie van de respons kan het vaststellen of de waargenomen waarden binnen of buiten het historische controlebereik vallen een aanwijzing vormen (40).

   Testverslag

   In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

   Samenvatting

   • Teststof:

     • bron, partijnummer, uiterste gebruiksdatum, indien beschikbaar;

     • stabiliteit van de teststof, indien bekend;

     • oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel, indien bekend;

     • meting van pH, osmolaliteit en neerslag in het kweekmedium waaraan de teststof werd toegevoegd, indien van toepassing.

   • Stof die uit één component bestaat:

     • fysisch voorkomen, oplosbaarheid in water en aanvullende relevante fysisch-chemische eigenschappen;

     • chemische identificatiegegevens, zoals IUPAC- of CAS-naam, CAS-nummer, SMILES- of InChI-code, structuurformule, zuiverheid, chemische identiteit van onzuiverheden, indien van toepassing en praktisch haalbaar enz.

   • Stof die uit meerdere componenten bestaat, UVCB’s en mengsels:

     • voor zover mogelijk, karakterisering aan de hand van chemische identiteit (zie hierboven), kwantitatief voorkomen en relevante fysisch-chemische eigenschappen van de bestanddelen.

   • Teststofbereiding:

     • een motivering voor de keuze van het vehiculum;

     • oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/vehiculum, indien bekend;

     • bereiding van toedieningsvormen voor voer, drinkwater of inhalatie;

     • analytische bepalingen op toedieningsvormen (zoals stabiliteit, homogeniteit, nominale concentraties), indien deze zijn uitgevoerd.

   • Proefdieren:

     • gebruikte diersoort/stam en motivering van de keuze;

     • aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;

     • herkomst, leefomstandigheden, voeding enz.;

     • methode om de dieren uniek te identificeren;

     • voor kortetermijnonderzoeken: lichaamsgewicht van de mannetjes aan het begin en aan het eind van de test; voor onderzoeken die langer duren dan één week: individuele lichaamsgewichten gedurende het onderzoek en voedselconsumptie. Het bereik, het gemiddelde en de standaardafwijking van het lichaamsgewicht voor elke groep moet worden opgenomen.

   • Testomstandigheden:

     • gegevens over positieve en negatieve (oplosmiddel/vehiculum) controles;

     • gegevens uit het bereikbepalingsonderzoek;

     • achtergrond voor de keuze van de dosisniveaus;

     • gedetailleerde gegevens over de bereiding van de teststof;

     • gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof;

     • achtergrond voor de keuze van de toedieningsweg;

     • methoden voor meting van diertoxiciteit, waaronder, indien beschikbaar, histopathologische of hematologische analyses en frequentie waarmee het dier is geobserveerd en het lichaamsgewicht is gemeten;

     • methoden om te verifiëren of de teststof het doelweefsel heeft bereikt, of de algemene circulatie, als negatieve resultaten verkregen zijn;

     • feitelijke dosis (mg/kg lichaamsgewicht/dag) berekend op basis van de teststofconcentratie in voer/drinkwater (ppm) en voedselverbruik, indien van toepassing;

     • gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het water;

     • gedetailleerde gegevens over de milieuverrijking;

     • gedetailleerde omschrijving van behandeling en bemonsteringsschema’s en motivering van de keuzes;

     • methode van analgesie;

     • wijze van doden;

     • procedures voor het isoleren en preserveren van weefsels;

     • bron en partijnummers van alle kits en reagentia (waar van toepassing);

     • methoden voor de telling van DL’s;

     • paringsschema;

     • gebruikte methoden om te bepalen dat de paring heeft plaatsgevonden;

     • moment van doden;

     • scoringscriteria voor DL-effecten, waaronder corpora lutea, implantaties, resorpties en verliezen voor implantaties, levende implantaten, dode implantaten.

   • Resultaten:

     • conditie van het dier voor en tijdens de testperiode, inclusief tekenen van toxiciteit;

     • lichaamsgewicht van mannetjes tijdens de behandelings- en paringsperioden;

     • aantal gedekte vrouwtjes;

     • indien mogelijk het verband tussen dosis en respons;

     • gelijktijdige en historische negatieve controlegegevens met bereiken, gemiddelden en standaarddeviaties;

     • gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde positieve controles;

     • gegevens in tabel voor elk moederdier waaronder: aantal corpora lutea per moederdier; aantal implantaties per moederdier; aantal resorpties en verliezen vóór implantatie per moederdier; aantal levende implantaten per moederdier; aantal dode implantaten per moederdier; foetusgewichten;

     • de bovengenoemde gegevens samengevat voor elke paringsperiode en dosis, met DL-frequenties;

     • gebruikte statistische analyses en methoden.

   • Bespreking van de resultaten.

   • Conclusie.

   LITERATUUR

   1. OESO (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, nr. 234, OESO, Parijs.

   2. Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, in Handbook of Mutagenicity Test Procedures B.J. Kilbey et. al.(Eds.) pp. 235-334, Elsevier, Amsterdam

   3. Ehling U.H., Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., and Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Set up by the Work Group „Dominant lethal mutations” of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., 39, 173-185

   4. Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. MutationRes,. 352:159-167.

   5. Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. and Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48:267-270.

   6. Anderson D., Hughes, J.A., Edwards, A.J. and Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397:77-74.

   7. Shively C.A., C.A., White, D.M., Blauch, J.L. and Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20:325-329.

   8. Rao K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. and Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam.Appl. Toxicol., 3:80-85.

   9. Brewen J.G., Payne, H.S., Jones, K.P., and Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., 33, 239-249.

   10. Marchetti F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. and Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70:616-624.

   11. Marchetti F. and Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., C 75:112-129.

   12. Adler I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352:169-172.

   13. Favor J., and Crenshaw J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: 21-27.

   14. Generoso W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. and Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345:167-180.

   15. Hastings S.E., Huffman K.W. and Gallo M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40:371-378.

   16. James D.A. and Smith D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99:303-314.

   17. Shelby M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. and Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173:35-40.

   18. Sudman P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. and Generoso W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: 143-156.

   19. Holstrom L.M., Palmer A.K. and Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland D.J. and Fox M. (Eds.), Cambridge University Press, pp. 129-156.

   20. Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417:19–30.

   21. Adler I.D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312:313-318.

   22. Generoso W.M. and Piegorsch W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol., 3A:124-141.

   23. Haseman J.K. and Soares E.R. (1976).The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: 277-288.

   24. Whorton E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen., 1:353 – 360.

   25. Anderson D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S., and Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85:417-429.

   26. Fielder R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7:313-319.

   27. OESO (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No.19.), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   28. Barrow M.V., Taylor W.J and Morphol J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, 127, 291–306.

   29. Kirkland D.J., (Ed.)(1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press.

   30. Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper P., Lovell D., Martus H.-J. and Thybaud V. (2011). „Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data”, Mutation. Res.,723:87-90.

   31. Lockhart A.C., Piegorsch W.W. and Bishop J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res., 272:35-58.

   32. Cochran W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ² Tests. Biometrics, 10: 417-451.

   33. Tarone R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika, 66: 585-590.

   34. Margolin B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. In Encyclopedia of Statistical Sciences, Volume 9, Kotz S. and Johnson N. L. (Eds.), pp. 334-336. John Wiley and Sons, New York.

   35. Cox D.R., Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London (1970).

   36. Neter J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. and Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, Fourth Edition, Chapters 14 and 17. McGraw-Hill, Boston

   37. Jonckheere R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41:133-145.

   38. Conover W.J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, New York

   39. Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, PA.

   40. Fleiss J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, New York.

   Aanhangsel 1

   DEFINITIES

   Chemische stof:
   een stof of mengsel.
   Corpus luteum (corpora lutea):
   de hormoonafscheidende structuur die wordt gevormd in de eierstok op de plaats van een follikel na de eisprong. Het aantal corpora lutea in de eileiders komt overeen met het aantal eicellen dat is vrijgekomen.
   Dominante Letale (DL) mutatie:
   een mutatie die optreedt in een kiemcel of die na de bevruchting gefixeerd wordt en die de dood van het embryo of van de foetus veroorzaakt.
   Paringsinterval:
   de tijd tussen het einde van de blootstelling en de paring van de behandelde mannetjes. Door de controle van dit interval kunnen de chemische effecten op verschillende kiemceltypen worden beoordeeld. Bij muizen worden bij paring in de weken 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 en 8 na het einde van de blootstelling de effecten gemeten op sperma, gecondenseerde spermatiden, ronde spermatiden, pachytene spermatocyten, vroege spermatocyten, gedifferentieerde spermatogonia, differentiërende spermatogonia en spermatogoniale stamcellen.
   Teststof:
   alle volgens deze testmethode geteste stoffen of mengsels.
   UVCB:
   chemische stof waarvan de samenstelling niet bekend of variabel is, complexe reactieproducten of biologische materialen.
   Verlies vóór implantatie:
   het verschil tussen het aantal implantaten en het aantal corpora lutea. Het kan ook worden geschat door het totale aantal implantaten per vrouwtje in de behandelde en controlegroepen te vergelijken.
   Verlies na implantatie:
   de verhouding tussen het aantal dode implantaten en het totale aantal implantaten in de behandelde groep vergeleken met dezelfde verhouding bij de controlegroep.
   Vruchtbaarheidscijfer:
   het aantal gedekte drachtige vrouwtjes gedeeld door het aantal gedekte vrouwtjes.

   Aanhangsel 2

   TIJDSCHEMA VAN DE SPERMATOGENESE BIJ ZOOGDIEREN

   

   Hierboven is een schema weergegeven van de spermatogenese bij muizen, ratten en mensen (overgenomen uit Adler, 1996). Onder ongedifferentieerde spermatogonia vallen: A-single; A-paired, en A-aligned spermatogonia (Hess en de Franca, 2008). A-single spermatogonia worden als de echte stamcellen beschouwd; om de effecten op stamcellen te kunnen beoordelen moeten er (bij muizen) dus ten minste 49 dagen verstrijken tussen de laatste injectie van de teststof en de paring.

   Referenties

   Adler, ID (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169-172.

   Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1-15.

   ”

4. In deel B wordt hoofdstuk B.23 vervangen door:

   TEST OP CHROMOSOOMAFWIJKINGEN IN SPERMATOGONIA VAN ZOOGDIEREN

   INLEIDING

   Deze testmethode (TM) is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 483 (2016) van de OESO. Testmethoden worden periodiek herzien in het licht van de wetenschappelijke vooruitgang, veranderende regelgevingsbehoeften en overwegingen met het oog op dierenwelzijn. In deze gewijzigde versie van de testmethode is vele jaren ervaring met deze bepaling verwerkt, alsook het potentieel om deze test te integreren in of te combineren met andere onderzoeken naar toxiciteit of genotoxiciteit. Door toxiciteitsonderzoeken te combineren hoeven mogelijk minder dieren in toxiciteitstests te worden gebruikt. Deze testmethode maakt deel uit van een reeks methoden om de genotoxiciteit te testen. De OESO heeft een document opgesteld met beknopte informatie over genetisch-toxicologische tests en een overzicht van de recente wijzigingen van de OESO-testrichtlijnen voor genetische toxiciteit (1).

   De in-vivotest op chromosoomafwijkingen in spermatogonia van zoogdieren wordt gebruikt om te bepalen welke chemische stoffen structurele chromosoomafwijkingen in spermatogonia van zoogdieren veroorzaken (2) (3) (4). Bovendien is deze test van belang voor de beoordeling van genotoxiciteit, omdat factoren van het in-vivometabolisme, de farmacokinetiek en de DNA-herstelprocessen actief zijn en bijdragen aan de reactie op de test, hoewel deze aspecten per soort kunnen verschillen. Deze testmethode is niet bedoeld om numerieke afwijkingen te meten; de bepaling wordt meestal niet voor dat doel gebruikt.

   Bij deze test worden structurele chromosoomafwijkingen (zowel van het chromosoomtype als het chromatidetype) in delende spermatogonia gemeten en op grond van het resultaat zullen wellicht voorspellingen kunnen worden gedaan over de inductie van erfelijke mutaties in deze kiemcellen.

   De definities van kernbegrippen worden uiteengezet in het aanhangsel.

   INLEIDENDE OVERWEGINGEN

   Gewoonlijk worden in deze test knaagdieren gebruikt, maar andere soorten kunnen in sommige gevallen geschikt zijn, indien dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is. In standaard cytogenische preparaten van knaagdiertestes worden mitotische (spermatogonia) en meiotische (spermatocyten) metafasen gegenereerd. Mitotische en meiotische metafasen zijn te herkennen aan de morfologie van de chromosomen (4). In deze in-vivo cytogenetische test worden structurele chromosoomafwijkingen gedetecteerd die zich voordoen bij de mitose van spermatogonia. Deze testmethode is niet geschikt voor andere doelweefsels.

   Om afwijkingen van het chromatidetype in spermatogonia te detecteren, wordt de eerste mitose na de behandeling onderzocht, voordat deze afwijkingen bij latere celdelingen worden omgezet in afwijkingen van het chromosoomtype. Aanvullende informatie van behandelde spermatocyten kan worden verkregen door de chromosomen bij de meiose te analyseren op structurele afwijkingen van het chromosoomtype tijdens de diakinese-metafase I en -metafase II.

   De testis bevat een aantal generaties spermatogonia (5) en deze verschillende kiemceltypen kunnen een uiteenlopende gevoeligheid hebben voor chemische stoffen. De geconstateerde afwijkingen vertegenwoordigen dan ook een gecombineerde respons van de behandelde spermatogoniacelpopulaties. De meerderheid van de mitotische cellen in testispreparaten zijn B-spermatogonia, die een celcyclus hebben van ongeveer 26 uur (3).

   Als er aanwijzingen zijn dat de teststof, of een of meer metabolieten daarvan, niet in de testis terechtkomt, is deze test niet geschikt.

   PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE

   In het algemeen worden de dieren langs een geschikte weg aan de teststof blootgesteld en op geschikte tijdstippen na de behandeling gedood. Voordat de dieren worden gedood, worden ze behandeld met een metafasestopper (bv. colchicine of Colcemid®). Vervolgens worden chromosoompreparaten van de kiemcellen gemaakt, die worden gekleurd; de cellen in de metafase worden geanalyseerd op chromosoomafwijkingen.

   VERIFICATIE VAN DE BEKWAAMHEID VAN LABORATORIA

   Laboratoria tonen aan bekwaam te zijn in deze bepaling als zij bewijzen in staat te zijn verwachte resultaten te reproduceren voor frequenties van structurele chromosoomafwijkingen in spermatogonia met positieve controlestoffen (waaronder zwakke responsen) zoals de stoffen vermeld in tabel 1 en negatieve controlefrequenties te verkrijgen die consistent zijn met het aanvaardbare bereik voor controlegegevens in de gepubliceerde literatuur (bv. (2) (3) (6) (7) (8) (9) (10)) of met de historische controleverdeling van het laboratorium, indien beschikbaar.

   BESCHRIJVING VAN DE METHODE

   Voorbereidingen

   Keuze van de diersoort

   Er moet gebruikgemaakt worden van gezonde jonge volwassen dieren van in het laboratorium gangbare stammen. Meestal worden mannetjesmuizen gebruikt, maar mannetjes van andere geschikte zoogdiersoorten kunnen ook worden gebruikt indien dit wetenschappelijk gerechtvaardigd is en de test daarmee in combinatie met een andere testmethode kan worden uitgevoerd. De wetenschappelijke rechtvaardiging voor het gebruik van andere soorten dan knaagdieren moet in het verslag worden opgenomen.

   Huisvestings- en voedingsomstandigheden van de dieren

   De temperatuur in de proefdierruimte moet voor knaagdieren 22 °C (± 3 °C) zijn. Hoewel de relatieve vochtigheid idealiter 50-60 % is, moet deze minimaal 40 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % zijn, behalve bij het reinigen van de ruimte. Verlichting gebeurt met kunstlicht met een ritme van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende mengbaarheid met de teststof te zorgen, wanneer de stof via het voer wordt toegediend. Knaagdieren moeten worden gehuisvest in kleine groepen (niet meer dan vijf dieren per kooi) als geen agressief gedrag wordt verwacht, bij voorkeur in kooien met een stevige vloer met passende milieuverrijking. De dieren kunnen individueel worden gehuisvest als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is.

   Voorbereiding van de dieren

   Doorgaans worden gezonde jonge volwassen mannetjes (8-12 weken oud bij aanvang van de behandeling) gebruikt en deze worden willekeurig toegewezen aan de controlegroep en de behandelgroep. De afzonderlijke dieren krijgen op humane, minimaal invasieve wijze een unieke identificatie (bv. door het aanbrengen van een ring, tag, microchip of door biometrische identificatie, maar niet door het afknippen van oren of tenen) en krijgen minimaal vijf dagen de tijd om in het laboratorium te acclimatiseren. De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. Kruisverontreiniging door de positieve controle en de teststof moet worden vermeden. Bij aanvang van het onderzoek moet het gewichtsverschil tussen de dieren zo klein mogelijk zijn en mag dit niet meer dan ± 20 % bedragen.

   Voorbereiding van de doses

   Vaste chemische teststoffen moeten worden opgelost of gesuspendeerd in geschikte oplosmiddelen of vehicula of worden vermengd met voedsel of drinkwater voordat dit aan de dieren wordt gegeven. Vloeibare chemische teststoffen kunnen direct worden gegeven of eerst worden verdund. Voor blootstelling via inhalatie kunnen teststoffen worden toegediend als gas, damp of een vaste/vloeibare aerosol, naargelang van de fysisch-chemische eigenschappen ervan. Er dienen verse preparaten van de teststof te worden toegepast, tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat bewaren van de preparaten aanvaardbaar is en blijkt wat de juiste bewaaromstandigheden zijn.

   Testomstandigheden – Oplosmiddel/vehiculum

   Het oplosmiddel/vehiculum mag bij de gebruikte dosisniveaus geen toxische effecten veroorzaken en chemische reacties met de teststoffen moeten uitgesloten zijn. Als andere oplosmiddelen/vehicula worden gebruikt dan de algemeen bekende, moet het gebruik ervan worden ondersteund met referentiegegevens die wijzen op de verenigbaarheid ervan. Aanbevolen wordt waar mogelijk eerst te bezien of een waterig oplosmiddel/vehiculum kan worden gebruikt. Voorbeelden van vaak gebruikte compatibele oplosmiddelen/vehicula zijn water, fysiologische zoutoplossing, methylcelluloseoplossing, natriumcarboxymethylcellulose-zoutoplossing, olijfolie en maïsolie. Bij het ontbreken van historische of gepubliceerde controlegegevens waaruit blijkt dat een gekozen atypisch oplosmiddel/vehiculum geen structurele chromosoomafwijkingen en andere schadelijke effecten veroorzaakt, moet een eerste onderzoek worden uitgevoerd om vast te stellen dat de oplosmiddel-/vehiculumcontrole aanvaardbaar is.

   Positieve controles

   Er moeten altijd tegelijkertijd positievecontroledieren worden gebruikt, tenzij het laboratorium aantoonbare bekwaamheid heeft in het uitvoeren van de test en de test in het recente verleden (bv. de afgelopen 5 jaar) routinematig heeft uitgevoerd. Wanneer geen gelijktijdige positievecontrolegroep wordt opgenomen, moeten in elk experiment scoringcontroles (ongekleurde en ongefixeerde preparaten) worden opgenomen. Deze kunnen worden verkregen door in de scoring van het onderzoek passende referentiemonsters op te nemen die zijn verkregen en bewaard van een apart positievecontrole-experiment dat op gezette tijden (bv. elke 6-18 maanden) wordt verricht in het laboratorium waar de test wordt uitgevoerd; bijvoorbeeld tijdens de bekwaamheidstoetsing en daarna op gezette tijden, indien nodig.

   Positieve controlestoffen moeten op betrouwbare wijze leiden tot een detecteerbare stijging in de frequenties van cellen met structurele chromosoomafwijkingen ten opzichte van de spontane niveaus. De doseringen van de positieve controles moeten zodanig worden gekozen dat de effecten duidelijk zijn, maar de gecodeerde monsters niet onmiddellijk als zodanig herkenbaar zijn voor de scorer. Voorbeelden van voor positieve controle gebruikte stoffen staan vermeld in tabel 1.

   Tabel 1

   Voorbeelden van positieve controlestoffen

   Stoffen [CAS-nr.] (referentienr.)
   Cyclofosfamide (monohydraat) [CAS-nr. 50-18-0 (CAS-nr. 6055-19-2)] (9)
   Cyclohexylamine [CAS-nr. 108-91-8] (7)
   Mitomycine C [CAS-nr. 50-07-7] (6)
   Acrylamide-monomeer [CAS-nr. 79-06-1] (10)
   Triëthyleenmelamine [CAS-nr. 51-18-3] (8)

   Negatieve controles

   Voor elk monsternamepunt moeten er dieren voor negatieve controle worden meegenomen die zijn behandeld met alleen oplosmiddel of vehiculum en verder op dezelfde wijze als de behandelgroepen. Bij het ontbreken van historische of gepubliceerde controlegegevens waaruit blijkt dat het gekozen oplosmiddel/vehiculum geen chromosoomafwijkingen of andere schadelijke effecten induceert, moeten er voor elk monsternamepunt ook onbehandelde controledieren worden meegenomen om vast te stellen dat de vehiculumcontrole aanvaardbaar is.

   PROCEDURE

   Aantal dieren

   De vaststelling van de groepsgrootte aan het begin van het onderzoek moet erop gericht zijn minimaal 5 mannetjes per groep te krijgen. Dit aantal dieren per groep wordt voldoende geacht voor het benodigde statistisch onderscheidingsvermogen (d.w.z. om ten minste een verdubbeling van de frequentie van chromosoomafwijkingen te kunnen detecteren wanneer het negatieve controlepercentage 1,0 % of hoger is met 80 % waarschijnlijkheid bij een significantieniveau van 0,05) (3) (11). Als richtsnoer voor de typische maximale behoefte aan dieren: voor een onderzoek op twee monsternamepunten met drie dosisgroepen en een parallelle negatieve controlegroep, plus een positieve controlegroep (elk bestaande uit vijf dieren per groep) zijn 45 dieren nodig.

   Behandelingsschema

   De teststoffen worden in het algemeen eenmaal toegediend (d.w.z. in één behandeling). Andere doseringsschema’s mogen worden gebruikt voor zover zij wetenschappelijk gerechtvaardigd zijn.

   In de hoogste doseringsgroep worden twee monsternamepunten na de behandeling gebruikt. Aangezien de voor de opname en het metabolisme van de teststof(fen) vereiste tijd en de effecten op de kinetiek van de celcyclus gevolgen kunnen hebben voor het optimale tijdstip om chromosoomafwijkingen te detecteren, wordt er één vroeg en één laat monsternamepunt gebruikt rond 24 en 48 uur na de behandeling. Voor andere doses dan de hoogste dosis moet een monsternamepunt op 24 uur (minder dan of gelijk aan de lengte van de celcyclus van B-spermatogonia, zodat de waarschijnlijkheid om eerste metafasen na de behandeling te scoren zo groot mogelijk is) na de behandeling worden gekozen, tenzij bekend is dat een ander monsternamepunt geschikter en gerechtvaardigd is.

   Er kunnen ook andere monsternamepunten worden gebruikt. Zo zijn voor chemische stoffen die S-onafhankelijke effecten hebben, mogelijk vroegere monsternamepunten (d.w.z. minder dan 24 uur na de behandeling) aangewezen.

   Er kan een behandelingsschema met herhaalde toediening worden gebruikt, bv. in combinatie met een test voor een ander eindpunt waarbij een toedieningsperiode van 28 dagen wordt gebruikt (zoals TM B.58); er zijn dan echter wel extra groepen dieren nodig om de verschillende monsternamepunten te kunnen inpassen. Er moet dan ook per geval wetenschappelijk gerechtvaardigd worden dat een dergelijk schema geschikt is.

   Voordat de dieren worden gedood, worden ze intraperitoneaal geïnjecteerd met een adequate dosis metafasestopper (bv. Colcemid® of colchicine). De dieren worden na een adequate wachttijd bemonsterd. Voor muizen en ratten is deze wachttijd ongeveer 3 tot 5 uur.

   Dosisniveaus

   Als er een voorbereidend bereikbepalingsonderzoek wordt uitgevoerd omdat er nog geen bruikbare gegevens over de dosering beschikbaar zijn, moet dit in hetzelfde laboratorium gebeuren met dezelfde soort, dezelfde stam en hetzelfde behandelingsschema als bij het hoofdonderzoek en volgens de aanbevelingen voor het uitvoeren van bereikbepalingsonderzoek (12). Dit onderzoek moet erop gericht zijn de maximaal verdraagbare dosis (maximum tolerated dose, MTD) vast te stellen, dat wil zeggen, de dosis die lichte toxische effecten induceert, in verhouding tot de duur van de onderzoeksperiode (bv. afwijkend gedrag of afwijkende reacties, licht gewichtsverlies of cytotoxiciteit voor het hematopoïetisch systeem), maar geen dood of aanwijzingen voor pijn, lijden of nood die humane doding van de dieren noodzakelijk maken (13).

   De hoogste dosis kan ook worden gedefinieerd als een dosis die enigerlei aanwijzing van toxiciteit voor de spermatogonia oplevert (bv. een daling van de verhouding tussen cellen in spermatogoniamitose en eerste en tweede meiosemetafase). deze daling mag niet groter zijn dan 50 %.

   Teststoffen met specifieke biologische activiteit bij lage niet-toxische doses (zoals hormonen en mitogenen) en chemische stoffen die verzadiging van toxicokinetische eigenschappen vertonen kunnen uitzonderingen zijn op de doseringscriteria en moeten per geval worden beoordeeld.

   Om dosisresponsinformatie te krijgen, moet een volledig onderzoek een negatieve controlegroep (punt 18) omvatten en minimaal drie dosisniveaus die in het algemeen een factor 2, maar niet meer dan een factor 4, uit elkaar liggen. Als in een bereikbepalingsonderzoek of op basis van bestaande gegevens geen aanwijzingen voor toxiciteit van de teststof worden gevonden, moet de hoogste dosis voor een enkele toediening 2 000 mg/kg lichaamsgewicht zijn. Als de teststof echter wel toxiciteit veroorzaakt, moet de MTD de hoogste toegediende dosis zijn en moeten de gebruikte dosisniveaus bij voorkeur een bereik dekken van maximale tot weinig of geen toxiciteit. Wanneer toxiciteit voor het doelweefsel (d.w.z. testis) bij alle geteste dosisniveaus wordt waargenomen, wordt verder onderzoek bij niet-toxische doses aanbevolen. Voor onderzoek dat ten doel heeft de kwantitatieve dosisresponsinformatie volledig te kenschetsen, kunnen aanvullende dosisgroepen nodig zijn. Voor bepaalde typen teststoffen (bv. geneesmiddelen voor menselijk gebruik) waarvoor specifieke eisen gelden, kunnen deze limieten verschillen. Als de teststof wel toxiciteit veroorzaakt, moet gekozen worden voor de limietdosis plus twee lagere doses (zoals hierboven beschreven). De limietdosis voor een toedieningsperiode van 14 dagen of meer is 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag en voor toedieningsperioden van minder dan 14 dagen 2 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag.

   Toediening van de doses

   Bij de opzet van een bepaling moet rekening worden gehouden met de verwachte blootstellingsroute bij mensen. Daarom kunnen andere blootstellingsroutes zoals voeding, drinkwater, lokaal, subcutaan, intraveneus, oraal (via sonde), inhalatie of implantatie worden gekozen, als deze onderbouwd worden. De route moet in elk geval zodanig worden gekozen dat adequate blootstelling van het doelweefsel is gewaarborgd. Intraperitoneale injectie wordt normaal gesproken niet aanbevolen tenzij wetenschappelijk gerechtvaardigd, omdat deze bij mensen doorgaans geen fysiologisch relevante blootstellingsroute is. Als de teststof wordt vermengd met voedsel of drinkwater, met name in geval van één toediening, moet ervoor worden gezorgd dat de tijdsduur tussen de consumptie van voedsel en water en de bemonstering voldoende is om de effecten te kunnen detecteren (zie punt 33). Het maximale vloeistofvolume dat via sonde of injectie per keer kan worden toegediend, hangt af van de grootte van het proefdier. Het volume mag normaal gesproken niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht. Bij een waterige oplossing kan echter maximaal 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden gebruikt. Hogere volumes dan dit (mits toegestaan volgens wetgeving inzake dierenwelzijn) moeten worden onderbouwd. Variaties in het testvolume moeten geminimaliseerd worden door het aanpassen van de concentratie zodat op alle dosisniveaus hetzelfde constante volume in verhouding tot het lichaamsgewicht kan worden gebruikt.

   Waarnemingen

   Algemene klinische waarnemingen van de proefdieren moeten ten minste eenmaal per dag plaatsvinden en klinische tekenen moeten ten minste eenmaal per dag worden geregistreerd, bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip en met inachtneming van de piekperiode van de te verwachten effecten na toediening. Alle dieren moeten ten minste tweemaal per dag worden geobserveerd op ziekteverschijnselen en sterfte. Alle dieren moeten bij aanvang van het onderzoek, tijdens onderzoeken met herhaalde toediening ten minste eenmaal per week, en bij het doden worden gewogen. In onderzoeken met een duur van ten minste één week moet het voedselverbruik ten minste wekelijks worden gemeten. Als de teststof met het drinkwater wordt toegediend, moet het waterverbruik bij elke verversing van water en ten minste wekelijks worden gemeten. Dieren die niet-letale indicatoren van excessieve toxiciteit vertonen moeten voor afloop van de testperiode worden gedood (13).

   Chromosoompreparaten

   Onmiddellijk nadat het dier is gedood worden suspensies gemaakt van kiemcellen uit één testis of beide testes en worden deze in een hypotone oplossing gebracht en volgens vastgestelde protocollen gefixeerd (bv. (2) (14) (15)). De cellen worden vervolgens op objectglaasjes uitgesmeerd en gekleurd (16) (17). Alle objectglaasjes moeten worden gecodeerd zodat de identiteit ervan onbekend blijft voor de scorer.

   Analyse

   Voor elk dier moeten er ten minste 200 goed gespreide metafasen worden gescoord (3) (11). Als de historische negatieve controlefrequentie < 1 % is, moeten er meer dan 200 cellen/dier worden gescoord om het statistisch onderscheidingsvermogen te vergroten (3). Er moeten kleuringsmethoden worden gebruikt waarmee het centromeer herkenbaar is.

   Afwijkingen in het chromosoomtype en het chromatidetype moeten afzonderlijk worden opgetekend en ingedeeld in subtypen (breuken, uitwisselingen). Hiaten moeten worden geregistreerd maar niet in aanmerking genomen wanneer wordt bepaald of een chemische stof de incidentie van cellen met chromosoomafwijkingen significant verhoogt. De in het laboratorium gebruikte procedures moeten ervoor zorgen dat de analyse van chromosoomafwijkingen wordt uitgevoerd door goed opgeleide scorers. Aangezien bij de bereiding van de objectglaasjes vaak een gedeelte van de metafasecellen breekt, waarbij chromosomen verloren gaan, mogen de gescoorde cellen niet minder dan 2n±2 centromeren bevatten, waarin n het haploïde aantal chromosomen voor die soort is.

   Hoewel de test bedoeld is om structurele chromosoomafwijkingen op te sporen, is het belangrijk dat de frequenties van polyploïde cellen en cellen met endoreduplicatie van chromosomen worden opgetekend wanneer deze gebeurtenissen worden waargenomen (zie punt 44).

   GEGEVENS EN RAPPORTAGE

   Verwerking van de resultaten

   Gegevens van individuele dieren moeten in tabelvorm worden gepresenteerd. Voor elk dier moet het aantal cellen met een of meer structurele chromosoomafwijkingen en het aantal chromosoomafwijkingen per cel worden bepaald. Er moet een uitgesplitst overzicht worden gegeven van de afwijkingen in het chromatidetype en chromosoomtype ingedeeld in subtypen (breuken, uitwisselingen), met de aantallen en de frequentie waarmee ze in de behandelde en controlegroepen voorkomen. Hiaten worden afzonderlijk geregistreerd. De frequentie van hiaten wordt in het verslag vermeld, maar in het algemeen niet opgenomen in de analyse van de totale frequentie van structurele chromosoomafwijkingen. Het percentage polyploïde cellen en cellen met endoreduplicatie van chromosomen wordt gerapporteerd wanneer dergelijke cellen worden waargenomen.

   Gegevens over toxiciteit en klinische tekenen moeten volgens punt 30 worden gemeld.

   Aanvaardbaarheidscriteria

   Voor de aanvaardbaarheid van een test gelden de volgende criteria:

   • de gelijktijdige negatieve controle komt overeen met de gepubliceerde normen voor historische negatieve controlegegevens, waarbij in het algemeen een percentage > 0 % en ≤ 1,5 % cellen met chromosoomafwijkingen wordt verwacht, en de historische controlegegevens van het laboratorium indien beschikbaar (zie punten 10 en 18);

   • de gelijktijdige positieve controles induceren responsen die overeenkomen met de gepubliceerde normen voor historische positieve controlegegevens en de databank met historische positieve controlegegevens van het laboratorium indien beschikbaar, en leiden tot een statistisch significante toename vergeleken met de negatieve controle (zie punten 17 en 18);

   • er zijn voldoende aantallen cellen en doses geanalyseerd (zie punten 28 en 32);

   • de criteria voor de selectie van de hoogste dosis zijn consistent met de criteria beschreven in de punten 25 en 26.

   Als zowel mitose als meiose worden geobserveerd, wordt als maat voor de cytotoxiciteit bij alle behandelde dieren en negatieve controles in een monster van in totaal 100 delende cellen per dier de verhouding tussen cellen in spermatogoniamitose en eerste en tweede meiosemetafase bepaald. Als alleen de mitose wordt geobserveerd, moet in ten minste 1 000 cellen voor elk dier de mitotische index worden bepaald.

   Beoordeling en interpretatie van resultaten

   Minstens drie behandelde dosisgroepen moeten worden geanalyseerd om voldoende gegevens voor een dosisresponsanalyse te verkrijgen.

   Indien aan alle aanvaardbaarheidscriteria is voldaan, wordt een teststof als duidelijk positief beschouwd als:

   • minstens één van de testdoses een statistisch significante toename vertoont vergeleken met de gelijktijdige negatieve controle;

   • de stijging dosisgerelateerd is op ten minste één monsternamepunt, en

   • een of meer van de resultaten buiten het aanvaardbare gegevensbereik voor de negatieve controle vallen, of buiten de verdeling van de historische negatieve controlegegevens van het laboratorium (bv. op Poisson-verdeling gebaseerde 95 %-controlegrens), indien beschikbaar.

   De teststof wordt dan in staat geacht om chromosoomafwijkingen te induceren in de spermatogoniale cellen van de proefdieren. In de literatuur zijn eveneens aanbevelingen te vinden voor de meest geschikte statistische methoden (11) (18). De gebruikte statistische toetsen moeten het dier als de proefeenheid beschouwen.

   Indien aan alle aanvaardbaarheidscriteria is voldaan, wordt een teststof als duidelijk negatief beschouwd als:

   • geen van de testdoses een statistisch significante toename vertoont vergeleken met de gelijktijdige negatieve controle;

   • er in geen enkele experimentele omstandigheid een toename gevonden wordt die verband houdt met de dosis, en

   • alle resultaten binnen het aanvaardbare gegevensbereik voor de negatieve controle vallen, of binnen de historische negatieve controlegegevens van het laboratorium (bv. op Poisson-verdeling gebaseerde 95 %-controlegrens), indien beschikbaar.

   De teststof wordt dan niet in staat geacht om chromosoomafwijkingen te induceren in de spermatogoniale cellen van de proefdieren. In de literatuur zijn eveneens aanbevelingen te vinden voor de meest geschikte statistische methoden (11) (18). Een negatief resultaat sluit de mogelijkheid niet uit dat de chemische stof in latere, niet onderzochte ontwikkelingsfasen chromosoomafwijkingen veroorzaakt, of genmutaties.

   Een duidelijk positieve of duidelijk negatieve reactie behoeft niet te worden bevestigd.

   Indien de reactie noch duidelijk negatief noch duidelijk positief is en om de biologische relevantie van een resultaat te helpen vaststellen (bv. een zwakke of zeer lichte toename), moeten de gegevens door een deskundige en/of nader onderzoek op basis van de bestaande testgegevens worden beoordeeld, bijvoorbeeld om nader vast te stellen of het positieve resultaat buiten het aanvaardbare gegevensbereik voor de negatieve controle valt, of buiten de historische negatieve controlegegevens van het laboratorium (19).

   In zeldzame gevallen zal op basis van de gegevens, zelfs na nader onderzoek, niet kunnen worden geconcludeerd dat de resultaten positief of negatief zijn, en zullen ze daarom als moeilijk te interpreteren worden beschouwd.

   Een stijging van het aantal polyploïde cellen kan erop wijzen dat de teststof in staat is mitotische processen te remmen en numerieke chromosoomafwijkingen te induceren (20). Een stijging van het aantal cellen met endoreduplicatie van chromosomen kan erop duiden dat de teststof in staat is de voortgang van de celcyclus te remmen (21) (22), hetgeen een ander mechanisme is waarmee numerieke veranderingen in de chromosomen kunnen worden geïnduceerd, naast remming van de mitotische processen (zie punt 2). De incidentie van polyploïde cellen en cellen met endoreduplicatie van chromosomen moet daarom apart worden geregistreerd.

   Testverslag

   In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

   • Samenvatting

   • Teststof:

     • bron, partijnummer, uiterste gebruiksdatum, indien beschikbaar;

     • stabiliteit van de teststof, indien bekend;

     • oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel, indien bekend;

     • meting van pH, osmolaliteit en neerslag in het kweekmedium waaraan de teststof werd toegevoegd, indien van toepassing.

   • Stof die uit één component bestaat:

     • fysisch voorkomen, oplosbaarheid in water en aanvullende relevante fysisch-chemische eigenschappen;

     • chemische identificatiegegevens, zoals IUPAC- of CAS-naam, CAS-nummer, SMILES- of InChI-code, structuurformule, zuiverheid, chemische identiteit van onzuiverheden, indien van toepassing en praktisch haalbaar enz.

   • Stof die uit meerdere componenten bestaat, UVCB’s en mengsels:

     • voor zover mogelijk, karakterisering aan de hand van chemische identiteit (zie hierboven), kwantitatief voorkomen en relevante fysisch-chemische eigenschappen van de bestanddelen.

   • Teststofbereiding:

     • een motivering voor de keuze van het vehiculum;

     • oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/vehiculum;

     • bereiding van toedieningsvormen voor voer, drinkwater of inhalatie;

     • analytische bepalingen op toedieningsvormen (zoals stabiliteit, homogeniteit, nominale concentraties) indien deze zijn uitgevoerd.

   • Proefdieren:

     • gebruikte diersoort/stam en motivering van het gebruik;

     • aantal en leeftijd van de dieren;

     • herkomst, leefomstandigheden, voeding enz.;

     • methode om de dieren uniek te identificeren;

     • voor kortetermijnonderzoeken: individueel gewicht van de dieren aan het begin en aan het eind van de test; voor onderzoeken die langer duren dan één week: individuele lichaamsgewichten gedurende het onderzoek en voedselconsumptie. Het bereik, het gemiddelde en de standaardafwijking van het lichaamsgewicht voor elke groep moet worden opgenomen.

   • Testomstandigheden:

     • gegevens over positieve en negatieve (oplosmiddel/vehiculum) controles;

     • gegevens uit het bereikbepalingsonderzoek, indien dit is uitgevoerd;

     • achtergrond voor de keuze van de dosisniveaus;

     • achtergrond voor de keuze van de toedieningsweg;

     • gedetailleerde gegevens over de bereiding van de teststof;

     • gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof;

     • achtergrond voor de keuze van het tijdstip waarop de dieren gedood worden;

     • methoden voor meting van diertoxiciteit, waaronder, indien beschikbaar, histopathologische of hematologische analyses en frequentie waarmee het dier is geobserveerd en het lichaamsgewicht is gemeten;

     • methoden om te verifiëren of de teststof het doelweefsel heeft bereikt, of de algemene circulatie, als negatieve resultaten verkregen zijn;

     • feitelijke dosis (mg/kg lichaamsgewicht/dag) berekend op basis van de teststofconcentratie in voer/drinkwater (ppm) en voedselverbruik, indien van toepassing;

     • gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het water;

     • gedetailleerde omschrijving van behandeling en bemonsteringsschema’s en motivering van de keuzes;

     • wijze van doden;

     • wijze van pijnbestrijding (indien gebruikt);

     • procedures voor het isoleren van weefsels;

     • naam van de metafasestopper, gebruikte concentratie en behandelingsduur;

     • methoden voor de bereiding van de objectglaasjes;

     • criteria voor het scoren van afwijkingen;

     • aantal geanalyseerde cellen per dier;

     • criteria om te bepalen of het resultaat positief, negatief of onduidelijk is.

   • Resultaten:

     • conditie van het dier voor en tijdens de testperiode, inclusief tekenen van toxiciteit;

     • lichaams- en orgaangewicht bij het doden van het dier (indien meerdere behandelingen worden toegepast, lichaamsgewichten tijdens de behandeling);

     • tekenen van toxiciteit;

     • mitotische index;

     • verhouding tussen cellen in spermatogoniamitose en eerste en tweede meiosemetafase, of ander bewijs voor blootstelling van het doelweefsel;

     • aard en aantal van de afwijkingen, afzonderlijk vermeld voor elk dier;

     • totaal aantal afwijkingen per groep, met vermelding van het gemiddelde en de standaardafwijking;

     • aantal cellen met afwijkingen per groep, met vermelding van het gemiddelde en de standaardafwijking;

     • indien mogelijk het verband tussen dosis en respons;

     • gebruikte statistische analyses en methoden;

     • gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde negatieve controles;

     • gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve controles, met vermelding van spreiding, gemiddelden en standaarddeviaties en 95 %-betrouwbaarheidsinterval (indien beschikbaar), of gepubliceerde gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve controles die zijn gebruikt voor de aanvaardbaarheid van de testresultaten;

     • gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde positieve controles;

     • veranderingen in de ploïdie, indien waargenomen, met inbegrip van veranderingen in de frequenties van polyploïdie en/of cellen met endoreduplicatie.

   • Bespreking van de resultaten

   • Conclusie

   LITERATUUR

   1. OESO (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, nr. 234, OESO, Parijs.

   2. Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J. M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.

   3. Adler I.-D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313-318.

   4. Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutation Res., 455, 167-189.

   5. Hess, R.A. and de Franca L.R. (2008). Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous Epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, Cheng C.Y. (Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, pp. 1-15.

   6. Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C, Mutation. Res., 23(3): 368-379.Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel C., Lambert B. and Magnusson J. (Eds.) Liss, New York, pp. 477-484.

   7. Cattanach, B.M., and Pollard C.E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse, Mutation Res., 12, 472-474.

   8. Cattanach, B.M., and Williams, C.E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens, Mutation Res., 13, 371-375.

   9. Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia, Humangenetik 29, 135-140.

   10. Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice, Mutation Res., 57(3): 313-324.

   11. Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417, 19–30.

   12. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.

   13. OESO (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, No 19), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   14. Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, 207-209.

   15. Hsu, T.C., Elder, F. and Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen., 1, 291-294.

   16. Evans, E.P., Breckon, G., and Ford, C.E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294.

   17. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.

   18. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G.and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.

   19. Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. and Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutation Res.,723, 87-90.

   20. Warr T.J., Parry E.M. and Parry J.M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens, Mutation Res., 287, 29-46.

   21. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43, 1362-1364.

   22. Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403-413.

   Aanhangsel

   DEFINITIES

   Afwijking van het chromatidetype:
   structurele chromosoombeschadiging waarbij breuken in individuele chromatiden ontstaan, eventueel gevolgd door recombinatie.
   Afwijking van het chromosoomtype:
   structurele chromosoombeschadiging waarbij breuken in beide chromatiden op dezelfde plaats ontstaan, eventueel gevolgd door recombinatie.
   Aneuploïdie:
   elke afwijking van het normale diploïde (of haploïde) aantal chromosomen met één chromosoom of meer dan één chromosoom, maar niet met (een) volledige reeks(en) chromosomen (polyploïdie).
   Centromeer:
   het deel of de delen van een chromosoom waar tijdens de celdeling de spoeldraden aan vastzitten, zodat de verplaatsing van de dochterchromosomen naar de polen van de dochtercellen regelmatig kan verlopen.
   Chemische stof:
   een stof of mengsel.
   Clastogeen:
   chemische stof die structurele chromosoomafwijkingen veroorzaakt in populaties van cellen of organismen.
   Genotoxisch:
   een algemene term die alle typen DNA- of chromosoombeschadiging omvat, waaronder breuken, deleties, adducten, veranderingen en bindingen van nucleotiden, herschikkingen, mutaties, chromosoomafwijkingen en aneuploïdie. Niet alle soorten genotoxische effecten leiden tot mutaties of stabiele chromosoombeschadiging.
   Hiaat:
   een achromatische beschadiging die kleiner is dan de breedte van één chromatide en waarbij de fout in de uitlijning van de chromatiden minimaal is.
   Mitose:
   deling van de celkern die doorgaans wordt ingedeeld in profase, prometafase, metafase, anafase en telofase.
   Mitotische index (MI):
   de verhouding tussen het aantal cellen in de metafase en het totale aantal cellen in een populatie; deze index geeft een indicatie van de snelheid waarmee deze populatie zich voortplant.
   Mutageen:
   produceert een erfelijke wijziging van DNA-basepaarsequentie(s) in genen of van de structuur van chromosomen (chromosoomafwijkingen).
   Numerieke afwijking:
   een verandering in het aantal chromosomen ten opzichte van het normale aantal dat kenmerkend is voor de gebruikte dieren.
   Polyploïdie:
   het voorkomen van een ander veelvoud van het haploïde aantal chromosomen (n) dan het diploïde aantal (d.w.z. 3n, 4n enz.).
   Structurele afwijking:
   een verandering in de chromosoomstructuur die bij microscopisch onderzoek tijdens de metafase van de celdeling kan worden waargenomen in de vorm van deleties, fragmenten en uitwisselingen.
   Teststof:
   alle volgens deze testmethode geteste stoffen of mengsels.
   UVCB:
   chemische stoffen waarvan de samenstelling niet bekend of variabel is, complexe reactieproducten of biologische materialen.
   Verscheidenheid van de chromosomen:
   verscheidenheid in de vorm (bv. metacentrisch, acrocentrisch enz.) en grootte van chromosomen.

   ”

5. In deel B wordt hoofdstuk B.40 vervangen door:

   IN-VITROHUIDCORROSIE: TESTMETHODE OP BASIS VAN DE TRANSCUTANE ELEKTRISCHE WEERSTAND (TEW)

   INLEIDING

   Deze testmethode (TM) is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 430 (2015) van de OESO. Onder huidcorrosie wordt verstaan: het ontstaan van irreversibele schade aan de huid in de vorm van zichtbare necrose door de epidermis heen in de dermis, na het aanbrengen van een teststof (zoals gedefinieerd door het mondiaal geharmoniseerd classificatie- en etiketteringssysteem voor chemische stoffen (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals, GHS) van de Verenigde Naties (VN) (1) en Verordening (EU) nr. 1272/2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking van stoffen en mengsels (CLP-verordening)⁽¹⁾). Deze bijgewerkte testmethode B.40 bevat een in-vitroprocedure voor het identificeren van niet-corrosieve en corrosieve stoffen en mengsels overeenkomstig het VN-GHS (1) en de CLP-verordening.

   De bepaling van de huidcorrosiviteit ging meestal gepaard met het gebruik van proefdieren (TM B.4, gelijkwaardig aan OESO TG 404; oorspronkelijk vastgesteld in 1981, herzien in 1992, 2002, 2015) (2). Naast deze TM B.40 zijn er nog andere in-vitromethoden voor het testen van het potentieel voor huidcorrosie van chemische stoffen gevalideerd en goedgekeurd als TM B.40 bis (gelijkwaardig aan OESO TG 431) (3) en TM B.65 (gelijkwaardig aan OESO TG 435) (4), waarmee corrosieve chemische stoffen zo nodig ook in subcategorieën kunnen worden ingedeeld. Er zijn verschillende gevalideerde in-vitrotestmethoden goedgekeurd als TM B.46 (gelijkwaardig aan OESO TG 439) (5) voor het testen op huidirritatie. In een OESO-leidraad voor een geïntegreerde test- en beoordelingsbenadering (Integrated Approach on Testing and Assessment, IATA) voor huidcorrosie en -irritatie worden verschillende modules beschreven met uiteenlopende gedeelde informatiebronnen en analyse-instrumenten. De IATA i) biedt richtsnoeren voor de integratie en het gebruik van bestaande gegevens die zijn verzameld met behulp van test- en niet-testmethoden om het potentieel voor huidirritatie en -corrosie van chemische stoffen te beoordelen en ii) draagt een benadering aan voor wanneer verder testen nodig is (6).

   Deze testmethode heeft betrekking op huidcorrosie als eindpunt voor de menselijke gezondheid. Ze is gebaseerd op de testmethode op basis van de transcutane elektrische weerstand (TEW) bij rattenhuid. Deze testmethode maakt gebruik van huidschijfjes om corrosieve stoffen te identificeren op basis van hun vermogen om een verlies van de normale intacte staat en barrièrefunctie van het stratum corneum te veroorzaken. De overeenkomstige testrichtlijn van de OESO werd oorspronkelijk vastgesteld in 2004 en bijgewerkt in 2015 met verwijzingen naar de IATA-leidraad.

   Ter evaluatie van de in-vitrotests betreffende huidcorrosie met het oog op regelgeving zijn er prevalideringsstudies uitgevoerd (7), gevolgd door een formele valideringsstudie van de TEW-testmethode met rattenhuid voor de bepaling van huidcorrosie (8) (9) (10) (11). De resultaten van deze studies hebben geleid tot de aanbeveling dat de TEW-testmethode (aangeduid als de Validated Reference Method (VRM), gevalideerde referentiemethode) met het oog op regelgeving kon worden gebruikt voor de bepaling van de in-vivohuidcorrosiviteit (12) (13) (14).

   Voordat een voorgestelde soortgelijke of gewijzigde in-vitro-TEW-testmethode voor huidcorrosie anders dan de VRM kan worden gebruikt met het oog op regelgeving, moeten de betrouwbaarheid, relevantie (nauwkeurigheid) en beperkingen ervan voor het voorgestelde gebruik bepaald worden om te waarborgen dat de methode vergelijkbaar is met de VRM, overeenkomstig de vereisten van de prestatienormen (15). De wederzijdse aanvaarding van gegevens in overeenstemming met de OESO-overeenkomst is pas gewaarborgd wanneer voorgestelde nieuwe of bijgewerkte testmethoden volgens de prestatienormen zijn geëvalueerd en zijn opgenomen in de overeenkomstige OESO-testrichtlijn.

   DEFINITIES

   Gebruikte definities worden gegeven in het aanhangsel.

   INLEIDENDE OVERWEGINGEN

   In een valideringsstudie (10) en andere gepubliceerde onderzoeken (16) (17) is gerapporteerd dat met de TEW-testmethode met rattenhuid een betrouwbaar onderscheid kan worden gemaakt tussen stoffen waarvan bekend is dat ze corrosief c.q. niet-corrosief voor de huid zijn, met een algemene gevoeligheid van 94 % (51/54) en een specificiteit van 71 % (48/68) voor een databank van 122 stoffen.

   Deze testmethode heeft betrekking op in-vitrohuidcorrosie en biedt een procedure voor het identificeren van niet-corrosieve en corrosieve teststoffen overeenkomstig het VN-GHS en de CLP-verordening. Deze testmethode heeft als beperking, zoals gebleken is in de valideringsstudies (8) (9) (10) (11), dat het niet mogelijk is om een indeling van corrosieve stoffen en mengsels in subcategorieën te maken overeenkomstig het VN-GHS en de CLP-verordening. Hoe deze testmethode wordt gebruikt, wordt bepaald door het toepasselijke regelgevingskader. Hoewel deze testmethode geen toereikende informatie over huidirritatie oplevert, moet worden opgemerkt dat TM B.46 specifiek betrekking heeft op het gezondheidseffect huidirritatie in vitro (5). Voor een volledige beoordeling van lokale huideffecten na één blootstelling op de huid moet de OESO-leidraad voor IATA worden geraadpleegd (6).

   Bij de onderliggende validering van deze testmethode werd een groot aantal chemische producten, waarvan de meeste in de vorm van stoffen, getest en de empirische databank van de valideringsstudie bevatte 60 stoffen die een groot aantal verschillende chemische klassen vertegenwoordigden (8) (9). Op basis van de globale beschikbare gegevens is de testmethode van toepassing op een groot aantal verschillende chemische klassen en fysische toestanden, waaronder vloeistoffen, halfvaste stoffen, vaste stoffen en wassen. Omdat teststoffen met geschikte referentiegegevens voor bepaalde fysische toestanden niet gemakkelijk beschikbaar zijn, zij erop gewezen dat het aantal wassen en corrosieve vaste stoffen dat bij de validering beoordeeld werd, betrekkelijk gering was. Vloeistoffen mogen waterig of niet-waterig zijn; vaste stoffen mogen al dan niet in water oplosbaar zijn. Wanneer kan worden aangetoond dat de testmethode niet kan worden toegepast op een specifieke categorie van stoffen, mag de testmethode niet voor die specifieke categorie van stoffen worden gebruikt. Voorts wordt aangenomen dat deze testmethode, in het verlengde van de toepasbaarheid ervan op stoffen, ook op mengsels kan worden toegepast. Mengsels vertegenwoordigen evenwel een breed spectrum aan categorieën en samenstellingen en er is vooralsnog slechts beperkte informatie over het testen van mengsels beschikbaar. Wanneer kan worden aangetoond dat de testmethode niet op een specifieke categorie van mengsels kan worden toegepast (bv. aan de hand van een strategie zoals voorgesteld door Eskes et al., 2012) (18), mag de testmethode dan ook niet voor die specifieke categorie van mengsels worden gebruikt. Voordat de testmethode wordt gebruikt op een mengsel om gegevens te genereren voor een beoogd regelgevingsdoel, moet worden nagegaan of, en zo ja, waarom deze methode betrouwbare resultaten oplevert voor dat doel. Zulke overwegingen zijn niet nodig wanneer het testen van het mengsel wettelijk vereist is. Gassen en aerosolen zijn nog niet gevalideerd in valideringsstudies (8) (9). Hoewel het denkbaar is dat deze met behulp van de TEW-testmethode kunnen worden getest, staat de huidige testmethode het testen van gassen en aerosolen niet toe.

   PRINCIPE VAN DE TEST

   De teststof wordt gedurende maximaal 24 uur aangebracht op het oppervlak van de epidermis van huidschijfjes in een testsysteem met twee compartimenten waarin de huidschijfjes als scheiding tussen de compartimenten fungeren. De huidschijfjes worden weggenomen uit de huid van op humane wijze gedode ratten met een leeftijd van 28-30 dagen. Corrosieve chemische stoffen wordt gekenmerkt doordat ze een verlies van de normale intacte staat en barrièrefunctie van het stratum corneum kunnen veroorzaken, dat wordt gemeten als een daling van de TEW tot onder een drempelwaarde (16) (zie punt 32). Voor de TEW bij rattenhuid is een drempelwaarde van 5 kΩ gekozen op basis van uitgebreide gegevens voor een breed scala van stoffen, waarbij de overgrote meerderheid van de waarden duidelijk boven (vaak > 10 kΩ) of duidelijk onder (vaak < 3 kΩ) deze waarde lag (16). In het algemeen verlagen teststoffen die bij dieren niet corrosief zijn maar wel irriterend of niet-irriterend, de TEW niet tot onder de drempelwaarde. Bovendien kan het gebruik van andere huidpreparaten of andere apparatuur deze drempelwaarde veranderen, zodat een verdere validering nodig is.

   In de testprocedure wordt een kleurstofbindende stap opgenomen als bevestigende test voor positieve resultaten bij de TEW, onder andere voor waarden rond de 5 kΩ. Met de kleurstofbindende stap wordt bepaald of de toename van de permeabiliteit voor ionen door een fysieke vernietiging van het stratum corneum wordt veroorzaakt. Er is aangetoond dat met de TEW-methode met rattenhuid een prognose kan worden gegeven voor de in-vivobepaling van de corrosiviteit bij het konijn volgens testmethode B.4 (2).

   AANTONING VAN BEKWAAMHEID

   Voordat de TEW-testmethode met rattenhuid routinematig wordt gebruikt op een manier die aansluit bij deze testmethode, moeten laboratoria hun technische bekwaamheid aantonen door een correcte indeling van de twaalf in tabel 1 aanbevolen stoffen voor bekwaamheidstoetsing. Wanneer een stof uit de lijst niet beschikbaar is of indien zulks gerechtvaardigd is, kan een andere stof waarvoor voldoende in-vivo- en in-vitroreferentiegegevens beschikbaar zijn, worden gebruikt (bv. uit de lijst met referentiestoffen (16)), mits dezelfde selectiecriteria als in tabel 1 worden toegepast.

   Tabel 1

   Lijst van stoffen voor bekwaamheidstoetsing⁽¹⁾

   Stof	CAS RN	Chemische klasse(2)	VN-GHS/CLP-cat. op basis van in-vivoresultaten(3)	VRM-cat. op basis van in-vitroresultaten	Fysische toestand	pH(4)
   Stoffen die in vivo corrosief zijn
   Stoffen die in vivo niet corrosief zijn
   N,N’-Dimethyl-dipropyleentriamine	10563-29-8	organische base	1A	6 × C	Vloeistof	8,3
   1,2-Diaminopropaan	78-90-0	organische base	1A	6 × C	Vloeistof	8,3
   Zwavelzuur (10 %)	7664-93-9	anorganisch zuur	(1A/)1B/1C	5 × C 1 × NC	Vloeistof	1,2
   Kaliumhydroxide (10 % water)	1310-58-3	anorganische base	(1A/)1B/1C	6 × C	Vloeistof	13,2
   Octaanzuur (caprylzuur)	124-07-2	organisch zuur	1B/1C	4 × C 2 × NC	Vloeistof	3,6
   2-tert-Butylfenol	88-18-6	fenol	1B/1C	4 × C 2 × NC	Vloeistof	3,9
   Isostearinezuur	2724-58-5	organisch zuur	NC	6 × NC	Vloeistof	3,6
   4-Amino-1,2,4-triazool	584-13-4	organische base	NC	6 × NC	Vaste stof	5,5
   Fenethylbromide	103-63-9	elektrofiel	NC	6 × NC	Vloeistof	3,6
   4- (Methylthio)benzaldehyd	3446-89-7	elektrofiel	NC	6 × NC	Vloeistof	6,8
   1,9-Decadieen	1647-16-1	neutrale organische stof	NC	6 × NC	Vloeistof	3,9
   Tetrachloorethyleen	127-18-4	neutrale organische stof	NC	6 × NC	Vloeistof	4,5

   PROCEDURE

   Voor de TEW-testmethode voor huidcorrosie met rattenhuid zijn standaardwerkwijzen (Standard Operating Procedures, SOP’s) beschikbaar (19). De TEW-testmethoden met rattenhuid die door deze testmethode worden bestreken, moeten aan de volgende voorwaarden voldoen:

   Dieren

   Er moeten ratten worden gebruikt, omdat de gevoeligheid van de huid van ratten voor de stoffen in deze testmethode al eerder is aangetoond (12) en dit de enige huidbron is die formeel gevalideerd is (8) (9). De leeftijd (wanneer de huid wordt weggenomen) en de stam van de rat zijn heel belangrijk om ervoor te zorgen dat de haarfollikels in de rustfase verkeren voordat de volwassen haargroei begint.

   Het haar op de rug en de flanken van jonge (ongeveer 22 dagen oude) mannetjes- of vrouwtjesratten (Wistar of een vergelijkbare stam) wordt met een kleine schaar zorgvuldig verwijderd. De dieren worden vervolgens gewassen door zorgvuldig te wrijven terwijl het geknipte gebied wordt ondergedompeld in een antibiotica-oplossing (die bijvoorbeeld streptomycine, penicilline, chlooramfenicol en amfotericine bevat in concentraties die werkzaam zijn voor het remmen van de groei van bacteriën). De dieren worden op de derde of vierde dag na de eerste keer wassen opnieuw met antibiotica gewassen en worden binnen 3 dagen na de tweede keer wassen, wanneer het stratum corneum zich van de verwijdering van het haar hersteld heeft, gebruikt.

   Het prepareren van de huidschijfjes

   De dieren worden op humane wijze gedood wanneer ze 28-30 dagen oud zijn; deze leeftijd is van cruciaal belang. Vervolgens wordt de huid van de rug en de flanken van elk dier verwijderd en van overtollig onderhuids vet ontdaan door het voorzichtig van de huid los te trekken. Daarna worden er huidschijfjes verwijderd met een diameter van ongeveer 20 mm per stuk. De huid mag worden bewaard voordat de schijfjes worden gebruikt, wanneer wordt aangetoond dat de gegevens van de positieve en negatieve controles gelijkwaardig zijn aan die van verse huid.

   Elk huidschijfje wordt over een van de uiteinden van een PTFE-buis (polytetrafluoretheen) gelegd, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het oppervlak van de epidermis in contact met de buis is. Een rubber „O”-ring wordt strak over het uiteinde van de buis geschoven om de huid op zijn plaats te houden en het overtollige weefsel wordt weggeknipt. Vervolgens wordt de rubber „O”-ring zorgvuldig met vaseline aan de PTFE-buis vastgekit. De buis wordt met een klemring vastgezet in een receptorcompartiment dat een MgSO4-oplossing (154 mM) bevat (figuur 1). Het huidschijfje moet volledig in de MgSO4-oplossing worden ondergedompeld. Van één rattenhuid kunnen wel 10-15 huidschijfjes worden gemaakt. In figuur 2 worden de afmetingen van de buis en de „O”-ring aangegeven.

   Voordat de test begint, wordt als kwaliteitsborgingsprocedure voor elke rattenhuid de TEW van twee huidschijfjes gemeten. Als bij beide schijfjes een elektrische weerstand van meer dan 10 kΩ wordt gemeten, mogen de overige schijfjes voor de testmethode worden gebruikt. Als de gemeten weerstand lager dan 10 kΩ is, mogen de overige schijfjes van die huid niet worden gebruikt.

   Het aanbrengen van de teststof en de controlestoffen

   Voor elke testrun (elk experiment) moeten parallelle positieve en negatieve controles worden gebruikt om na te gaan of het experimentele model afdoende functioneert. Voor elke testrun (elk experiment) moeten huidschijfjes van één dier worden gebruikt. Als positieve en negatieve controlestof worden respectievelijk 10 M zoutzuur en gedestilleerd water aanbevolen.

   Vloeibare teststoffen (150 μl) worden gelijkmatig op het oppervlak van de epidermis in de buis aangebracht. Wanneer vast materiaal wordt getest, wordt een zodanige hoeveelheid van de vaste stof gelijkmatig op het schijfje aangebracht, dat het hele oppervlak van de epidermis bedekt is. Vervolgens wordt gedeïoniseerd water (150 μl) boven op de vaste stof toegevoegd en wordt de buis voorzichtig geschud. Om voor een maximaal contact met de huid te zorgen kan het nodig zijn dat vaste stoffen tot 30 °C worden verwarmd om de teststof te laten smelten of zachter te maken of worden fijngemalen om een korrelig materiaal of poeder te verkrijgen.

   In elke testrun (elk experiment) worden voor elke test- en controlestof drie huidschijfjes gebruikt. De teststoffen worden gedurende 24 uur bij 20-23 °C aangebracht. De teststof wordt verwijderd door onder een straal leidingwater van maximaal kamertemperatuur te wassen tot er geen materiaal meer kan worden verwijderd.

   TEW-metingen

   De impedantie van de huid wordt als TEW gemeten met een wisselstroombrug van Wheatstone voor zwakstroom (18). Algemene specificaties van de brug zijn: bedrijfsspanning 1-3 Volt, een sinusvormige of rechthoekige wisselstroom van 50 tot 1 000 Hz en een meetbereik van ten minste 0,1-30 kΩ. Met de bij de valideringsstudie gebruikte meetbrug konden inductantie, capacitantie en weerstand worden gemeten tot waarden van respectievelijk 2 000 H, 2 000 μF en 2 MΩ, bij frequenties van 100 Hz of 1 kHz, met seriële of parallelle waarden. Voor de TEW-corrosiviteitsbepaling worden de metingen geregistreerd in weerstand bij een frequentie van 100 Hz en met seriële waarden. Alvorens de elektrische weerstand te meten wordt de oppervlaktespanning van de huid verlaagd door zoveel 70 % ethanol toe te voegen dat de epidermis bedekt is. Na enkele seconden wordt de ethanol uit de buis verwijderd en wordt het weefsel gehydrateerd door 3 ml MgSO4-oplossing (154 mM) toe te voegen. De elektroden van de meetbrug worden aan weerszijden van het huidschijfje geplaatst om de weerstand in kΩ/huidschijfje te meten (zie figuur 1). De afmetingen van de elektrode en de lengte van het stuk elektrode dat onder de krokodillenklem uitkomt, zijn vermeld in figuur 2. De klem van de binnenste elektrode rust tijdens de weerstandsmeting op de bovenkant van de PTFE-buis om ervoor te zorgen dat steeds een even lang stuk van de elektrode in de MgSO4-oplossing steekt. De buitenste elektrode wordt zodanig in het receptorcompartiment geplaatst dat deze op de bodem van het compartiment rust. De afstand tussen de klemring en de onderkant van de PTFE-buis wordt constant gehouden (zie figuur 2), aangezien deze afstand de gemeten weerstand beïnvloedt. Dit houdt in dat de afstand tussen de binnenste elektrode en het huidschijfje constant en minimaal moet zijn (1-2 mm).

   Als de gemeten weerstand hoger is dan 20 kΩ, kan dit worden veroorzaakt door de resten van de teststof waarmee het oppervlak van de epidermis van het huidschijfje bedekt is. Deze laag kan men verder trachten te verwijderen door bijvoorbeeld de PTFE-buis met de duim (met handschoen) dicht te houden en gedurende ongeveer 10 seconden te schudden; de MgSO4-oplossing wordt weggegooid en de weerstandsmeting wordt met een verse MgSO4-oplossing herhaald.

   De eigenschappen en afmetingen van de gebruikte testapparatuur en de testprocedure kunnen de gevonden TEW-waarden beïnvloeden. De drempelwaarde voor corrosie van 5 kΩ is bepaald op grond van gegevens die met de specifieke in deze testmethode beschreven apparatuur en procedure zijn verkregen. Als de testomstandigheden worden gewijzigd of andere apparatuur wordt gebruikt, zullen de drempel- en controlewaarden dan ook wellicht verschillen. Daarom moeten de methodologie en de drempelwaarden voor de weerstand worden gekalibreerd door een aantal stoffen voor bekwaamheidstoetsing te testen die worden gekozen uit de stoffen die bij de valideringsstudie zijn gebruikt (8) (9) of uit vergelijkbare chemische klassen als de stoffen die worden bestudeerd. In tabel 1 is een verzameling geschikte stoffen voor bekwaamheidstoetsing opgenomen.

   Kleurstofbindingsmethoden

   Blootstelling aan bepaalde niet-corrosieve materialen kan leiden tot een daling van de weerstand tot onder de drempelwaarde van 5 kΩ, waardoor ionen het stratum corneum kunnen passeren en de elektrische weerstand daalt (9). Neutrale organische stoffen en stoffen met oppervlakteactieve eigenschappen (zoals detergenten, emulgatoren en andere oppervlakteactieve stoffen) kunnen huidlipiden verwijderen waardoor de permeabiliteit van de barrière voor ionen toeneemt. Dit betekent dat er, als de TEW-waarden van die chemische stoffen lager zijn dan 5 kΩ of rond deze waarde liggen en er geen sprake is van visueel waarneembare schade van de huidschijfjes, een bepaling van de kleurstofpenetratie bij de controles en de behandelde weefsels moet worden uitgevoerd om vast te stellen of de gemeten TEW-waarden het gevolg zijn van een toegenomen permeabiliteit van de huid of huidcorrosie (7) (9). Wanneer in het laatste geval het stratum corneum beschadigd is, penetreert de kleurstof sulforhodamine B snel na aanbrengen op het huidoppervlak en kleurt deze het weefsel daaronder. Deze specifieke kleurstof is stabiel voor een breed scala van stoffen en wordt niet beïnvloed door onderstaande extractieprocedure.

   Aanbrengen en verwijderen van de kleurstof sulforhodamine B

   Na de TEW-bepaling wordt de magnesiumsulfaatoplossing uit de buis verwijderd en wordt de huid zorgvuldig onderzocht op zichtbare beschadiging. Als er geen zichtbare significante beschadiging is (bv. perforatie), wordt 150 μl van een 10 %-verdunning (g/v) van de kleurstof sulforhodamine B (Acid Red 52; C.I. 45100; CAS-nummer 3520-42-1) in gedestilleerd water gedurende 2 uur op het oppervlak van de epidermis van elk huidschijfje aangebracht. De huidschijfjes worden vervolgens gedurende ongeveer 10 seconden met leidingwater van ten hoogste kamertemperatuur gewassen om een eventuele overmaat of ongebonden kleurstof te verwijderen. Elk huidschijfje wordt voorzichtig van de PTFE-buis verwijderd en in een flesje (bv. een glazen scintillatieflesje van 20 ml) met gedeïoniseerd water (8 ml) gelegd. De flesjes worden gedurende 5 minuten zachtjes geschud om eventueel nog resterende ongebonden kleurstof te verwijderen. Daarna wordt deze wasprocedure herhaald en vervolgens worden de huidschijfjes in flesjes met 5 ml 30 % (g/v) natriumdodecylsulfaat (SDS) in gedestilleerd water gelegd en een nacht bij 60 °C geïncubeerd.

   Na incubatie wordt elk huidschijfje verwijderd en weggegooid en wordt de resterende oplossing gedurende 8 minuten bij 21 °C gecentrifugeerd (relatieve centrifugale kracht ~ 175 × g). Vervolgens wordt 1 ml van het supernatans 1:5 (v/v) (d.w.z. 1 ml + 4 ml) verdund met 30 % (g/v) SDS in gedestilleerd water. De optische dichtheid (OD) van de oplossing wordt bij 565 nm gemeten.

   Berekening van het kleurstofgehalte

   Het gehalte aan de kleurstof sulforhodamine B per schijfje wordt berekend uit de OD-waarden (9) (de molaire extinctiecoëfficiënt van de kleurstof sulforhodamine B bij 565 nm = 8,7 × l0⁴; molecuulgewicht = 580). Het gehalte aan de kleurstof wordt voor elk huidschijfje bepaald door een geschikte kalibratiecurve te gebruiken en vervolgens wordt voor de duplo’s een gemiddeld kleurstofgehalte berekend.

   Aanvaardbaarheidscriteria

   De gemiddelde TEW-resultaten worden geaccepteerd als de parallelle positieve en negatieve controlewaarden binnen het voor de methode in het testlaboratorium aanvaardbare bereik liggen. Het aanvaardbare weerstandsbereik voor de in het voorgaande beschreven methodologie en apparatuur wordt in onderstaande tabel vermeld:

   Controle	Stof	Weerstandsbereik (kΩ)
   Positief	10 M zoutzuur	0,5 - 1,0
   Negatief	Gedestilleerd water	10 - 25

   De gemiddelde resultaten voor de kleurstofbinding worden geaccepteerd, mits de parallelle controlewaarden binnen het voor de methode aanvaardbare bereik liggen. Het voorgestelde aanvaardbare bereik voor het kleurstofgehalte bij de controlestoffen voor de in het voorgaande beschreven methodologie en apparatuur wordt in onderstaande tabel vermeld:

   Controle	Stof	Bereik kleurstofgehalte (μg/schijf)
   Positief	10 M zoutzuur	40 - 100
   Negatief	Gedestilleerd water	15 - 35

   Interpretatie van resultaten

   De drempelwaarde voor de TEW die als scheiding tussen corrosieve en niet-corrosieve teststoffen fungeert, werd tijdens het optimaliseren van de testmethode bepaald, tijdens de prevalideringsfase getest en bij een formele valideringsstudie bevestigd.

   Het voorspellingsmodel voor de TEW-testmethode voor huidcorrosie met rattenhuid (9) (19) in overeenstemming met het VN-GHS/CLP-classificatiesysteem is als volgt:

   De teststof wordt als niet-corrosief voor de huid beschouwd:

   1. als de gemiddelde, voor de teststof verkregen TEW-waarde hoger dan (gt;) 5 kΩ is of

   2. als de gemiddelde, voor de teststof verkregen TEW-waarde niet hoger dan (≤) 5 kΩ is en

      • de huidschijfjes geen duidelijke beschadiging (bv. perforatie) vertonen en

      • het gemiddelde kleurstofgehalte van het schijfje lager is dan (<) het gemiddelde kleurstofgehalte van het schijfje van de parallel behandelde positieve controle met 10 M HCl (zie punt 30 voor positieve controlewaarden).

   De teststof wordt als corrosief voor de huid beschouwd:

   1. als de gemiddelde, voor de teststof verkregen TEW-waarde niet hoger dan (≤) 5 kΩ is en de huidschijfjes duidelijk beschadigd (bv. geperforeerd) zijn of

   2. als de gemiddelde, voor de teststof verkregen TEW-waarde niet hoger dan (≤) 5 kΩ is en

      • de huidschijfjes geen duidelijke beschadiging (bv. perforatie) vertonen maar

      • het gemiddelde kleurstofgehalte van het schijfje ten minste gelijk is aan (≥) het gemiddelde kleurstofgehalte van het schijfje van de parallel behandelde positieve controle met 10 M HCl (zie punt 30 voor positieve controlewaarden).

   Een testrun (experiment) bestaande uit ten minste drie duplo-huidschijfjes zou voldoende moeten zijn voor een teststof, indien de indeling ervan ondubbelzinnig is. Echter, bij grensgevallen zoals niet-concordante metingen van duplo’s en/of een gemiddelde TEW van 5 ± 0,5 kΩ, moet een tweede, onafhankelijk(e) testrun (experiment) worden overwogen, en een derde in geval van niet-concordante resultaten tussen de eerste twee testruns (experimenten).

   GEGEVENS EN RAPPORTAGE

   Gegevens

   Weerstanden (kΩ) en, indien van toepassing, kleurstofgehalten (μg/schijfje) voor de teststof en de positieve en negatieve controles moeten in tabelvorm worden gerapporteerd, met vermelding van de gegevens voor elk afzonderlijke duploschijfje in elke testrun (elk experiment) en gemiddelden ± standaarddeviatie. Alle duplobepalingen moeten worden gerapporteerd. Voor elke teststof moet de waargenomen schade van de huidschijfjes worden gerapporteerd.

   Testverslag

   In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

   • Teststof en controlestoffen:

     • stof die uit één component bestaat: chemische identificatiegegevens, zoals IUPAC- of CAS-naam, CAS-nummer, SMILES- of InChI-code, structuurformule, zuiverheid, chemische identiteit van onzuiverheden, indien van toepassing en praktisch haalbaar enz.;

     • stof die uit meerdere componenten bestaat, UVCB en mengsel: voor zover mogelijk, karakterisering aan de hand van chemische identiteit (zie hierboven), kwantitatief voorkomen en relevante fysisch-chemische eigenschappen van de bestanddelen;

     • fysisch voorkomen, oplosbaarheid in water en aanvullende relevante fysisch-chemische eigenschappen;

     • bron, partijnummer indien beschikbaar;

     • behandeling van de teststof/controlestof voorafgaand aan het testen, indien van toepassing (bv. opwarming, malen);

     • stabiliteit van de teststof, uiterste gebruiksdatum, of datum voor heranalyse, indien bekend;

     • bewaaromstandigheden.

   • Proefdieren:

     • gebruikte stam en geslacht;

     • leeftijd van de dieren wanneer ze als donordieren worden gebruikt;

     • herkomst, leefomstandigheden, voeding enz.;

     • gedetailleerde gegevens over het prepareren van de huid.

   • Testomstandigheden:

     • kalibratiecurven voor de testapparatuur;

     • kalibratiecurven voor de resultaten voor de kleurstofbindingstest, de bandbreedte gebruikt voor het meten van OD-waarden, en het lineariteitsbereik voor de OD van het meettoestel (bv. spectrofotometer), indien van toepassing;

     • gedetailleerde gegevens over de voor de TEW-metingen gebruikte testprocedure;

     • gedetailleerde gegevens over de voor de bepaling van de kleurstofbinding gebruikte testprocedure, indien van toepassing;

     • gebruikte testdoses, duur van de blootstellingsperiode(n) en blootstellingstemperatu(u)r(en);

     • gedetailleerde gegevens over de gebruikte procedure voor het wassen na de blootstellingsperiode;

     • het aantal gebruikte duplo-huidschijfjes per teststof en controles (positieve en negatieve controle);

     • een beschrijving van eventuele modificaties van de testprocedure;

     • verwijzingen naar historische gegevens over het model. Hieronder moet ten minste informatie zijn over:

       1. de aanvaardbaarheid van de TEW-waarden (in kΩ) voor de positieve en negatieve controles met verwijzing naar de weerstandsbereiken van negatieve en positieve controles;

       2. de aanvaardbaarheid van de kleurstofgehalten (in μg/schijfje) voor de positieve en negatieve controles met verwijzing naar de kleurstofgehaltebereiken van negatieve en positieve controles;

       3. de aanvaardbaarheid van de testresultaten met verwijzing naar de historische variabiliteit tussen de duplo-huidschijfjes;

     • een beschrijving van de gehanteerde beslissingscriteria/het toegepaste voorspellingsmodel.

   • Resultaten:

     • een tabel met gegevens van de TEW- en kleurstofbindingsbepalingen (indien van toepassing) voor de afzonderlijke teststoffen en controles, voor elke testrun (elk experiment) en elk duplo-huidschijfje (afzonderlijke dieren en afzonderlijke huidmonsters), gemiddelden, standaarddeviaties en variatiecoëfficiënten;

     • een beschrijving van waargenomen effecten;

     • de afgeleide indeling met vermelding van het gebruikte voorspellingsmodel/de gehanteerde beslissingscriteria.

   • Bespreking van de resultaten

   • Conclusies

   LITERATUUR

   1. Verenigde Naties (VN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, VN New York en Genève, 2013. Beschikbaar op: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

   2. Hoofdstuk B.4 van deze bijlage, Acute huidirritatie/corrosie.

   3. Hoofdstuk B.40 bis van deze bijlage, In-vitrohuidmodel.

   4. Hoofdstuk B.65 van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie: testmethode op basis van de membraanbarrière.

   5. Hoofdstuk B.46 van deze bijlage, In-vitrohuidirritatie: testmethode met gereconstrueerde humane epidermis.

   6. OESO (2014). Guidance document on an Integrated Approach on Testing and Assessment (IATA) for Skin Corrosion and Irritation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 203), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   7. Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., and Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23, 219-255.

   8. Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxic.In Vitro 12, 471-482.

   9. Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhütter H.-G., and Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests For Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxic.In Vitro12, 483- 524.

   10. Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H., and Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops.ATLA23, 129-147.

   11. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

   12. EC-CEVMA (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), gepubliceerd door het raadgevend wetenschappelijk comité van het Europees Centrum voor de validatie van alternatieve methoden (ESAC10), 3 april 1998.

   13. CEVMA (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.

   14. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

   15. OESO (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 218). Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   16. Oliver G.J.A., Pemberton M.A., and Rhodes C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol.24, 507-512.

   17. Botham P.A., Hall T.J., Dennett R., McCall J.C., Basketter D.A., Whittle E., Cheeseman M., Esdaile D.J., and Gardner J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In Vitro 6,191-194.

   18. Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. and Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403.

   19. TER SOP (December 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.

   20. OESO (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   Figuur 1

   Apparatuur voor de TEW-bepaling bij Rattenhuid

   

   Figuur 2

   Afmetingen van de PTFE-Buis (Polytetrafluoretheen) en het Receptorcompartiment en de Gebruikte Elektroden

   

   Kritische factoren van bovenstaande apparatuur:

   • de binnendiameter van de PTFE-buis;

   • de lengte van de elektroden in vergelijking met de PTFE-buis en het receptorcompartiment, zodat de elektroden het huidschijfje niet mogen raken en altijd een even lang stuk van de elektrode in contact met de MgSO4-oplossing is;

   • de hoeveelheid MgSO4-oplossing in het receptorcompartiment moet zodanig zijn dat het vloeistofniveau lager is dan in de PTFE-buis (zie figuur 1);

   • het huidschijfje moet stevig genoeg op de PTFE-buis worden bevestigd, zodat de elektrische weerstand een reële maat voor de eigenschappen van de huid is.

   Aanhangsel

   DEFINITIES

   Betrouwbaarheid :
   indicatie van de mate waarin een testmethode, uitgevoerd volgens een vast protocol, op reproduceerbare wijze binnen één laboratorium en tussen laboratoria verspreid over de tijd kan worden uitgevoerd. De betrouwbaarheid wordt beoordeeld door berekening van intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid (20).
   C :
   corrosief.
   Chemische stof :
   een stof of een mengsel.
   Concordantie :
   een maat voor de prestaties van de testmethode voor testmethoden die een categoriale uitkomst geven en het is één aspect van relevantie. Deze term en de term „nauwkeurigheid” worden soms door elkaar gebruikt; de term wordt gedefinieerd als het percentage van alle geteste chemische stoffen die correct als positief of negatief worden geclassificeerd. De concordantie is sterk afhankelijk van de prevalentie van positieven in de typen teststoffen die worden onderzocht (20).
   Gevoeligheid :
   het percentage van alle positieve/actieve chemische stoffen dat door middel van de testmethode correct wordt ingedeeld. Dit is een maat voor de nauwkeurigheid van een testmethode die categoriale resultaten oplevert en is een belangrijke factor voor de beoordeling van de relevantie van een testmethode (20).
   GHS (mondiaal geharmoniseerd classificatie- en etiketteringssysteem voor chemische stoffen (VN)) :
   een systeem voor de indeling van chemische stoffen (stoffen en mengsels) op basis van gestandaardiseerde soorten en niveaus van gevaren van fysische aard en gevaren voor de gezondheid en het milieu, en dat de desbetreffende voorlichtingselementen bepaalt, zoals pictogrammen, signaalwoorden, gevarenaanduidingen, voorzorgsmaatregelen en veiligheidsinformatiebladen, waarmee informatie over de schadelijke effecten van de stoffen kenbaar wordt gemaakt teneinde mensen (waaronder werkgevers, werknemers, transporteurs, consumenten en spoedhulpverleners) en het milieu te beschermen (1).
   Huidcorrosiein vivo :
   het ontstaan van een irreversibele beschadiging van de huid, namelijk zichtbare necrose door de epidermis heen in de dermis, na het aanbrengen van een teststof gedurende ten hoogste vier uur. Corrosie-reacties worden gekenmerkt door zweren, bloedingen, bloedkorsten en, tegen het eind van de observatieperiode van 14 dagen, ontkleuring door bleking van de huid, gebieden met volledige haaruitval en littekens. Om twijfelachtig letsel te evalueren moet histopathologie worden overwogen.
   IATA :
   Integrated Approach on Testing and Assessment (geïntegreerde test- en beoordelingsbenadering).
   Mengsel :
   een mengsel of oplossing bestaande uit twee of meer stoffen.
   Nauwkeurigheid :
   de mate van overeenstemming tussen resultaten verkregen met de testmethode en erkende referentiewaarden. Dit is een maat voor de prestaties van de testmethode en één aspect van relevantie. Deze term en de term „concordantie”, waaronder het percentage correcte uitkomsten van een testmethode wordt verstaan, worden vaak door elkaar gebruikt (20).
   NC :
   niet-corrosief.
   OD :
   optische dichtheid.
   PC :
   positieve controle, een monster met alle bestanddelen van een testsysteem dat met een stof behandeld werd waarvan bekend is dat deze een positieve respons opwekt. Om te verzekeren dat variabiliteit in de positievecontrolerespons doorheen de tijd kan worden beoordeeld, mag de grootte van de positieve respons niet buitensporig zijn.
   Prestatienormen :
   normen, gebaseerd op een gevalideerde testmethode, die de basis vormen voor de beoordeling van de vergelijkbaarheid van een voorgestelde, in mechanistisch en functioneel opzicht gelijksoortige testmethode. Hieronder begrepen zijn: i) essentiële componenten van de testmethode; ii) een minimumlijst van referentiestoffen die zijn gekozen uit de stoffen die zijn gebruikt om de aanvaardbare prestaties van de gevalideerde testmethode aan te tonen; iii) de soortgelijke betrouwbaarheids- en nauwkeurigheidsniveaus die door de voorgestelde testmethode moeten worden gehaald wanneer ze worden beoordeeld aan de hand van de minimumlijst van referentiestoffen; deze waarden zijn gebaseerd op de waarden die voor de gevalideerde testmethode zijn verkregen.
   Relevantie :
   beschrijving van het verband van de testmethode met het te onderzoeken effect en of de test betekenis heeft en nuttig is voor een bepaald doel. Het is de mate waarin de testmethode het te onderzoeken biologische effect correct meet of voorspelt. Relevantie omvat een beoordeling van de nauwkeurigheid (concordantie) van een testmethode (20).
   Specificiteit :
   het percentage van alle negatieve/niet-actieve chemische stoffen dat door middel van de testmethode correct wordt ingedeeld. Dit is een maat voor de nauwkeurigheid van een testmethode die categoriale resultaten oplevert en is een belangrijke factor voor de beoordeling van de relevantie van een testmethode (20).
   Stof :
   een chemisch element en de verbindingen ervan, zoals zij voorkomen in natuurlijke toestand of bij de productie ontstaan, met inbegrip van alle additieven die nodig zijn voor het behoud van de stabiliteit ervan en alle onzuiverheden ten gevolge van het toegepaste procedé, doch met uitzondering van elk oplosmiddel dat kan worden afgescheiden zonder aantasting van de stabiliteit van de stof of wijziging van de samenstelling ervan.
   Stof die uit één component bestaat :
   een stof die wordt gekenmerkt door haar kwantitatieve samenstelling en waarin een hoofdcomponent aanwezig is in een concentratie van ten minste 80 % (w/w).
   Stof die uit meerdere componenten bestaat :
   een stof die wordt gekenmerkt door haar kwantitatieve samenstelling en waarin meer dan één hoofdcomponent aanwezig is in een concentratie van ≥ 10 % (w/w) en < 80 % (w/w). Een stof die uit meerdere componenten bestaat, is het resultaat van een fabricageproces. Het verschil tussen mengsels en stoffen die uit meerdere componenten bestaan, is dat mengsels worden verkregen door twee of meer stoffen zonder chemische reactie met elkaar te vermengen. Een stof die uit meerdere componenten bestaat, is het resultaat van een chemische reactie.
   Testrun :
   één teststof die tegelijkertijd wordt getest in ten minste drie duplo-huidschijfjes.
   Teststof :
   alle volgens deze testmethode geteste stoffen of mengsels.
   Transcutane elektrische weerstand (TEW) :
   een maat voor de elektrische impedantie van de huid, uitgedrukt als elektrische weerstand in kilo-ohm. Dit is een eenvoudige en krachtige methode om de barrièrefunctie te bepalen door de passage van ionen door de huid met behulp van een brug van Wheatstone te registreren.
   UVCB :
   stoffen met een onbekende of variabele samenstelling, complexe reactieproducten en biologische materialen..

   ”

6. In deel B wordt hoofdstuk B.40 bis vervangen door:

   IN-VITROHUIDCORROSIE: TESTMETHODE MET GERECONSTRUEERDE HUMANE EPIDERMIS (RhE)

   INLEIDING

   Deze testmethode (TM) is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 431 (2016) van de OESO. Onder huidcorrosie wordt verstaan: het ontstaan van irreversibele schade aan de huid in de vorm van zichtbare necrose door de epidermis heen in de dermis, na het aanbrengen van een teststof (zoals gedefinieerd door het mondiaal geharmoniseerd classificatie- en etiketteringssysteem voor chemische stoffen (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals, GHS) van de Verenigde Naties (VN) (1) en Verordening (EU) nr. 1272/2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking van stoffen en mengsels (CLP-verordening)⁽²⁾). Deze bijgewerkte testmethode B.40 bis bevat eenin-vitroprocedure voor het identificeren van niet-corrosieve en corrosieve stoffen en mengsels overeenkomstig het VN-GHS en de CLP-verordening. Bovendien is het aan de hand van deze methode mogelijk om corrosieve stoffen voor een deel in subcategorieën in te delen.

   De bepaling van de potentiële huidcorrosiviteit van chemische stoffen ging meestal gepaard met het gebruik van proefdieren (TM B.4, gelijkwaardig aan OESO TG 404; oorspronkelijk vastgesteld in 1981, herzien in 1992, 2002, 2015) (2). Naast deze testmethode B.40 bis zijn er nog twee anderein-vitromethoden voor het testen van het potentieel voor huidcorrosie van chemische stoffen gevalideerd en goedgekeurd als TM B.40 (gelijkwaardig aan OESO TG 430) (3) en TM B.65 (gelijkwaardig aan OESO TG 435) (4). Daarnaast is de in-vitrotestmethode B.46 (gelijkwaardig aan OESO TG 439) (5) goedgekeurd voor het testen van het huidirritatiepotentieel. In een OESO-leidraad voor een geïntegreerde test- en beoordelingsbenadering (Integrated Approach on Testing and Assessment, IATA) voor huidcorrosie en -irritatie worden verschillende modules beschreven met gedeelde informatiebronnen en analyse-instrumenten. De IATA i) biedt richtsnoeren voor de integratie en het gebruik van bestaande gegevens die zijn verzameld met behulp van test- en niet-testmethoden om het potentieel voor huidirritatie en -corrosie van chemische stoffen te beoordelen en ii) draagt een benadering aan voor wanneer verder testen nodig is (6).

   Deze testmethode heeft betrekking op huidcorrosie als eindpunt voor de menselijke gezondheid. Er wordt gebruikgemaakt van gereconstrueerde humaneepidermis (RhE) (afkomstig van uit mensen verkregen niet-getransformeerde epidermiskeratinocyten), die nauwe overeenkomsten heeft met de histologische, morfologische, biochemische en fysiologische eigenschappen van de bovenste delen van de menselijke huid,d.w.z. deepidermis. De overeenkomstige testrichtlijn van de OESO werd oorspronkelijk vastgesteld in 2004, bijgewerkt in 2013 met meer testmethoden op basis van RhE-modellen en de mogelijkheid om de methoden te gebruiken als hulpmiddel voor het indelen van corrosieve chemische stoffen in subcategorieën, en bijgewerkt in 2015 met verwijzingen naar de IATA-leidraad en de toevoeging van een alternatieve procedure die kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid te meten.

   Er zijn in deze testmethode vier gevalideerde, in de handel verkrijgbare RhE-modellen opgenomen. Voor twee van deze in de handel verkrijgbare testmodellen, EpiSkin™ Standard Model (SM) en EpiDerm™ Skin Corrosivity Test (SCT) (EPI-200) (hierna aangeduid als de Validated Reference Methods (VRM’s), gevalideerde referentiemethoden) zijn prevalideringsstudies uitgevoerd (7), gevolgd door een formele valideringsstudie voor de bepaling van huidcorrosie (8) (9) (10) (11) (12). De resultaten van deze studies hebben geleid tot de aanbeveling dat de twee voornoemde VRM’s met het oog op regelgeving konden worden gebruikt voor het onderscheiden van corrosieve (C) en niet-corrosieve (NC) stoffen, en dat EpiSkin™ bovendien kon worden gebruikt als hulpmiddel voor het indelen van corrosieve stoffen in subcategorieën (13) (14) (15). Twee andere in de handel verkrijgbare in-vitrotestmethoden met RhE betreffende huidcorrosie hebben soortgelijke resultaten opgeleverd als de VRM EpiDerm™ overeenkomstig op prestatienormen gebaseerde validering (16) (17) (18). Dit zijn SkinEthic™ RHE⁽³⁾ en epiCS® (voorheen EST-1000 genaamd) en deze kunnen ook met het oog op regelgeving worden gebruikt voor het onderscheiden van corrosieve en niet-corrosieve stoffen (19) (20). Tussen 2012 en 2014 hebben de fabrikanten van RhE-modellen post-valideringsstudies uitgevoerd met een bijgesteld protocol dat corrigeert voor storingen als gevolg van niet-specifieke MTT-reductie door de teststoffen, waardoor de prestaties van de modellen wat betreft het onderscheiden van C en NC zijn verbeterd en de indeling van corrosieve stoffen in subcategorieën wordt ondersteund (21) (22). De post-valideringsgegevens die waren gegenereerd met EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE en epiCS® zijn aan nadere statistische analyses onderworpen om alternatieve voorspellingsmodellen te identificeren die het voorspellend vermogen voor de indeling in subcategorieën hebben verbeterd (23).

   Voordat een voorgestelde soortgelijke of gewijzigde in-vitro-RhE-testmethode voor huidcorrosie anders dan de VRM’s kan worden gebruikt met het oog op regelgeving, moeten de betrouwbaarheid, relevantie (nauwkeurigheid) en beperkingen ervan voor het voorgestelde gebruik bepaald worden om te waarborgen dat de methode vergelijkbaar is met de VRM’s, overeenkomstig de vereisten van de prestatienormen (24) die zijn vastgelegd overeenkomstig de beginselen van OESO-leidraad nr. 34 (25). De wederzijdse aanvaarding van gegevens is pas gewaarborgd wanneer voorgestelde nieuwe of bijgewerkte testmethoden volgens de prestatienormen zijn geëvalueerd en zijn opgenomen in de overeenkomstige testrichtlijn. De in die testrichtlijn opgenomen testmodellen kunnen worden gebruikt om te voldoen aan de eisen die aan landen worden gesteld wat betreft de testresultaten voor een in-vitrotestmethode voor huidcorrosie, en in aanmerking te komen voor wederzijdse aanvaarding van gegevens.

   DEFINITIES

   Gebruikte definities worden gegeven in aanhangsel 1.

   INLEIDENDE OVERWEGINGEN

   Met deze testmethode kunnen niet-corrosieve en corrosieve stoffen en mengsels worden geïdentificeerd overeenkomstig het VN-GHS en de CLP-verordening. Bovendien ondersteunt de testmethode de indeling van corrosieve stoffen en mengsels in de optionele subcategorie 1A, overeenkomstig het VN-GHS (1), en een combinatie van de subcategorieën 1B en 1C (21) (22) (23). Deze testmethode heeft als beperking dat er vanwege de beperkte set van algemeen bekende in vivo corrosieve chemische stoffen die onder subcategorie 1C vallen, geen onderscheid kan worden gemaakt tussen subcategorieën voor huidcorrosie 1B en 1C overeenkomstig het VN-GHS en de CLP-verordening. De testmodellen EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE en epiCS® kunnen gebruikt worden voor indeling in subcategorieën (d.w.z. 1A versus 1B-en-1C versus NC).

   De valideringsstudie, waarin een breed spectrum aan chemische stoffen, voornamelijk individuele stoffen, is getest, ondersteunt de in deze testmethode opgenomen testmodellen wanneer ze worden gebruikt voor het identificeren van niet-corrosieve en corrosieve stoffen; de empirische databank van de valideringsstudie telt 60 stoffen die een breed spectrum aan chemische klassen bestrijken (8) (9) (10). De ontwikkelaars van de testmethode hebben tests uitgevoerd om de gevoeligheid, specificiteit, nauwkeurigheid en intralaboratoriumreproduceerbaarheid van de bepaling voor de indeling in subcategorieën aan te tonen en de resultaten daarvan zijn beoordeeld door de OESO (21) (22) (23). Op basis van de globale beschikbare gegevens is de testmethode van toepassing op een groot aantal verschillende chemische klassen en fysische toestanden, waaronder vloeistoffen, halfvaste stoffen, vaste stoffen en wassen. Vloeistoffen mogen waterig of niet-waterig zijn; vaste stoffen mogen al dan niet in water oplosbaar zijn. Waar mogelijk moeten vaste stoffen tot een fijn poeder worden vermalen voordat ze worden aangebracht; verdere voorbehandeling van het monster is niet nodig. Wanneer kan worden aangetoond dat bepaalde in deze testmethode opgenomen testmodellen niet op een specifieke categorie van teststoffen kunnen worden toegepast, mogen deze niet voor die specifieke categorie van stoffen worden gebruikt. Voorts wordt aangenomen dat deze testmethode, in het verlengde van de toepasbaarheid ervan op stoffen, ook op mengsels kan worden toegepast. Mengsels vertegenwoordigen evenwel een breed spectrum aan categorieën en samenstellingen en er is vooralsnog slechts beperkte informatie over het testen van mengsels beschikbaar. Wanneer kan worden aangetoond dat de testmethode niet op een specifieke categorie van mengsels kan worden toegepast (bv. aan de hand van een strategie zoals voorgesteld in (26)), mag de testmethode dan ook niet voor die specifieke categorie van mengsels worden gebruikt. Voordat de testmethode wordt gebruikt op een mengsel om gegevens te genereren voor een beoogd regelgevingsdoel, moet worden nagegaan of, en zo ja, waarom deze methode betrouwbare resultaten oplevert voor dat doel. Zulke overwegingen zijn niet nodig wanneer het testen van het mengsel wettelijk vereist is. Gassen en aerosolen zijn nog niet gevalideerd in valideringsstudies (8) (9) (10). Hoewel het denkbaar is dat deze met behulp van RhE-technologie kunnen worden getest, staat de huidige testmethode het testen van gassen en aerosolen niet toe.

   Teststoffen die licht absorberen in hetzelfde bereik als MTT-formazan, en teststoffen die de vitale kleurstof MTT rechtstreeks kunnen reduceren (tot MTT formazan), kunnen de metingen van de levensvatbaarheid van het weefsel verstoren, zodat het bij deze stoffen nodig is om aangepaste controles te gebruiken met het oog op correcties. Wat voor aangepaste controles er eventueel nodig zijn hangt af van het soort storing door de teststof en de procedure die wordt gebruikt voor het meten van MTT-formazan (zie punten 25-31).

   Hoewel deze testmethode geen toereikende informatie over huidirritatie oplevert, moet worden opgemerkt dat TM B.46 specifiek betrekking heeft op het gezondheidseffect huidirritatie in vitro en gebaseerd is op hetzelfde RhE-testsysteem, maar dan met een ander protocol (5). Voor een volledige beoordeling van lokale huideffecten na één blootstelling op de huid moet de OESO-leidraad voor een geïntegreerde test- en beoordelingsbenadering (Integrated Approach on Testing and Assessment, IATA) worden geraadpleegd (6). Deze IATA behelst de uitvoering van in-vitrotests op huidcorrosie (zoals in deze testmethode wordt beschreven) en huidirritatie voordat tests op levende dieren worden overwogen. Voor het gebruik van menselijke huid gelden nationale en internationale ethische overwegingen en voorwaarden.

   PRINCIPE VAN DE TEST

   De teststof wordt plaatselijk aangebracht op een driedimensionaal RhE-model dat bestaat uit niet-getransformeerde, uit mensen verkregen epidermiskeratinocyten, die gekweekt zijn om een meerlagig, hooggedifferentieerd model van de menselijke epidermis te vormen. Het model bestaat uit een georganiseerd stratum basale, stratum spinosum en stratum granulosum, en een meerlagig stratum corneum, die intercellulaire lamelvormige lipidelagen bevatten die representatief zijn voor de belangrijkste lipideklassen, analoog aan die in vivo worden aangetroffen.

   De RhE-testmethode is gebaseerd op de aanname dat corrosieve chemische stoffen door diffusie of erosie het stratum corneum kunnen penetreren en cytotoxisch zijn voor de cellen in de onderliggende cellagen. De cellevensvatbaarheid wordt gemeten door enzymatische omzetting van de vitale kleurstof MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide, thiazolylblauw tetrazoliumbromide; CAS-nummer 298-93-1] in een blauw formazanzout dat kwantitatief wordt gemeten na extractie uit weefsels (27). Corrosieve chemische stoffen worden geïdentificeerd op hun vermogen om de cellevensvatbaarheid te reduceren tot minder dan gedefinieerde drempelwaarden (zie punten 35 en 36). Er is aangetoond dat met de testmethode voor huidcorrosie op basis van RhE een prognose kan worden gegeven voor de in-vivobepaling van corrosieve effecten op de huid bij het konijn volgens TM B.4 (2).

   AANTONING VAN BEKWAAMHEID

   Voordat de vier gevalideerde RhE-testmodellen die aan deze testmethode voldoen, routinematig worden gebruikt, moeten laboratoria technische hun bekwaamheid aantonen door een correcte indeling van de twaalf in tabel 1 vermelde stoffen voor bekwaamheidstoetsing. Wanneer een methode wordt gebruikt voor indeling in subcategorieën, moet ook de juiste subcategorisering worden aangetoond. Wanneer een stof uit de lijst niet beschikbaar is of indien zulks gerechtvaardigd is, kan een andere stof waarvoor voldoende in-vivo- en in-vitroreferentiegegevens beschikbaar zijn, worden gebruikt (bv. uit de lijst met referentiestoffen (24)), mits dezelfde selectiecriteria als in tabel 1 worden toegepast.

   Tabel 1

   Lijst van stoffen voor bekwaamheidstoetsing⁽¹⁾

   Stof	CAS RN	Chemische klasse(2)	VN GHS/CLP-cat. op basis van in-vivoresultaten(3)	VRM-cat. op basis van in-vitroresultaten(4)	MTT-reducerende stof(5)	Fysische toestand
   Stoffen die in vivo corrosief zijn, subcategorie 1A
   Stoffen die in vivo corrosief zijn, combinatie van subcategorieën 1B en 1C
   Stoffen die in vivo niet corrosief zijn
   Broomazijnzuur	79-08-3	Organisch zuur	1A	(3) 1A	—	S
   Boortrifluoridedihydraat	13319-75-0	Anorganisch zuur	1A	(3) 1A	—	Vloeistof
   Fenol	108-95-2	Fenol	1A	(3) 1A	—	S
   Dichlooracetyl-chloride	79-36-7	Elektrofiel	1A	(3) 1A	—	Vloeistof
   Glyoxylzuurmonohydraat	563-96-2	Organisch zuur	1B-en-1C	(3) 1B-en-1C	—	S
   Melkzuur	598-82-3	Organisch zuur	1B-en-1C	(3) 1B-en-1C	—	Vloeistof
   Ethanolamine	141-43-5	Organische base	1B	(3) 1B-en-1C	J	Viskeus
   Zoutzuur (14,4 %)	7647-01-0	Anorganisch zuur	1B-en-1C	(3) 1B-en-1C	—	Vloeistof
   Fenethylbromide	103-63-9	Elektrofiel	NC	(3) NC	J	Vloeistof
   4-Amino-1,2,4-triazool	584-13-4	Organische base	NC	(3) NC	—	S
   4- (Methylthio)-benzaldehyd	3446-89-7	Elektrofiel	NC	(3) NC	J	Vloeistof
   Laurinezuur	143-07-7	Organisch zuur	NC	(3) NC	—	S

   Als onderdeel van deze bekwaamheidsdemonstratie wordt aanbevolen dat de gebruiker na ontvangst de door de fabrikant van het RhE-model gespecificeerde barrière-eigenschappen van de weefsels verifieert. Dit is in het bijzonder van belang indien weefsels over lange afstanden/gedurende lange perioden zijn vervoerd. Zodra een testmethode met succes is opgezet en de bekwaamheid in het gebruik ervan is aangetoond, behoeft een dergelijke verificatie niet routinematig te worden uitgevoerd. Echter, indien een testmethode routinematig wordt gebruikt, wordt aanbevolen om de barrière-eigenschappen op regelmatige basis te blijven toetsen.

   PROCEDURE

   Het onderstaande is een algemene beschrijving van de componenten en procedures van de RhE-testmodellen voor beoordeling van huidcorrosie die door deze testmethode worden bestreken. De RhE-modellen die zijn bekrachtigd als wetenschappelijk geldig voor gebruik in het kader van deze testmethode, d.w.z. de modellen EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE en epiCS® (16) (17) (19) (28) (29) (30) (31) (32) (33) zijn in de handel verkrijgbaar. Er zijn voor deze vier RhE-modellen standaardwerkwijzen (SOP’s) beschikbaar (34) (35) (36) (37). In aanhangsel 2 wordt een overzicht gegeven van de voornaamste componenten van de testmethode. Aanbevolen wordt om bij toepassing en gebruik van een van deze modellen in het laboratorium de relevante SOP’s te raadplegen. Bij het testen met de vier RhE-testmodellen die door deze testmethode worden bestreken, moet aan de volgende voorwaarden worden voldaan:

   COMPONENTEN VAN DE RHE-TESTMETHODE

   Algemene voorwaarden

   Om het epitheel op te bouwen moeten niet-getransformeerde humane keratinocyten worden gebruikt. Er moeten verschillende lagen levende epitheelcellen (stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum) aanwezig zijn onder een functioneel stratum corneum. Het stratum corneum moet uit meerdere lagen bestaan en het vereiste lipideprofiel hebben, zodat een sterke en functionele barrière wordt gevormd waar cytotoxische ijkstoffen, bv. natriumdodecylsulfaat (SDS) of Triton X-100, niet snel doorheen kunnen dringen. De barrièrefunctie moet worden aangetoond en kan worden beoordeeld door de concentratie te bepalen waarin een ijkstof de weefsellevensvatbaarheid met 50 % doet dalen (IC50) na een vaste blootstellingstijd, of door de blootstellingstijd te bepalen die nodig is om de cellevensvatbaarheid met 50 % te doen dalen (ET50) bij aanbrenging van de ijkstof in een bepaalde, vaste concentratie (zie punt 18). De omsluitingseigenschappen van het model moeten voorkomen dat materiaal om het stratum corneum heen het levende weefsel kan bereiken. Dat zou een slecht model voor huidblootstelling opleveren. Het RhE-model mag niet verontreinigd zijn met bacteriën, virussen, mycoplasma of fungi.

   Functionele voorwaarden

   Levensvatbaarheid

   De levensvatbaarheid van het weefsel wordt gekwantificeerd door middel van de MTT-test (27). De levensvatbare cellen van het RhE-weefselpreparaat reduceren de vitale kleurstof MTT tot een blauw MTT-formazanprecipitaat, dat vervolgens met isopropanol (of een vergelijkbaar oplosmiddel) uit het weefsel wordt geëxtraheerd. De optische densiteit (OD) van het extractieoplosmiddel alleen moet voldoende klein zijn, d.w.z. OD < 0,1. Het geëxtraheerde MTT-formazan kan worden gekwantificeerd met behulp van hetzij een meting van de standaard extinctie (OD) of een HPLC/UPLC-spectrofotometrieprocedure (38). Gebruikers van het RhE-model moeten waarborgen dat iedere gebruikte batch van het RhE-model voldoet aan gedefinieerde criteria voor de negatieve controle. Door de ontwikkelaar/leverancier van het RhE-model moet een aanvaardbaarheidsbereik (boven- en ondergrens) voor de OD-waarden in negatieve controle worden vastgesteld. In tabel 2 worden de aanvaardbaarheidsbereiken voor de OD-waarden in negatieve controle gegeven voor de vier gevalideerde RhE-testmodellen die in deze testmethode zijn opgenomen. Bij gebruik van HPLC/UPLC-spectrofotometrie moeten de OD-bereiken in negatieve controle in tabel 2 als aanvaardbaarheidscriterium voor de negatieve controles worden gebruikt. Gedocumenteerd moet worden dat de weefsels die in de negatieve controle worden gebruikt, gedurende de volledige blootstellingsperiode in cultuur stabiel zijn (vergelijkbare OD-metingen opleveren).

   Tabel 2

   Aanvaardbaarheidsbereiken voor OD-waarden in negatieve controle ter controle van de batchkwaliteit

   	Ondergrens aanvaardbaarheid	Bovengrens aanvaardbaarheid
   EpiSkin™ (SM)	> 0,6	< 1,5
   EpiDerm™ SCT (EPI-200)	> 0,8	< 2,8
   SkinEthic™ RHE	> 0,8	< 3,0
   epiCS®	> 0,8	< 2,8

   Barrièrefunctie

   Het stratum corneum met de daarin aanwezige lipiden moet sterk genoeg zijn om snelle penetratie van bepaalde cytotoxische ijkstoffen, bv. SDS of Triton X-100, te weerstaan, wat wordt beoordeeld aan de hand van de IC50 of ET50 (tabel 3). Voor elke batch van het gebruikte RhE-model moet de ontwikkelaar/leverancier van het RhE-model bij levering van de weefsels aan de eindgebruiker de barrièrefunctie aantonen (zie punt 21).

   Morfologie

   Het RhE-model moet aan een histologisch onderzoek onderworpen worden om aan te tonen dat de meerlagige structuur van het weefsel op die van de menselijke epidermis lijkt, met een stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum en stratum corneum, en een lipideprofiel vertoont dat vergelijkbaar is met dat van de menselijke epidermis. Voor elke batch van het gebruikte RhE-model moet de ontwikkelaar/leverancier van het RhE-model bij levering van de weefsels aan de eindgebruiker een histologisch onderzoek overleggen waarin wordt aangetoond dat de weefsels de juiste morfologie hebben (zie punt 21).

   Reproduceerbaarheid

   Gebruikers van de testmethoden moeten de reproduceerbaarheid van de testmethoden in de tijd met de positieve en negatieve controles aantonen. Bovendien mag de testmethode alleen worden gebruikt als de ontwikkelaar/leverancier van het RhE-model gegevens verstrekt die aantonen dat de resultaten met corrosieve en niet-corrosieve chemische stoffen in bv. de lijst met stoffen voor bekwaamheidstoetsing (tabel 1) reproduceerbaar zijn in de tijd. Wanneer een testmethode wordt gebruikt voor indeling in subcategorieën, moet ook de reproduceerbaarheid ten aanzien van die indeling worden aangetoond.

   Kwaliteitscontrole (QC)

   Het RhE-model mag alleen worden gebruikt als de ontwikkelaar/leverancier aantoont dat iedere batch van het gebruikte RhE-model voldoet aan gedefinieerde productievrijgavecriteria, waarvan die voor levensvatbaarheid (punt 17), barrièrefunctie (punt 18) en morfologie (punt 19) de meest relevante zijn. Deze gegevens worden aan de gebruikers van de testmethode verstrekt, zodat zij deze informatie in het testverslag kunnen opnemen. Een betrouwbare voorspelling van corrosieve effecten kan uitsluitend worden gedaan op grond van resultaten verkregen met door de QC goedgekeurde weefselbatches. Door de ontwikkelaar/leverancier van het RhE-model wordt een aanvaardbaarheidsbereik (boven- en ondergrens) voor de IC50 of de ET50 vastgesteld. In tabel 3 worden de aanvaardbaarheidsbereiken voor de vier gevalideerde testmodellen gegeven.

   Tabel 3

   QC-criteria voor batchvrijgave

   	Ondergrens aanvaardbaarheid	Bovengrens aanvaardbaarheid
   EpiSkin™ (SM) (SDS-behandeling van 18 uur) (33)	IC50 = 1,0 mg/ml	IC50 = 3,0 mg/ml
   EpiDerm™ SCT (EPI-200) (1 % Triton X-100) (34)	ET50 = 4,0 uur	ET50 = 8,7 uur
   SkinEthic™ RHE (1 % Triton X-100) (35)	ET50 = 4,0 uur	ET50 = 10,0 uur
   epiCS® (1 % Triton X-100) (36)	ET50 = 2,0 uur	ET50 = 7,0 uur

   Het aanbrengen van de teststof en de controlestoffen

   Er moeten voor elke teststof en controles voor elke blootstellingstijd ten minste twee duploweefsels worden gebruikt. Voor zowel vloeibare als vaste stoffen geldt dat er zo veel teststof moet worden aangebracht dat het epidermisoppervlak gelijkmatig bedekt is, d.w.z. ten minste 70 μl/cm² of 30 mg/cm² moet worden gebruikt, maar er mag geen oneindige dosis worden gebruikt. Afhankelijk van de modellen moet het epidermisoppervlak voor aanbrenging van vaste chemische stoffen worden bevochtigd met gedeïoniseerd of gedestilleerd water, om voor een goed contact van de teststof met het epidermisoppervlak te zorgen (34) (35) (36) (37). Indien mogelijk moeten vaste stoffen in de vorm van een fijn poeder worden getest. De wijze van aanbrengen moet geschikt zijn voor de teststof (zie bijvoorbeeld referenties 34-37). Aan het eind van de blootstellingsperiode moet de teststof zorgvuldig met een waterige buffer of 0,9 % NaCl van de epidermis worden gewassen. Afhankelijk van welke van de vier gevalideerde RhE-testmodellen wordt gebruikt, worden er twee of drie blootstellingsperioden per teststof gebruikt (voor alle vier de gevalideerde RhE-modellen: 3 min en 1 uur; voor EpiSkin™ een extra blootstellingstijd van 4 uur). Afhankelijk van het gebruikte RhE-testmodel en de beoordeelde blootstellingstijd, kan de incubatietemperatuur tijdens de blootstelling variëren tussen kamertemperatuur en 37 °C.

   In elk experiment moeten gelijktijdig uitgevoerde negatieve controles en positieve controles worden gebruikt om aan te tonen dat de levensvatbaarheid (met de negatieve controles), de barrièrefunctie en de resulterende gevoeligheid (met de positieve controles) van de weefsels binnen een gedefinieerd historisch aanvaardbaarheidsbereik liggen. Als positieve controlestoffen worden ijsazijn of 8 N KOH aanbevolen, afhankelijk van het gebruikte RhE-model. Er zij op gewezen dat 8 N KOH een rechtstreeks MTT reducerende stof is, zodat er mogelijk aangepaste controles zoals beschreven in de punten 25 en 26 nodig zijn. Als negatieve controles worden 0,9 % (g/v) NaCl of water aanbevolen.

   Metingen van de cellevensvatbaarheid

   Voor het meten van de cellevensvatbaarheid in het kader van deze testmethode moet de kwantitatieve MTT-test worden gebruikt (27). Het huidmonster wordt 3 uur in een MTT-oplossing met een geschikte concentratie (bv. 0,3 of 1 mg/ml) gelegd. Het neergeslagen blauwe formazanproduct wordt vervolgens met een oplosmiddel (bv. isopropanol, aangezuurde isopropanol) uit het weefsel geëxtraheerd, en de formazanconcentratie wordt bepaald door de OD te meten bij 570 nm, bij een bandbreedte van maximaal ± 30 nm, of door middel van een HPLC/UPLC-spectrofotometrieprocedure (zie de punten 30 en 31) (38).

   Soms verstoren teststoffen de MTT-test, door rechtstreekse reductie van MTT tot blauw formazan en/of door kleurinterferentie indien de teststof van nature of als gevolg van de behandelingsprocedures in hetzelfde OD-bereik absorbeert als formazan (570 ± 30 nm, vooral blauwe en paarse stoffen). Om mogelijke storing door deze teststoffen te detecteren en ervoor te corrigeren moeten er aanvullende controles worden uitgevoerd, zoals de controle op niet-specifieke MTT-reductie (NSMTT-controle) en de niet-specifieke kleurcontrole (NSC-controle) (zie de punten 26 tot en met 30). Dit is vooral van belang als een bepaalde teststof zich niet volledig van de huid laat wassen, of als de stof in de epidermis penetreert, en de teststof daardoor in de weefsels aanwezig is wanneer de MTT-levensvatbaarheidstest wordt uitgevoerd. Een gedetailleerde beschrijving van hoe voor rechtstreekse MTT-reductie en interferentie door kleurstoffen kan worden gecorrigeerd, is te vinden in de SOP’s voor de testmodellen (34) (35) (36) (37).

   Om rechtstreeks MTT reducerende stoffen te herkennen moet elke teststof worden toegevoegd aan vers bereid MTT-medium (34) (35) (36) (37). Als het MTT-mengsel met de teststof blauw/paars wordt, wordt de teststof als een rechtstreeks MTT reducerende stof beschouwd en moet een verdere functionele toetsing van niet-levensvatbare epidermis worden uitgevoerd, ongeacht of de meting van de standaard extinctie (OD) of een HPLC/UPLC-spectrofotometrieprocedure wordt gebruikt. Bij deze aanvullende functionele toetsing worden gedode weefsels gebruikt die slechts een residuele metabole activiteit vertonen, maar de teststof wel absorberen in vergelijkbare mate als levensvatbare weefsels. Elke MTT reducerende chemische stof wordt aangebracht op ten minste twee duplo’s van gedood weefsel per blootstellingstijd, die vervolgens de gehele huidcorrosietest ondergaan. De werkelijke levensvatbaarheid van het weefsel wordt dan berekend als de procentuele levensvatbaarheid van het weefsel verkregen met levende weefsels die zijn blootgesteld aan de MTT reducerende stof, minus het percentage niet-specifieke MTT-reductie verkregen met de gedode weefsels die aan de zelfde MTT reducerende stof zijn blootgesteld, ten opzichte van de negatieve controle die gelijktijdig met de te corrigeren test is uitgevoerd (%NSMTT).

   Om na te gaan of gekleurde teststoffen of teststoffen die gekleurd worden wanneer ze in contact komen met water of isopropanol, de test zouden kunnen verstoren en te beslissen of er aanvullende controles nodig zijn, moet een spectrumanalyse van de teststof in water (milieu tijdens blootstelling) en/of isopropanol (extractieoplossing) worden uitgevoerd. Als de teststof in water en/of isopropanol licht absorbeert in het bereik van 570 ± 30 nm, moeten er extra kleurstofcontroles worden uitgevoerd of moet als alternatief een HPLC/UPLC-spectrofotometrieprocedure worden gebruikt, in welk geval deze controles niet nodig zijn (zie de punten 30 en 31). Bij het uitvoeren van de meting van de standaard extinctie (OD) wordt elke verstorende gekleurde teststof op ten minste twee levensvatbare duploweefsels per blootstellingstijd aangebracht, die de hele huidcorrosietest doorlopen maar tijdens de MTT-incubatiestap geïncubeerd worden met medium in plaats van MTT-oplossing om zo tot een niet-specifieke kleurcontrole (NSClevend-controle) te komen. Vanwege de inherente biologische variabiliteit van levende weefsels moet de NSClevend-controle gelijktijdig worden uitgevoerd voor elke blootstellingstijd en voor elke gekleurde teststof (in elke testrun). De werkelijke levensvatbaarheid van het weefsel wordt dan berekend als de procentuele levensvatbaarheid verkregen met levende weefsels die zijn blootgesteld aan de verstorende teststof en geïncubeerd met MTT-oplossing, minus het percentage niet-specifieke kleur verkregen met levende weefsels die zijn blootgesteld aan de verstorende teststof en geïncubeerd met medium zonder MTT, gelijktijdig uitgevoerd met de te corrigeren test (%NSClevend).

   Voor teststoffen waarvan wordt vastgesteld dat ze zowel rechtstreekse reductie van MTT (zie punt 26) als kleurinterferentie veroorzaken (zie punt 27), is naast de hierboven beschreven NSMTT- en NSClevend-controles nog een derde reeks controles nodig, wanneer de meting van de standaard extinctie (OD) wordt uitgevoerd. Dit geldt doorgaans voor donkergekleurde (bv. blauwe, paarse of zwarte) teststoffen die de MTT-test verstoren, omdat hun intrinsieke kleur de beoordeling van hun vermogen om rechtstreeks MTT te reduceren zoals beschreven in punt 26, belemmert. Deze teststoffen binden mogelijk zowel aan levende als gedode weefsels en daarom corrigeert de NSMTT-controle mogelijk niet alleen voor potentiële rechtstreekse MTT-reductie door de teststof, maar ook voor kleurinterferentie die voortkomt uit de binding van de teststof aan de gedode weefsels. Dit zou kunnen leiden tot een dubbele correctie voor kleurinterferentie, aangezien de NSClevend-controle al voor kleurinterferentie als gevolg van de binding van de teststof aan levende weefsels corrigeert. Om een mogelijke dubbele correctie voor kleurinterferentie te vermijden moet een derde controle voor niet-specifieke kleur in gedode weefsels (NSCgedood) worden uitgevoerd. In deze extra controle wordt de teststof aangebracht op ten minste twee duplo’s van gedood weefsel per blootstellingstijd, die de gehele testprocedure doorlopen maar in de MTT-incubatiestap geïncubeerd worden met medium in plaats van met MTT-oplossing. Per teststof is één NSCgedood-controle voldoende, ongeacht het aantal onafhankelijke tests/testruns dat wordt uitgevoerd, maar deze moet gelijktijdig worden uitgevoerd met de NSMTT-controle en, waar mogelijk, met dezelfde weefselbatch. De werkelijke levensvatbaarheid van het weefsel wordt dan berekend als de procentuele levensvatbaarheid verkregen met levende weefsels die zijn blootgesteld aan de teststof minus %NSMTT minus %NSClevend plus het percentage niet-specifieke kleur verkregen met gedode weefsels die zijn blootgesteld aan de verstorende teststof en geïncubeerd met medium zonder MTT, ten opzichte van de negatieve controle die gelijktijdig met de te corrigeren test is uitgevoerd (%NSCgedood).

   Het is van belang op te merken dat niet-specifieke MTT-reductie en niet-specifieke kleurinterferenties ertoe kunnen leiden dat de meetwaarden voor het weefselextract buiten het lineariteitsbereik van de spectrofotometer vallen. Daarom moet elk laboratorium, alvorens te beginnen met het testen van teststoffen met het oog op regelgeving, eerst het lineariteitsbereik van de spectrofotometer bepalen met in de handel verkregen MTT-formazan (CAS-nr. 57360-69-7). meting van de standaard extinctie (OD) met een spectrofotometer is met name geschikt voor de beoordeling van rechtstreeks MTT reducerende stoffen en teststoffen die kleurinterferentie vertonen, als de OD’s van de weefselextracten die worden verkregen met de teststof zonder correctie voor rechtstreekse MTT-reductie en/of kleurinterferentie, binnen het lineariteitsbereik van de spectrofotometer vallen of als de ongecorrigeerde procentuele levensvatbaarheid die met de teststof wordt verkregen, deze al als corrosieve chemische stof heeft aangewezen (zie de punten 35 en 36). Niettemin moeten de resultaten voor teststoffen die een %NSMTT en/of een %NSClevend van > 50 % van de negatieve controle opleveren, met omzichtigheid worden benaderd.

   Voor gekleurde teststoffen die vanwege een te sterke interferentie met de MTT-test niet compatibel zijn met de meting van de standaard extinctie (OD), kan wellicht de alternatieve HPLC/UPLC-spectrofotometrieprocedure voor het meten van MTT-formazan worden toegepast (zie punt 31) (37). In het HPLC/UPLC-spectrofotometriesysteem kan het MTT-formazan voordat het gekwantificeerd wordt, van de teststof worden gescheiden (38). Daarom zijn er bij gebruik van HPLC/UPLC-spectrofotometrie geen NSClevend- of NSCgedood-controles nodig, ongeacht de geteste chemische stof. Als echter vermoed wordt dat de teststof rechtstreeks MTT reduceert of een kleur heeft die de beoordeling van het vermogen om rechtstreeks MTT te reduceren (zoals beschreven in punt 26) belemmert, moeten er wel NSMTT-controles worden toegepast. Bij gebruik van HPLC/UPLC-spectrofotometrie voor het meten van MTT-formazan wordt de procentuele levensvatbaarheid van het weefsel berekend als percentage van de piekoppervlakte voor MTT-formazan verkregen met levende weefsels die aan de teststof zijn blootgesteld, ten opzichte van de piekoppervlakte voor MTT-formazan verkregen met de gelijktijdige negatieve controle. Voor teststoffen die rechtstreeks MTT kunnen reduceren, wordt de levensvatbaarheid van het weefsel berekend als de procentuele levensvatbaarheid van het weefsel verkregen met levende weefsels die aan de teststof zijn blootgesteld, minus %NSMTT. Tot slot zij erop gewezen dat rechtstreeks MTT reducerende stoffen die mogelijk ook kleurinterferentie vertonen, als ze na de behandeling in de weefsels achterblijven en MTT zo sterk reduceren dat dit OD’s (met standaard OD-meting) of piekoppervlakten (met HPLC/UPLC-spectrofotometrie) oplevert voor de geteste weefselextracten die buiten het lineariteitsbereik van de spectrofotometer vallen, niet beoordeeld kunnen worden, hoewel dergelijke gevallen naar verwachting slechts zeer zelden voorkomen.

   HPLC/UPLC-spectrofotometrie kan voor alle typen teststoffen (al dan niet gekleurd, al dan niet MTT reducerend) worden gebruikt voor het meten van MTT-formazan (38). Vanwege de diversiteit van HPLC/UPLC-spectrofotometriesystemen moet de deugdelijkheid van het HPLC/UPLC-spectrofotometriesysteem worden aangetoond alvorens het wordt gebruikt voor het kwantificeren van MTT-formazan in weefselextracten, door aan de aanvaardbaarheidscriteria te voldoen voor een reeks standaard deugdelijkheidsparameters op basis van de parameters beschreven in de voor de industrie bestemde leidraad van de Amerikaanse Food and Drug Administration voor de validering van bioanalytische methoden (38) (39). Deze kritische parameters en de bijbehorende aanvaardbaarheidscriteria worden weergegeven in aanhangsel 4. Als aan de in aanhangsel 4 gestelde aanvaardbaarheidscriteria is voldaan, wordt het HPLC/UPLC-spectrofotometriesysteem als deugdelijk beschouwd en kan het worden gebruikt voor het meten van MTT-formazan onder de experimentele omstandigheden die worden beschreven in deze testmethode.

   Aanvaardbaarheidscriteria

   Voor elke testmethode waarbij gebruikgemaakt wordt van gevalideerde RhE-modellen, moeten weefsels die met de negatieve controle zijn behandeld een OD vertonen die binnen de aanvaardbaarheidsbereiken liggen voor de weefsels zoals beschreven in tabel 2, en mogen deze niet onder historisch vastgestelde ondergrenzen komen. Met de positieve controlestoffen,d.w.z. ijsazijn of 8 N KOH, behandelde weefsels moeten blijk geven van hun vermogen om te reageren op een corrosieve chemische stof onder de omstandigheden van het testmodel (zie aanhangsel 2). De variabiliteit tussen duploweefsels voor de teststof en/of controlestoffen moet binnen de aanvaardbare grenzen voor elk gevalideerde RhE-model liggen (zie aanhangsel 2)(het verschil in levensvatbaarheid tussen de twee duploweefsels mag bijvoorbeeld niet groter zijn dan 30 %). Als de negatieve controle of de positieve controle in een testrun buiten het aanvaarde bereik valt, wordt de testrun als ondeugdelijk beschouwd en moet deze worden overgedaan. Als de variabiliteit van de teststoffen buiten het gegeven bereik valt, moet het testen worden overgedaan.

   Interpretatie van de resultaten en voorspellingsmodel

   De voor elke teststof verkregen OD-waarden moeten worden gebruikt voor de berekening van de procentuele levensvatbaarheid in vergelijking met de negatieve controle, die op 100 % wordt gesteld. Wanneer HPLC/UPLC-spectrofotometrie wordt gebruikt, wordt de procentuele levensvatbaarheid van het weefsel berekend als percentage van de piekoppervlakte voor MTT-formazan verkregen met levende weefsels die aan de teststof zijn blootgesteld, ten opzichte van de piekoppervlakte voor MTT-formazan verkregen met de gelijktijdige negatieve controle. De drempelwaarden van de procentuele cellevensvatbaarheid die als scheiding fungeren tussen corrosieve en niet-corrosieve teststoffen (of tussen verschillende subcategorieën van corrosiviteit), worden in de onderstaande punten 35 en 36 gespecificeerd voor elk van de testmodellen die door deze testmethode worden bestreken, en moeten worden gebruikt voor de interpretatie van de resultaten.

   Eén testrun bestaande uit ten minste twee duploweefsels zou voldoende moeten zijn voor een teststof, indien de indeling ervan ondubbelzinnig is. Echter, bij grensgevallen zoals niet-concordante metingen van duplo’s, kan een tweede testrun worden overwogen, evenals een derde testrun in geval van niet-concordante resultaten tussen de eerste twee testruns.

   Het voorspellingsmodel voor het testmodel EpiSkin™ voor huidcorrosie (9) (34) (22) in overeenstemming met het VN-GHS/CLP-classificatiesysteem wordt weergegeven in tabel 4:

   Tabel 4

   Voorspellingsmodel voor EpiSkin™

   Gemeten levensvatbaarheid na blootstellingstijdstippen (t=3, 60 en 240 minuten)	Te overwegen prognose
   < 35 % na 3 min blootstelling	Corrosief: Optionele subcategorie 1A(*)
   ≥ 35 % na 3 min blootstelling EN < 35 % na 60 min blootstelling OF ≥ 35 % na 60 min blootstelling EN < 35 % na 240 min blootstelling	Corrosief: Een combinatie van de optionele subcategorieën 1B-en-1C
   ≥ 35 % na 240 min blootstelling	Niet-corrosief

   De voorspellingsmodellen voor de testmodellen voor huidcorrosie EpiDerm™ SCT (10) (23) (35), SkinEthic™ RHE (17) (18) (23) (36) en epiCS® (16) (23) (37) in overeenstemming met het VN-GHS/CLP-classificatiesysteem worden weergegeven in tabel 5:

   Tabel 5

   EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE en epiCS®

   Gemeten levensvatbaarheid na blootstellingstijdstippen (t=3 en 60 minuten)	Te overwegen prognose
   STAP 1 voor EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE en epiCS®
   STAP 2 voor EpiDerm™ SCT – voor stoffen/mengsels die in stap 1 als Corrosief zijn aangemerkt
   STAP 2 voor SkinEthic™ RHE – voor stoffen/mengsels die in stap 1 als Corrosief zijn aangemerkt
   STAP 2 voor epiCS® – voor stoffen/mengsels die in stap 1 als Corrosief zijn aangemerkt
   < 50 % na 3 min blootstelling	Corrosief
   ≥ 50 % na 3 min blootstelling EN < 15 % na 60 min blootstelling	Corrosief
   ≥ 50 % na 3 min blootstelling EN ≥ 15 % na 60 min blootstelling	Niet-corrosief
   < 25 % na 3 min blootstelling	Optionele subcategorie 1A*
   ≥ 25 % na 3 min blootstelling	Een combinatie van de optionele subcategorieën 1B en 1C
   < 18 % na 3 min blootstelling	Optionele subcategorie 1A*
   ≥ 18 % na 3 min blootstelling	Een combinatie van de optionele subcategorieën 1B en 1C
   < 15 % na 3 min blootstelling	Optionele subcategorie 1A*
   ≥ 15 % na 3 min blootstelling	Een combinatie van de optionele subcategorieën 1B en 1C

   GEGEVENS EN RAPPORTAGE

   Gegevens

   Voor elke test moeten gegevens van individuele duploweefsels (bv. de OD-waarden en de berekende procentuele cellevensvatbaarheid voor elke teststof, met inbegrip van de indeling) in tabelvorm in het verslag worden opgenomen, met vermelding van gegevens uit herhaalde experimenten, indien van toepassing. Bovendien moeten voor elke test de gemiddelden en bereiken voor de levensvatbaarheid en de variatiecoëfficiënten tussen de duploweefsels in het verslag worden opgenomen. Waargenomen interacties met het MTT-reagens door rechtstreeks MTT reducerende stoffen of gekleurde teststoffen moeten voor alle geteste stoffen worden gemeld.

   Testverslag

   In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

   • Teststof en controlestoffen:

     • stof die uit één component bestaat: chemische identificatiegegevens, zoals IUPAC- of CAS-naam, CAS-nummer, SMILES- of InChI-code, structuurformule, zuiverheid, chemische identiteit van onzuiverheden, indien van toepassing en praktisch haalbaar enz.;

     • stof die uit meerdere componenten bestaat, UVCB en mengsel: voor zover mogelijk, karakterisering aan de hand van chemische identiteit (zie hierboven), kwantitatief voorkomen en relevante fysisch-chemische eigenschappen van de bestanddelen;

     • fysisch voorkomen, oplosbaarheid in water en aanvullende fysisch-chemische eigenschappen, indien relevant;

     • bron, partijnummer indien beschikbaar;

     • behandeling van de teststof/controlestof voorafgaand aan het testen, indien van toepassing (bv. opwarming, malen);

     • stabiliteit van de teststof, uiterste gebruiksdatum, of datum voor heranalyse, indien bekend;

     • bewaaromstandigheden.

   • Het gebruikte RhE-model en -protocol en motivering daarvoor (indien van toepassing)

   • Testomstandigheden:

     • het gebruikte RhE-model (inclusief batchnummer);

     • kalibratie-informatie voor de meetapparatuur die voor het kwantificeren van MTT-formazan is gebruikt (bv. een spectrofotometer), golflengte en bandbreedte (indien van toepassing), en lineariteitsbereik van de meetapparatuur;

     • een beschrijving van de methode die voor het kwantificeren van MTT-formazan is gebruikt;

     • een beschrijving van de kwalificatie van het HPLC/UPLC-spectrofotometriesysteem, indien van toepassing;

     • volledige ondersteunende informatie over het specifieke gebruikte huidmodel, met inbegrip van de deugdelijkheid daarvan. Hieronder moet ten minste informatie zijn over:

       1. levensvatbaarheid;

       2. barrièrefunctie;

       3. morfologie;

       4. reproduceerbaarheid en voorspellend vermogen;

       5. kwaliteitscontroles (QC) van het model;

     • Verwijzingen naar historische gegevens over het model. Hieronder moet ten minste informatie zijn over de aanvaardbaarheid van de QC-gegevens met verwijzing naar historische batchgegevens,

     • aantoning van bekwaamheid in de toepassing van de testmethode voorafgaand aan routinematig gebruik door middel van het testen van de stoffen voor bekwaamheidstoetsing.

   • Testprocedure:

     • gedetailleerde gegevens over de gebruikte procedure (met inbegrip van de gebruikte procedures voor het wassen na de blootstellingsperiode);

     • de gebruikte doses van de teststof en de controlestoffen;

     • de duur van de blootstellingsperiode(n) en blootstellingstemperatu(u)r(en);

     • indicatie van de controles die zijn gebruikt voor rechtstreeks MTT-reducerende stoffen en/of gekleurde teststoffen, indien van toepassing;

     • het aantal gebruikte duploweefsels per teststof en controles (positieve controle, negatieve controle en NSMTT, NSClevend en NSCgedood, indien van toepassing), per blootstellingstijd;

     • een beschrijving van de toegepaste beslissingscriteria/het toegepaste voorspellingsmodel op basis van het gebruikte RhE-model;

     • een beschrijving van eventuele modificaties van de testprocedure (met inbegrip van procedures voor het wassen).

   • Aanvaardbaarheidscriteria voor de test en testruns:

     • gemiddelden van de positieve en negatieve controles en aanvaardbaarheidsbereiken op basis van historische gegevens;

     • aanvaardbare variabiliteit tussen de duploweefsels voor de positieve en negatieve controles;

     • aanvaardbare variabiliteit tussen de duploweefsels voor de teststof.

   • Resultaten:

     • een tabel met gegevens voor afzonderlijke teststoffen en controles, voor elke blootstellingsperiode, elke testrun en elke duplometing met inbegrip van OD of MTT-formazan-piekoppervlakte, procentuele levensvatbaarheid van de weefsels, gemiddelde procentuele levensvatbaarheid van de weefsels, verschillen tussen duplo’s, standaarddeviaties en/of variatiecoëfficiënten, indien van toepassing;

     • indien van toepassing: resultaten van de gebruikte controles voor rechtstreeks MTT reducerende stoffen en/of gekleurde teststoffen, met inbegrip van OD of MTT-formazan-piekoppervlakte, %NSMTT, %NSClevend, %NSCgedood, verschillen tussen duploweefsels, standaarddeviaties en/of variatiecoëfficiënten (indien van toepassing) en het uiteindelijke gecorrigeerde percentage voor de levensvatbaarheid van de weefsels;

     • resultaten verkregen met de teststof(fen) en controlestoffen ten opzichte van de vastgestelde aanvaardbaarheidscriteria voor de test en testruns;

     • een beschrijving van andere waargenomen effecten;

     • de afgeleide indeling met vermelding van het gebruikte voorspellingsmodel/de gehanteerde beslissingscriteria.

   • Bespreking van de resultaten

   • Conclusies

   LITERATUUR

   1. VN (2013). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth Revised Edition, VN New York en Genève. Beschikbaar op: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html

   2. Hoofdstuk B.4 van deze bijlage, Acute huidirritatie/corrosie.

   3. Hoofdstuk B.40 van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie.

   4. Hoofdstuk B.65 van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie: testmethode op basis van de membraanbarrière.

   5. Hoofdstuk B.46 van deze bijlage, In-vitrohuidirritatie: testmethode met gereconstrueerde humane epidermis.

   6. OESO (2014). Guidance document on an Integrated Approach on Testing and Assessment (IATA) for Skin Corrosion and Irritation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 203), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   7. Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., and Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23:219-255.

   8. Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and distribution of the Test Chemicals. Toxicol.In Vitro 12:471-482.

   9. Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhutter H.-G., and Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for SkinCorrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxicol.in Vitro 12:483-524.

   10. Liebsch M., Traue D., Barrabas C., Spielmann H., Uphill, P., Wilkins S., Wiemann C., Kaufmann T., Remmele M. and Holzhütter H. G. (2000). The ECVAM Prevalidation Study on the Use of EpiDerm for Skin Corrosivity Testing, ATLA 28: 371-401.

   11. Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H. et Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops, ATLA 23:129-147.

   12. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological TestMethods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

   13. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

   14. EC-CEVMA (1998). Statement on the Scientific Validity of the EpiSkin™ Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), gepubliceerd door het raadgevend wetenschappelijk comité van het Europees Centrum voor de validatie van alternatieve methoden (CEVMA) (ESAC10), 3 april 1998.

   15. EC-CEVMA (2000). Statement on the Application of the EpiDerm™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing, gepubliceerd door het raadgevend wetenschappelijk comité van het CEVMA (ESAC14), 21 maart 2000.

   16. Hoffmann J., Heisler E., Karpinski S., Losse J., Thomas D., Siefken W., Ahr H.J., Vohr H.W. and Fuchs H.W. (2005). Epidermal-Skin-Test 1000 (EST-1000)-A New Reconstructed Epidermis for In Vitro Skin Corrosivity Testing. Toxicol.In Vitro 19: 925-929.

   17. Kandárová H., Liebsch M., Spielmann,H., Genschow E., Schmidt E., Traue D., Guest R., Whittingham A., Warren N, Gamer A.O., Remmele M., Kaufmann T., Wittmer E., De Wever B., and Rosdy M. (2006). Assessment of the Human Epidermis Model SkinEthic RHE for In Vitro Skin Corrosion Testing of Chemicals According to New OECD TG 431. Toxicol.In Vitro 20: 547-559.

   18. Tornier C., Roquet M. and Fraissinette A.B. (2010). Adaptation of the Validated SkinEthic™ Reconstructed Human Epidermis (RHE) Skin Corrosion Test Method to 0,5 cm² Tissue Sample. Toxicol. In Vitro 24: 1379-1385.

   19. EC-CEVMA (2006). Statement on the Application of the SkinEthic™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing, gepubliceerd door het raadgevend wetenschappelijk comité van het CEVMA (ESAC25), 17 november 2006.

   20. EC-CEVMA (2009). ESAC Statement on the Scientific Validity of an In-Vitro Test Method for Skin Corrosivity Testing: the EST-1000, gepubliceerd door het raadgevend wetenschappelijk comité van het CEVMA (ESAC30), 12 juni 2009.

   21. OESO (2013). Summary Document on the Statistical Performance of Methods in OECD Test Guideline 431 for Sub-categorisation. Environment, Health, and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 190). Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   22. Alépée N., Grandidier M.H., and Cotovio J. (2014). Sub-Categorisation of Skin Corrosive Chemicals by the EpiSkin™ Reconstructed Human Epidermis Skin Corrosion Test Method According to UN GHS: Revision of OECD Test Guideline 431. Toxicol. In Vitro 28:131-145.

   23. Desprez B., Barroso J., Griesinger C., Kandárová H., Alépée N., and Fuchs, H. (2015). Two Novel Prediction Models Improve Predictions of Skin Corrosive Sub-categories by Test Methods of OECD Test Guideline No 431. Toxicol. In Vitro 29:2055-2080.

   24. OESO (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Reconstructed Human Epidermis (RHE) Test Methods For Skin Corrosion in Relation to OECD TG 431. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 219). Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   25. OESO (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   26. Eskes C. et al. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62:393-403.

   27. Mosmann T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Methods 65:55-63.

   28. Tinois E., et al. (1994). The Episkin Model: Successful Reconstruction of Human Epidermis In Vitro. In: In Vitro Skin Toxicology. Rougier A.,. Goldberg A.M and Maibach H.I. (Eds): 133-140.

   29. Cannon C. L., Neal P.J., Southee J.A., Kubilus J. and Klausner M. (1994), New Epidermal Model for Dermal Irritancy Testing. Toxicol.in Vitro 8:889 - 891.

   30. Ponec M., Boelsma E, Weerheim A, Mulder A, Bouwstra J and Mommaas M. (2000). Lipid and Ultrastructural Characterization of Reconstructed Skin Models. Inter. J. Pharmaceu. 203:211 - 225.

   31. Tinois E., Tillier, J., Gaucherand, M., Dumas, H., Tardy, M. and Thivolet J. (1991). In Vitro and Post - Transplantation Differentiation of Human Keratinocytes Grown on the Human Type IV Collagen Film of a Bilayered Dermal Substitute. Exp. Cell Res. 193:310-319.

   32. Parenteau N.L., Bilbo P, Nolte CJ, Mason VS and Rosenberg M. (1992). The Organotypic Culture of Human Skin Keratinocytes and Fibroblasts to Achieve Form and Function. Cytotech. 9:163-171.

   33. Wilkins L.M., Watson SR, Prosky SJ, Meunier SF and Parenteau N.L. (1994). Development of a Bilayered Living Skin Construct for Clinical Applications. Biotech. Bioeng. 43/8:747-756.

   34. EpiSkin™ SOP (December 2011). INVITTOX Protocol (No 118). EpiSkin™ Skin Corrosivity Test.

   35. EpiDerm™ SOP (February 2012). Version MK-24-007-0024 Protocol for: In Vitro EpiDerm™ Skin Corrosion Test (EPI-200-SCT), for Use with MatTek Corporation’s Reconstructed Human Epidermal Model EpiDerm.

   36. SkinEthic™ RHE SOP (January 2012). INVITTOX Protocol SkinEthic™ Skin Corrosivity Test.

   37. EpiCS® SOP (January 2012). Version 4.1 In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test Epidermal Skin Test 1000 (epiCS® ) CellSystems.

   38. Alépée N., Barroso J., De Smedt A., De Wever B., Hibatallah J., Klaric M., Mewes K.R., Millet M., Pfannenbecker U., Tailhardat M., Templier M., and McNamee P. Use of HPLC/UPLC- spectrophotometry for Detection of MTT Formazan in In Vitro Reconstructed Human Tissue (RhT)- based Test Methods Employing the MTT Assay to Expand their Applicability to Strongly Coloured Test Chemicals. Toxicol. In Vitro 29: 741-761.

   39. US FDA (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. (May 2001). Beschikbaar op: [http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm070107.pdf].

   Aanhangsel 1

   DEFINITIES

   Betrouwbaarheid :
   indicatie van de mate waarin een testmethode, uitgevoerd volgens een vast protocol, op reproduceerbare wijze binnen één laboratorium en tussen laboratoria verspreid over de tijd kan worden uitgevoerd. De betrouwbaarheid wordt beoordeeld door berekening van intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid (25).
   Cellevensvatbaarheid :
   parameter waarmee de totale activiteit van een celpopulatie wordt weergegeven, bijvoorbeeld als het vermogen van cellulaire mitochondriale dehydrogenasen om de vitale kleurstof MTT (3-[4,5-dimethylthiazool-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromide) te reduceren. Deze parameter is, afhankelijk van het gemeten eindpunt en de opzet van de test, gecorreleerd met het totale aantal levende cellen en/of de vitaliteit van de cellen.
   Chemische stof :
   een stof of een mengsel.
   Concordantie :
   dit is een maat voor de prestaties van de testmethode voor testmethoden die een categoriale uitkomst geven en het is één aspect van relevantie. Deze term en de term „nauwkeurigheid” worden soms door elkaar gebruikt; de term wordt gedefinieerd als het percentage van alle geteste chemische stoffen die correct als positief of negatief worden geclassificeerd. De concordantie is sterk afhankelijk van de prevalentie van positieven in de typen teststoffen die worden onderzocht (25).
   ET50 :
   kan worden geraamd door vaststelling van de blootstellingstijd die nodig is om de cellevensvatbaarheid met 50 % te doen dalen bij aanbrenging van de ijkstof in een bepaalde, vaste concentratie. Zie ook IC50.
   Gevoeligheid :
   het percentage van alle positieve/actieve chemische stoffen dat door middel van de testmethode correct wordt ingedeeld. Dit is een maat voor de nauwkeurigheid van een testmethode die categoriale resultaten oplevert en is een belangrijke factor voor de beoordeling van de relevantie van een testmethode (25).
   GHS (mondiaal geharmoniseerd classificatie- en etiketteringssysteem voor chemische stoffen) :
   een systeem voor de indeling van chemische producten (stoffen en mengsels) op basis van gestandaardiseerde soorten en niveaus van gevaren van fysische aard en gevaren voor de gezondheid en het milieu, en dat de desbetreffende voorlichtingselementen bepaalt, zoals pictogrammen, signaalwoorden, gevarenaanduidingen, voorzorgsmaatregelen en veiligheidsinformatiebladen, waarmee informatie over de schadelijke effecten van de stoffen kenbaar worden gemaakt teneinde mensen (waaronder werkgevers, werknemers, transporteurs, consumenten en spoedhulpverleners) en het milieu te beschermen (1).
   HPLC :
   hogeprestatievloeistofchromatografie.
   Huidcorrosiein vivo :
   het ontstaan van een irreversibele beschadiging van de huid, namelijk zichtbare necrose door deepidermis heen in de dermis, na het aanbrengen van een teststof gedurende ten hoogste vier uur. Corrosie-reacties worden gekenmerkt door zweren, bloedingen, bloedkorsten en, tegen het eind van de observatieperiode van 14 dagen, ontkleuring door bleking van de huid, gebieden met volledige haaruitval en littekens. Om twijfelachtig letsel te evalueren moet histopathologie worden overwogen.
   IATA :
   Integrated Approach on Testing and Assessment (geïntegreerde test- en beoordelingsbenadering).
   IC50 :
   kan worden geraamd door vaststelling van de concentratie waarin een ijkstof de levensvatbaarheid van de weefsels met 50 % doet dalen (IC50) na een vaste blootstellingstijd. Zie ook ET50.
   Mengsel :
   een mengsel of een oplossing bestaande uit twee of meer stoffen waarin deze stoffen geen reactie met elkaar aangaan.
   MTT :
   3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide; thiazolylblauw tetrazoliumbromide.
   Nauwkeurigheid :
   de mate van overeenstemming tussen resultaten verkregen met de testmethode en erkende referentiewaarden. Dit is een maat voor de prestaties van de testmethode en één aspect van relevantie. Deze term en de term „concordantie”, waaronder het percentage correcte uitkomsten van een testmethode wordt verstaan, worden vaak door elkaar gebruikt (25).
   Oneindige dosis :
   hoeveelheid op de epidermis aangebrachte teststof die groter is dan de hoeveelheid die nodig is om het epidermisoppervlak volledig en gelijkmatig te bedekken.
   Stof die uit één component bestaat :
   een stof die wordt gekenmerkt door haar kwantitatieve samenstelling en waarin een hoofdcomponent aanwezig is in een concentratie van ten minste 80 % (w/w).
   Stof die uit meerdere componenten bestaat :
   een stof die wordt gekenmerkt door haar kwantitatieve samenstelling en waarin meer dan één hoofdcomponent aanwezig is in een concentratie van > 10 % (w/w) en < 80 % (w/w). Een stof die uit meerdere componenten bestaat, is het resultaat van een fabricageproces. Het verschil tussen mengsels en stoffen die uit meerdere componenten bestaan, is dat mengsels worden verkregen door twee of meer stoffen zonder chemische reactie met elkaar te vermengen. Een stof die uit meerdere componenten bestaat, is het resultaat van een chemische reactie.
   NC :
   niet-corrosief.
   NSCgedood-controle :
   niet-specifieke kleurcontrole op gedode weefsels.
   NSClevend-controle :
   niet-specifieke kleurcontrole op levende weefsels.
   NSMTT :
   niet-specifieke MTT-reductie.
   OD :
   optische dichtheid.
   PC :
   positieve controle, een monster met alle bestanddelen van een testsysteem dat met een chemische stof behandeld werd waarvan bekend is dat deze een positieve respons opwekt. Om te verzekeren dat variabiliteit in de positievecontrolerespons doorheen de tijd kan worden beoordeeld, mag de grootte van de positieve respons niet buitensporig zijn.
   Prestatienormen :
   normen, gebaseerd op een gevalideerde testmethode, die de basis vormen voor de beoordeling van de vergelijkbaarheid van een voorgestelde, in mechanistisch en functioneel opzicht gelijksoortige testmethode. Hieronder begrepen zijn: i) essentiële componenten van de testmethode; ii) een minimumlijst van referentiestoffen die zijn gekozen uit de stoffen die zijn gebruikt om de aanvaardbare prestaties van de gevalideerde testmethode aan te tonen, en iii) de soortgelijke betrouwbaarheids- en nauwkeurigheidsniveaus die door de voorgestelde testmethode moeten worden gehaald wanneer ze worden beoordeeld aan de hand van de minimumlijst van referentiestoffen; deze waarden zijn gebaseerd op de waarden die voor de gevalideerde testmethode zijn verkregen (25).
   Relevantie :
   beschrijving van het verband van de testmethode met het te onderzoeken effect en of de test betekenis heeft en nuttig is voor een bepaald doel. Het is de mate waarin de testmethode het te onderzoeken biologische effect correct meet of voorspelt. Relevantie omvat een beoordeling van de nauwkeurigheid (concordantie) van een testmethode (25).
   Specificiteit :
   het percentage van alle negatieve/niet-actieve chemische stoffen dat door middel van de testmethode correct wordt ingedeeld. Dit is een maat voor de nauwkeurigheid van een testmethode die categoriale resultaten oplevert en is een belangrijke factor voor de beoordeling van de relevantie van een testmethode (25).
   Stof :
   een chemisch element en de verbindingen ervan, zoals zij voorkomen in natuurlijke toestand of bij de productie ontstaan, met inbegrip van alle additieven die nodig zijn voor het behoud van de stabiliteit ervan en alle onzuiverheden ten gevolge van het toegepaste procedé, doch met uitzondering van elk oplosmiddel dat kan worden afgescheiden zonder aantasting van de stabiliteit van de stof of wijziging van de samenstelling ervan.
   Teststof :
   alle volgens deze testmethode geteste stoffen of mengsels.
   Testrun :
   een testrun bestaat uit een of meer teststoffen die gelijktijdig worden getest met een negatieve en een positieve controle.
   UPLC :
   ultrahogeprestatievloeistofchromatografie.
   UVCB :
   stoffen met een onbekende of variabele samenstelling, complexe reactieproducten en biologische materialen.

   Aanhangsel 2

   BELANGRIJKSTE SPECIFICATIES VAN DE RHE-TESTMODELLEN DIE ZIJN GEVALIDEERD VOOR HET TESTEN VAN HUIDCORROSIE

   Specificaties van de testmodellen	EpiSkinTM	EpiDermTM SCT	SkinEthicTM RHE	epiCS®
   Oppervlak van het model	0,38 cm2	0,63 cm2	0,5 cm2	0,6 cm2
   Aantal duploweefsels	ten minste 2 per blootstellingstijd	2-3 per blootstellingstijd	ten minste 2 per blootstellingstijd	ten minste 2 per blootstellingstijd
   Doses van de behandeling en wijze van aanbrengen	Vloeistoffen en viskeuze stoffen: 50 μl ± 3 μl (131,6 μl/cm2) Vaste stoffen: 20 ± 2 mg (52,6 mg/cm2) + 100 μl ± 5 μl NaCl-oplossing (9 g/l) Wassen/klevende stoffen: 50 ± 2 mg (131,6 mg/cm2) met nylongaas	Vloeistoffen: 50 μl (79,4 μl/cm2) met of zonder nylongaas Test vooraf of de teststof compatibel is met nylongaas Halfvaste stoffen: 50 μl (79,4 μl/cm2) Vaste stoffen: 25 μl H2O (of meer indien nodig) + 25 mg (39,7 mg/cm2) Wassen: plat „schijfje” van ca. 8 mm doorsnede op het weefsel dat is bevochtigd met 15 μl H2O.	Vloeistoffen en viskeuze stoffen: 40 μl ± 3 μl (80 μl/cm2) met nylongaas Test vooraf of de teststof compatibel is met nylongaas Vaste stoffen: 20 μl ± 2 μl H2O + 20 ± 3 mg (40 mg/cm2) Wassen/klevende stoffen: 20 ± 3 mg (40 mg/cm2) met nylongaas	Vloeistoffen: 50 μl (83,3 μl/cm2) met nylongaas Test vooraf of de teststof compatibel is met nylongaas Halfvaste stoffen: 50 μl (83,3 μl/cm2) Vaste stoffen: 25 mg (41,7 mg/cm2) + 25 μl H2O (of meer indien nodig) Wassen: plat „schijfje” van ca. 8 mm doorsnede op het weefsel dat is bevochtigd met 15 μl H2O.
   Voorafgaande toetsing op rechtstreekse MTT-reductie	50 μl (vloeistof) of 20 mg (vaste stof)+ 2 ml MTT 0,3 mg/ml oplossing gedurende 180 ± 5 min bij 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH → als de oplossing blauw/paars wordt, moeten er aangepaste controles met in water gedode weefsels worden uitgevoerd	50 μl (vloeistof) of 25 mg (vaste stof)+ 1 ml MTT 1 mg/ml oplossing gedurende 60 min bij 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH → als de oplossing blauw/paars wordt, moeten er aangepaste controles met door bevriezing gedode weefsels worden uitgevoerd	40 μl (vloeistof) of 20 mg (vaste stof)+ 1 ml MTT 1 mg/ml oplossing gedurende 180 ± 15 min bij 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH → als de oplossing blauw/paars wordt, moeten er aangepaste controles met door bevriezing gedode weefsels worden uitgevoerd	50 μl (vloeistof) of 25 mg (vaste stof)+ 1 ml MTT 1 mg/ml oplossing gedurende 60 min bij 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH → als de oplossing blauw/paars wordt, moeten er aangepaste controles met door bevriezing gedode weefsels worden uitgevoerd
   Voorafgaande toetsing op kleurinterferentie	10 μl (vloeistof) of 10 mg (vaste stof) + 90 μl H2O gemengd gedurende 15 min bij RT → als de oplossing gekleurd wordt, moeten er aangepaste controles met levende weefsels worden uitgevoerd	50 μl (vloeistof) of 25 mg (vaste stof) + 300 μl H2O gedurende 60 min bij 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH → als de oplossing gekleurd wordt, moeten er aangepaste controles met levende weefsels worden uitgevoerd	40 μl (vloeistof) of 20 mg (vaste stof) + 300 μl H2O gemengd gedurende 60 min bij kamertemp. → als de teststof gekleurd is, moeten er aangepaste controles met levende weefsels worden uitgevoerd	50 μl (vloeistof) of 25 mg (vaste stof) + 300 μl H2O gedurende 60 min bij 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH → als de oplossing gekleurd wordt, moeten er aangepaste controles met levende weefsels worden uitgevoerd
   Blootstellingstijd en -temperatuur	3 min, 60 min (± 5 min) en 240 min (± 10 min) in zuurkast bij kamertemperatuur (18-28 °C)	3 min bij kamertemp., en 60 min bij 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH	3 min bij kamertemp., en 60 min bij 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH	3 min bij kamertemp., en 60 min bij 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH
   Wassen	25 ml 1x PBS (met fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing) (PBS) (2 ml/keer)	20 keer met constante zachte straal van 1x PBS	20 keer met constante zachte straal van 1x PBS	20 keer met constante zachte straal van 1x PBS
   Negatieve controle	50 μl NaCl-oplossing (9 g/l) Getest bij elke blootstellingstijd	50 μl H2O Getest bij elke blootstellingstijd	40 μl H2O Getest bij elke blootstellingstijd	50 μl H2O Getest bij elke blootstellingstijd
   Positieve controle	50 μl ijsazijn Slechts 4 uur lang getest	50 μl 8 N KOH Getest bij elke blootstellingstijd	40 μl 8 N KOH Slechts 1 uur lang getest	50 μl 8 N KOH Getest bij elke blootstellingstijd
   MTT-oplossing	2 ml 0,3 mg/ml	300 μl 1 mg/ml	300 μl 1 mg/ml	300 μl 1 mg/ml
   MTT-incubatieduur en -temperatuur	180 min (± 15 min) bij 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH	180 min bij 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH	180 min (± 15 min) bij 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH	180 min bij 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH
   Extractievloeistof	500 μl aangezuurde isopropanol (0,04 N HCl in isopropanol) (volledige onderdompeling geïsoleerd weefsel)	2 ml isopropanol (extractie van boven- en onderkant van inzetstuk)	1,5 ml isopropanol (extractie van boven- en onderkant van inzetstuk)	2 ml isopropanol (extractie van boven- en onderkant van inzetstuk)
   Extractieduur en -temperatuur	Gedurende een nacht bij kamertemp., beschermd tegen licht	Gedurende een nacht niet geroerd bij kamertemp. of gedurende 120 min onder roeren (~120 rpm) bij kamertemp.	Gedurende een nacht niet geroerd bij kamertemp. of gedurende 120 min onder roeren (~120 rpm) bij kamertemp.	Gedurende een nacht niet geroerd bij kamertemp. of gedurende 120 min onder roeren (~120 rpm) bij kamertemp.
   OD-meting	570 nm (545 - 595 nm) zonder referentiefilter	570 nm (of 540 nm) zonder referentiefilter	570 nm (540 - 600 nm) zonder referentiefilter	540 - 570 nm zonder referentiefilter
   Weefselkwaliteitscontrole	SDS-behandeling van 18 uur 1,0 mg/ml ≤ IC50 ≤ 3,0 mg/ml	Behandeling met 1 % Triton X-100 4,08 uur ≤ ET50 ≤ 8,7 uur	Behandeling met 1 % Triton X-100 4,0 uur ≤ ET50 ≤ 10,0 uur	Behandeling met 1 % Triton X-100 2,0 uur ≤ ET50 ≤ 7,0 uur
   Aanvaardbaarheidscriteria	De gemiddelde OD van de duploweefsels behandeld met de negatieve controle (NaCl) moet voor elke blootstellingstijd ≥ 0,6 en ≤ 1,5 zijn De gemiddelde levensvatbaarheid van de duploweefsels die gedurende 4 uur zijn blootgesteld aan de positieve controle (ijsazijn), uitgedrukt als % van de negatieve controle, moet ≤ 20 % zijn In het bereik van 20-100 % levensvatbaarheid en voor OD’s ≥ 0,3 mag het verschil in levensvatbaarheid tussen twee duploweefsels niet groter zijn dan 30 %.	De gemiddelde OD van de duploweefsels behandeld met de negatieve controle (H2O) moet voor elke blootstellingstijd ≥ 0,8 en ≤ 2,8 zijn De gemiddelde levensvatbaarheid van de duploweefsels die gedurende 1 uur zijn blootgesteld aan de positieve controle (8 N KOH), uitgedrukt als % van de negatieve controle, moet < 15 % zijn In het bereik van 20 - 100 % levensvatbaarheid moet de variatiecoëfficiënt (CV) tussen de duploweefsels ≤ 30 % zijn	De gemiddelde OD van de duploweefsels behandeld met de negatieve controle (H2O) moet voor elke blootstellingstijd ≥ 0,8 en ≤ 3,0 zijn De gemiddelde levensvatbaarheid van de duploweefsels die gedurende 1 uur (en 4 uur indien van toepassing) zijn blootgesteld aan de positieve controle (8 N KOH), uitgedrukt als % van de negatieve controle, moet < 15 % zijn In het bereik van 20-100 % levensvatbaarheid en voor OD’s ≥ 0,3 mag het verschil in levensvatbaarheid tussen twee duploweefsels niet groter zijn dan 30 %	De gemiddelde OD van de duploweefsels behandeld met de negatieve controle (H2O) moet voor elke blootstellingstijd ≥ 0,8 en ≤ 2,8 zijn De gemiddelde levensvatbaarheid van de duploweefsels die gedurende 1 uur zijn blootgesteld aan de positieve controle (8 N KOH), uitgedrukt als % van de negatieve controle, moet < 20 % zijn In het bereik van 20-100 % levensvatbaarheid en voor OD’s ≥ 0,3 mag het verschil in levensvatbaarheid tussen twee duploweefsels niet groter zijn dan 30 %

   Aanhangsel 3

   PRESTATIES VAN DE TESTMODELLEN VOOR INDELING IN SUBCATEGORIEËN

   In de onderstaande tabel zijn de prestaties weergegeven van de vier testmodellen berekend op basis van een set van 80 door de vier testontwikkelaars geteste chemische stoffen. De berekeningen werden uitgevoerd door het secretariaat van de OESO en vervolgens beoordeeld en goedgekeurd door een subgroep van deskundigen (21) (23).

   De testmodellen EpiSkin™, EpiDerm™, SkinEthic™ en epiCS® kunnen gebruikt worden voor indeling in subcategorieën (d.w.z. 1A versus 1B-en-1C versus NC)

   De prestaties, percentages overclassificering (te strenge indeling) en onderclassificering (onvoldoende strenge indeling), en nauwkeurigheid (voorspellingskracht) van de vier testmodellen op basis van een set van 80 chemische stoffen die alle in 2 of 3 testruns werden getest voor elk testmodel:

   STATISTIEKEN OVER DE PROGNOSES VOOR DE GEHELE SET VAN CHEMISCHE STOFFEN

   (n= 80 chemische stoffen, getest in 2 onafhankelijke testruns voor epiCS® of 3 onafhankelijke testruns voor EpiDerm™ SCT, EpiSkin™ en SkinEthic™ RHE, d.w.z. respectievelijk 159^(*) of 240 indelingen)

   	EpiSkin™	EpiDerm TM	SkinEthic™	epiCS®
   Overgeclassificeerd:
   1B-en-1C overgeclassificeerd als 1A	21,50 %	29,0 %	31,2 %	32,8 %
   NC overgeclassificeerd als 1B-en-1C	20,7 %	23,4 %	27,0 %	28,4 %
   NC overgeclassificeerd als 1A	0,00 %	2,7 %	0,0 %	0,00 %
   overgeclassificeerd als Corrosief	20,7 %	26,1 %	27,0 %	28,4 %
   Totaal percentage overgeclassificeerd (alle categorieën)	17,9 %	23,3 %	24,5 %	25,8 %
   Ondergeclassificeerd:
   1A ondergeclassificeerd als 1B-en-1C	16,7 %	16,7 %	16,7 %	12,5 %
   1A ondergeclassificeerd als NC	0,00 %	0,00 %	0,00 %	0,00 %
   1B-en-1C ondergeclassificeerd als NC	2,2 %	0,00 %	7,5 %	6,6 %
   Totaal percentage ondergeclassificeerd (alle categorieën)	3,3 %	2,5 %	5,4 %	4,4 %
   Correct ingedeeld:
   1A correct ingedeeld	83,3 %	83,3 %	83,3 %	87,5 %
   1B-en-1C correct ingedeeld	76,3 %	71,0 %	61,3 %	60,7 %
   NC correct ingedeeld	79,3 %	73,9 %	73,0 %	71,62 %
   Algemene nauwkeurigheid	78,8 %	74,2 %	70 %	69,8 %

   NC: niet-corrosief

   Aanhangsel 4

   Kritische parameters en aanvaardbaarheidscriteria voor kwalificaties van een HPLC/UPLC-spectrofotometriesysteem voor meting van uit RhE-weefsel geëxtraheerd MTT-formazan

   Parameter	Protocol ontleend aan FDA-leidraad (37) (38)	Aanvaardbaarheidscriteria
   Selectiviteit	Analyse van isopropanol, levende blanco (isopropanolextract van onbehandelde levende RhE-weefsels), dode blanco (isopropanolextract van onbehandelde gedode RhE-weefsels)	Oppervlakteinterferentie ≤ 20 % van OppervlakteLLOQ (1)
   Precisie	Kwaliteitscontroles (d.w.z. MTT-formazan bij 1,6 μg/ml, 16 μg/ml en 160 μg/ml ) in isopropanol (n=5)	CV ≤ 15 % of ≤ 20 % voor de LLOQ
   Nauwkeurigheid	Kwaliteitscontroles in isopropanol (n=5)	%Afw. ≤ 15 % of ≤ 20 % voor de LLOQ
   Matrixeffect	Kwaliteitscontroles in levende blanco (n=5)	85 % ≤ percentage matrixeffect ≤ 115 %
   Carry-over	Analyse van isopropanol na een ULOQ2-standaard(2)	Oppervlakteinterferentie ≤ 20 % van OppervlakteLLOQ
   Reproduceerbaarheid (binnen één dag)	3 onafhankelijke kalibratiecurven (op basis van 6 achtereenvolgende 1/3 verdunningen van MTT-formazan in isopropanol beginnend bij de ULOQ, d.w.z. 200 μg/ml); Kwaliteitscontroles in isopropanol (n=5)	Kalibratiecurven: %Afw. ≤ 15 % of ≤ 20 % voor de LLOQ Kwaliteitscontroles: %Afw. ≤ 15 % en CV ≤ 15 %
   Reproduceerbaarheid (van dag tot dag)	Dag 1 1 kalibratiecurve en kwaliteitscontroles in isopropanol (n=3) Dag 2 1 kalibratiecurve en kwaliteitscontroles in isopropanol (n=3) Dag 3 1 kalibratiecurve en kwaliteitscontroles in isopropanol (n=3)
   Kortetermijnstabiliteit van MTT-formazan in RhE-weefselextract	Kwaliteitscontroles op levende blanco (n=3) geanalyseerd op de dag van bereiding en na 24 uur bewaring bij kamertemperatuur	%Afw. ≤ 15 %
   Langetermijnstabiliteit van MTT-formazan in RhE-weefselextract, indien nodig	Kwaliteitscontroles op levende blanco (n=3) geanalyseerd op de dag van bereiding en na meerdere dagen bewaring bij een gespecificeerde temperatuur (bv. 4 oC, -20 oC, -80 oC)	%Afw. ≤ 15 %

   ”

7. In deel B wordt hoofdstuk B.46 vervangen door:

   IN-VITROHUIDIRRITATIE: TESTMETHODE MET GERECONSTRUEERDE HUMANE EPIDERMIS

   INLEIDING

   Deze testmethode (TM) is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 439 (2015) van de OESO. Onder huidirritatie wordt verstaan: het ontstaan van reversibele schade aan de huid na het aanbrengen van een teststof gedurende maximaal 4 uur (zoals gedefinieerd door het mondiaal geharmoniseerd classificatie- en etiketteringssysteem voor chemische stoffen (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals, GHS) van de Verenigde Naties (VN) (1) en Verordening (EU) nr. 1272/2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking van stoffen en mengsels (CLP-verordening)⁽⁴⁾. Deze testmethode bevat een in-vitroprocedure die gebruikt kan worden om de gevaren van irriterende chemische stoffen (stoffen en mengsels) te identificeren in overeenstemming met VN-GHS/CLP-categorie 2 (2). In regio’s die niet de optionele VN-GHS-categorie 3 (licht irriterende stoffen) hebben aangenomen, kan deze testmethode ook worden gebruikt om niet-ingedeelde chemische stoffen te identificeren. Afhankelijk van het regelgevend kader en het gebruikte classificatiesysteem kan deze testmethode worden gebruikt om de door chemische stoffen veroorzaakte huidirritatie te bepalen als een zelfstandige vervangende test voor in-vivohuidirritatietests of als een gedeeltelijk vervangende test binnen een teststrategie (3).

   De bepaling van de huidirritatie ging meestal gepaard met het gebruik van proefdieren [TM B.4, gelijkwaardig aan OESO TG 404; oorspronkelijk vastgesteld in 1981, herzien in 1992, 2002, 2015] (4). Voor het testen op corrosiviteit zijn drie gevalideerde in-vitrotestmethoden goedgekeurd als EU TM B.40 (gelijkwaardig aan OESO TG 430), TM B.40 bis (gelijkwaardig aan OESO TG 431) en TM B.65 (gelijkwaardig aan OESO TG 435) (5) (6) (7). In een OESO-leidraad voor een geïntegreerde test- en beoordelingsbenadering (Integrated Approach on Testing and Assessment, IATA) voor huidcorrosie en -irritatie worden verschillende modules beschreven met gedeelde informatiebronnen en analyse-instrumenten. De IATA i) biedt richtsnoeren voor de integratie en het gebruik van bestaande gegevens die zijn verzameld met behulp van test- en niet-testmethoden om het potentieel voor huidirritatie en -corrosie van chemische stoffen te beoordelen en ii) draagt een benadering aan voor wanneer verder testen nodig is (3).

   Deze testmethode heeft betrekking op huidirritatie als eindpunt voor de menselijke gezondheid. De testmethode is gebaseerd op het in-vitrotestsysteem van gereconstrueerde humane epidermis (RhE), dat nauwe overeenkomsten heeft met de biochemische en fysiologische eigenschappen van de bovenste delen van de menselijke huid, d.w.z. de epidermis.Voor het RhE-testsysteem worden uit mensen verkregen niet-getransformeerde keratinocyten als celbron gebruikt om een epidermismodel te reconstrueren met een representatieve histologie en cytoarchitectuur. Er zijn prestatienormen beschikbaar voor de validering en beoordeling van soortgelijke en gewijzigde op RhE gebaseerde testmethoden, in overeenstemming met de beginselen van OESO-richtsnoer nr. 34 (8) (9). De overeenkomstige testrichtlijn werd oorspronkelijk vastgesteld in 2010, bijgewerkt in 2013 met meer RhE-modellen en bijgewerkt in 2015 met verwijzingen naar de IATA-leidraad en de toevoeging van een alternatieve procedure die kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid te meten.

   Er zijn prevaliderings-, optimaliserings- en valideringsstudies afgerond voor vier in de handel verkrijgbare in-vitrotestmodellen (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) op basis van het RhE-testsysteem (gevoeligheid 80 %, specificiteit 70 % en nauwkeurigheid 75 %). Deze vier testmodellen zijn in deze testmethode opgenomen. Aanhangsel 2 bevat een overzicht ervan, alsmede informatie over het soort valideringsstudie dat voor de validering van de verschillende testmethoden is gebruikt. Zoals opgemerkt in aanhangsel 2 is voor de ontwikkeling van deze testmethode en de prestatienormen gebruikgemaakt van de gevalideerde referentiemethode (Validated Reference Method, VRM) (8).

   De wederzijdse aanvaarding van gegevens in overeenstemming met de OESO-overeenkomst is enkel gewaarborgd voor testmodellen die zijn gevalideerd volgens de prestatienormen (8), voor zover die testmodellen door de OESO zijn geëvalueerd en goedgekeurd. De in deze testmethode en de overeenkomstige OESO-testrichtlijn opgenomen testmodellen kunnen zonder onderscheid worden gebruikt om te voldoen aan de eisen die aan landen worden gesteld wat betreft de testresultaten van in-vitrotestmethoden voor huidirritatie, en in aanmerking te komen voor wederzijdse aanvaarding van gegevens.

   Definities van in dit document gebruikte termen worden gegeven in aanhangsel 1.

   INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN BEPERKINGEN

   Zoals de volledige prospectieve valideringsstudie ter beoordeling en karakterisering van RhE-testmethoden (16) aantoont, bevat de testmethode de beperking dat de chemische stoffen niet kunnen worden ingedeeld in de optionele VN- GHS-categorie 3 (licht irriterende stoffen) (1). Hoe deze testmethode wordt gebruikt, zal dan ook worden beslist door de OESO-landen in het desbetreffende regelgevingskader. Voor de EU is categorie 3 niet opgenomen in de CLP-verordening. Voor een volledige beoordeling van lokale huideffecten na één blootstelling op de huid moet de OESO-leidraad voor een geïntegreerde test- en beoordelingsbenadering (Integrated Approach on Testing and Assessment, IATA) worden geraadpleegd (3). Voor het gebruik van menselijke huid gelden nationale en internationale ethische overwegingen en voorwaarden.

   Deze testmethode heeft betrekking op huidirritatie als eindpunt voor de menselijke gezondheid. Hoewel deze testmethode geen toereikende informatie over huidcorrosie oplevert, moet worden opgemerkt dat TM B.40 bis (gelijkwaardig aan OESO TG 431) betreffende huidcorrosie gebaseerd is op hetzelfde RhE-testsysteem, maar met gebruikmaking van een ander protocol (6). Deze testmethode is gebaseerd op RhE-modellen die gebruikmaken van menselijke keratinocyten, die derhalve in vitro het doelorgaan van het te onderzoeken bestanddeel vertegenwoordigen. Bovendien heeft de methode direct betrekking op de eerste fase van de inflammatoire reactie/het werkingsmechanisme (cel- en weefselbeschadiging leidend tot plaatselijk trauma) die tijdens irritatie in vivo plaatsvindt. Bij de onderliggende validering van deze testmethode werd een groot aantal chemische stoffen getest. De databank van de valideringsstudie bevatte in totaal 58 chemische stoffen (16) (18) (23). De testmethode is van toepassing op vaste stoffen, vloeibare stoffen, halfvaste stoffen en wassen. Vloeistoffen mogen waterig of niet-waterig zijn; vaste stoffen mogen al dan niet in water oplosbaar zijn. Waar mogelijk moeten vaste stoffen tot een fijn poeder worden vermalen voordat ze worden aangebracht; verdere voorbehandeling van het monster is niet nodig. Gassen en aerosolen zijn nog niet gevalideerd in een valideringsstudie (29). Hoewel het denkbaar is dat deze met behulp van RhE-technologie kunnen worden getest, staat de huidige testmethode het testen van gassen en aerosolen niet toe.

   Voordat de testmethode wordt gebruikt op een mengsel om gegevens te genereren voor een beoogd regelgevingsdoel, moet worden nagegaan of, en zo ja, waarom deze methode betrouwbare resultaten oplevert voor dat doel. Zulke overwegingen zijn niet nodig wanneer het testen van het mengsel wettelijk vereist is. Mengsels vertegenwoordigen evenwel een breed spectrum aan categorieën en samenstellingen en er is vooralsnog slechts beperkte informatie over het testen van mengsels beschikbaar. Wanneer kan worden aangetoond dat de testmethode niet op een specifieke categorie van mengsels kan worden toegepast (bv. aan de hand van een strategie zoals voorgesteld in Eskes et al., 2012) (30), mag de testmethode dan ook niet voor die specifieke categorie van mengsels worden gebruikt. Evenzeer moet voorzichtigheid worden betracht wanneer bepaalde chemische klassen of fysisch-chemische eigenschappen niet geschikt blijken te zijn voor de huidige testmethode.

   Teststoffen die licht absorberen in hetzelfde bereik als MTT-formazan, en teststoffen die de vitale kleurstof MTT rechtstreeks kunnen reduceren (tot MTT formazan), kunnen de metingen van de cellevensvatbaarheid verstoren, zodat het bij deze stoffen nodig is om aangepaste controles te gebruiken met het oog op correcties (zie punten 28-34).

   Eén test bestaande uit drie gerepliceerde weefsels zou voldoende moeten zijn voor een teststof, indien de indeling ervan ondubbelzinnig is. Echter, bij grensgevallen zoals niet-concordante metingen van duplo’s en/of een gemiddelde procentuele levensvatbaarheid van 50 ± 5 %, moet een tweede testrun worden overwogen, evenals een derde testrun in geval van niet-concordante resultaten tussen de eerste twee testruns.

   PRINCIPE VAN DE TEST

   De teststof wordt plaatselijk aangebracht op een driedimensionaal RhE-model dat bestaat uit niet-getransformeerde, uit mensen verkregen epidermiskeratinocyten, die gekweekt zijn om een meerlagig, hooggedifferentieerd model van de menselijke epidermis te vormen. Het model bestaat uit een georganiseerd stratum basale, stratum spinosum en stratum granulosum, en een meerlagig stratum corneum, die intercellulaire lamelvormige lipidelagen bevatten die representatief zijn voor de belangrijkste lipideklassen, analoog aan die in vivo worden aangetroffen.

   Door chemische stoffen geïnduceerde huidirritatie, die zich voornamelijk manifesteert als erytheem en oedeem, is het gevolg van een cascade van gebeurtenissen, beginnend met de penetratie van de chemische stoffen door het stratum corneum waar ze de onderliggende keratinocytlagen en andere huidcellen kunnen beschadigen. De beschadigde cellen kunnen ontstekingsmediatoren afgeven of een inflammatoire cascade veroorzaken die ook inwerkt op de cellen in de dermis, in het bijzonder de stroma- en endotheliale cellen van de bloedvaten. Door de dilatatie en verhoogde permeabiliteit van de endotheliale cellen ontstaan het waargenomen erytheem en oedeem (29). Opgemerkt moet worden dat de op RhE gebaseerde testmodellen, bij gebrek aan vascularisatie in het in-vitrotestsysteem, de initiërende gebeurtenissen in de cascade, bv. cel-/weefselbeschadiging (16) (17), meten met de cellevensvatbaarheid als meetwaarde.

   De cellevensvatbaarheid in RhE-modellen wordt gemeten door enzymatische omzetting van de vitale kleurstof MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide, thiazolylblauw; CAS-nummer 298-93-1] in een blauw formazanzout dat kwantitatief wordt gemeten na extractie uit weefsels (31). Irriterende chemische stoffen worden geïdentificeerd op hun vermogen om de cellevensvatbaarheid te reduceren tot minder dan gedefinieerde drempelwaarden (d.w.z. ≤ 50 %, voor VN-GHS/CLP-categorie 2). Afhankelijk van het regelgevend kader en de toepasbaarheid van de testmethode, kunnen chemische stoffen die leiden tot een levensvatbaarheid van cellen van meer dan de gedefinieerde grenswaarde, beschouwd worden als niet-irriterende stoffen (d.w.z. > 50 %, geen categorie).

   AANTONING VAN BEKWAAMHEID

   Voordat de vier gevalideerde testmodellen die aan deze testmethode voldoen (aanhangsel 2), routinematig worden gebruikt, moeten laboratoria hun technische bekwaamheid aantonen aan de hand van de tien in tabel 1 vermelde stoffen voor bekwaamheidstoetsing. Wanneer een stof uit de lijst bijvoorbeeld niet beschikbaar is, kan een andere stof waarvoor voldoende in-vivo- en in-vitroreferentiegegevens beschikbaar zijn, worden gebruikt (bv. uit de lijst met referentiestoffen (8)), mits dezelfde selectiecriteria als in tabel 1 worden toegepast. Het gebruik van een alternatieve stof voor bekwaamheidstoetsing moet worden gerechtvaardigd.

   Als onderdeel van deze bekwaamheidstoetsing wordt aanbevolen dat de gebruikers na ontvangst de door de fabrikant van het RhE-model gespecificeerde barrière-eigenschappen van de weefsels verifiëren. Dit is in het bijzonder van belang indien weefsels over lange afstanden/gedurende lange perioden zijn vervoerd. Zodra een testmethode met succes is opgezet en de bekwaamheid in het gebruik ervan is verworven en aangetoond, behoeft een dergelijke verificatie niet routinematig te worden uitgevoerd. Echter, indien een testmethode routinematig wordt gebruikt, wordt aanbevolen om de barrière-eigenschappen op regelmatige basis te blijven toetsen.

   Tabel 1

   Stoffen voor bekwaamheidstoetsing⁽¹⁾

   Stof	CAS-nr.	In-vivoscore(2)	Fysische toestand	VN-GHS-categorie
   NIET-INGEDEELDE STOFFEN (VN-GHS Geen categorie)
   naftaleenazijnzuur	86-87-3	0	Vaste stof	Geen cat.
   isopropanol	67-63-0	0,3	Vloeistof	Geen cat.
   methylstearaat	112-61-8	1	Vaste stof	Geen cat.
   heptylbutyraat	5870-93-9	1,7	Vloeistof	Geen cat. (optionele cat. 3) (3)
   hexylsalicylaat	6259-76-3	2	Vloeistof	Geen cat. (optionele cat. 3) (3)
   INGEDEELDE STOFFEN (VN-GHS-categorie 2)
   cyclamenaldehyde	103-95-7	2,3	Vloeistof	Cat. 2
   1-broomhexaan	111-25-1	2,7	Vloeistof	Cat. 2
   kaliumhydroxide (5 % water)	1310-58-3	3	Vloeistof	Cat. 2
   1-methyl-3-fenyl-1-piperazine	5271-27-2	3,3	Vaste stof	Cat. 2
   heptanal	111-71-7	3,4	Vloeistof	Cat. 2

   PROCEDURE

   Het onderstaande is een beschrijving van de componenten en procedures van een RhE-testmethode voor beoordeling van huidirritatie (zie ook aanhangsel 3 voor parameters voor elk testmodel). Voor de vier modellen die aan deze testmethode voldoen, zijn standaardwerkwijzen (Standard Operating Procedures, SOP’s) beschikbaar (32) (33) (34) (35).

   COMPONENTEN VAN DE RHE-TESTMETHODE

   Algemene voorwaarden

   Om het epitheel op te bouwen moeten niet-getransformeerde humane keratinocyten worden gebruikt. Er moeten verschillende lagen levende epitheelcellen (stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum) aanwezig zijn onder een functioneel stratum corneum. Het stratum corneum moet uit meerdere lagen bestaan en het vereiste lipideprofiel hebben, zodat een sterke en functionele barrière wordt gevormd waar cytotoxische ijkstoffen, bv. natriumdodecylsulfaat (SDS) of Triton X-100, niet snel doorheen kunnen dringen. De barrièrefunctie moet worden aangetoond en kan worden beoordeeld door de concentratie te bepalen waarin een ijkstof de weefsellevensvatbaarheid het weefsel met 50 % doet dalen (IC50) na een vaste blootstellingstijd, of door de blootstellingstijd te bepalen die nodig is om de cellevensvatbaarheid met 50 % te doen dalen (ET50) bij aanbrenging van de ijkstof in een bepaalde, vaste concentratie. De omsluitingseigenschappen van het model moeten voorkomen dat materiaal om het stratum corneum heen het levende weefsel kan bereiken. Dat zou een slecht model voor huidblootstelling opleveren. Het RhE-model mag niet verontreinigd zijn met bacteriën, virussen, mycoplasma of fungi.

   Functionele voorwaarden

   Levensvatbaarheid

   De levensvatbaarheid wordt gekwantificeerd door middel van de MTT-test (31). De levensvatbare cellen van het RhE-weefselpreparaat kunnen de vitale kleurstof MTT reduceren tot een blauw MTT-formazanprecipitaat, dat vervolgens met isopropanol (of een vergelijkbaar oplosmiddel) uit het weefsel wordt geëxtraheerd. De optische densiteit (OD) van het extractieoplosmiddel alleen moet voldoende klein zijn, d.w.z. OD < 0,1. Het geëxtraheerde MTT-formazan kan worden gekwantificeerd met behulp van hetzij een meting van de standaard extinctie (OD) of een HPLC/UPLC-spectrofotometrieprocedure (36). Gebruikers van het RhE-model moeten waarborgen dat iedere gebruikte batch van het RhE-model voldoet aan gedefinieerde criteria voor de negatieve controle. Door de ontwikkelaar/leverancier van het RhE-model wordt een aanvaardbaarheidsbereik (boven- en ondergrens) voor de OD-waarden in negatieve controle (onder de omstandigheden van de testmethode voor huidirritatie) vastgesteld. In tabel 2 worden de aanvaardbaarheidsbereiken gegeven voor de vier gevalideerde RhE-modellen die in deze testmethode zijn opgenomen. Bij gebruik van HPLC/UPLC-spectrofotometrie moeten de OD-bereiken in negatieve controle in tabel 2 als aanvaardbaarheidscriterium voor de negatieve controles worden gebruikt. Gedocumenteerd moet worden dat de weefsels die in de negatieve controle worden gebruikt, gedurende de volledige blootstellingsperiode van de test in cultuur stabiel zijn (een vergelijkbare gemeten levensvatbaarheid opleveren).

   Tabel 2

   Aanvaardbaarheidsbereiken voor de OD-waarden in negatieve controle van de in deze TM opgenomen testmodellen

   	Ondergrens aanvaardbaarheid	Bovengrens aanvaardbaarheid
   EpiSkin™ (SM)	≥ 0,6	≤ 1,5
   EpiDerm™ SIT (EPI-200)	≥ 0,8	≤ 2,8
   SkinEthic™ RHE	≥ 0,8	≤ 3,0
   LabCyte EPI-MODEL24 SIT	≥ 0,7	≤ 2,5

   Barrièrefunctie

   Het stratum corneum met de daarin aanwezige lipiden moet sterk genoeg zijn om snelle penetratie van cytotoxische ijkstoffen, bv. SDS of Triton X-100, te weerstaan, wat wordt beoordeeld aan de hand van de IC50 of ET50 (tabel 3).

   Morfologie

   Histologisch onderzoek van het RhE-model moet worden overgelegd om aan te tonen dat de structuur van het weefsel op die van de menselijke epidermis lijkt (onder meer een meerlagig stratum corneum).

   Reproduceerbaarheid

   De resultaten van de positieve en negatieve controles van de testmethode moeten reproduceerbaar zijn in de tijd.

   Kwaliteitscontrole (QC)

   Het RhE-model mag alleen worden gebruikt als de ontwikkelaar/leverancier aantoont dat iedere batch van het gebruikte RhE-model voldoet aan gedefinieerde productievrijgavecriteria, waarvan die voor levensvatbaarheid (punt 19), barrièrefunctie (punt 20) en morfologie (punt 21) de meest relevante zijn. Deze gegevens moeten aan de gebruikers van de testmethode worden verstrekt, zodat zij deze informatie in het testverslag kunnen opnemen. Door de ontwikkelaar/leverancier van het RhE-model moet een aanvaardbaarheidsbereik (boven- en ondergrens) worden vastgesteld voor de IC50 of de ET50. Een betrouwbare voorspelling van irritatie-effecten kan uitsluitend worden gedaan op grond van resultaten verkregen met deugdelijk weefsel. In tabel 3 worden de aanvaardbaarheidsbereiken gegeven voor de vier testmodellen die in deze testmethode zijn opgenomen.

   Tabel 3

   QC-criteria voor batchvrijgave van de in deze TM opgenomen testmodellen

   	Ondergrens aanvaardbaarheid	Bovengrens aanvaardbaarheid
   EpiSkin™ (SM) (SDS-behandeling van 18 uur) (32)	IC50 = 1,0 mg/ml	IC50 = 3,0 mg/ml
   EpiDerm™ SIT (EPI-200) (1 % Triton X-100) (33)	ET50 = 4,0 uur	ET50 = 8,7 uur
   SkinEthic™ RHE (1 % Triton X-100) (34)	ET50 = 4,0 uur	ET50 = 10,0 uur
   LabCyte EPI-MODEL24 SIT (SDS-behandeling van 18 uur) (35)	IC50 = 1,4 mg/ml	IC50 = 4,0 mg/ml

   Het aanbrengen van de teststof en de controlestoffen

   Er moeten ten minste drie weefselmonsters worden gebruikt voor iedere teststof en voor de controles in ieder experiment. Voor zowel vloeibare als vaste chemische stoffen geldt dat er zo veel teststof moet worden aangebracht dat het epidermisoppervlak gelijkmatig bedekt is, d.w.z. tussen de 26 en 83 μl/cm² of mg/cm², maar er mag geen oneindige dosis worden gebruikt (zie aanhangsel 3). In het geval van vaste chemische stoffen moet het epidermisoppervlak voor aanbrenging worden bevochtigd met gedeïoniseerd of gedestilleerd water, om voor een goed contact van de teststof met het epidermisoppervlak te zorgen. Indien mogelijk moeten vaste stoffen in de vorm van een fijn poeder worden getest. In sommige gevallen kan een nylongaas worden gebruikt als hulpmiddel voor het uitspreiden van de teststof (zie aanhangsel 3).Aan het eind van de blootstellingsperiode moet de teststof zorgvuldig met waterige buffer of 0,9 % NaCl van het epidermisoppervlak worden gewassen. Afhankelijk van de gebruikte RhE-testmodellen loopt de blootstellingsperiode uiteen van 15 tot 60 minuten, en de incubatietemperatuur van 20 tot 37 °C. Deze blootstellingsperioden en temperaturen zijn voor elke afzonderlijke RhE-testmethode geoptimaliseerd en vertegenwoordigen de verschillende intrinsieke eigenschappen van de testmodellen (bv. barrièrefunctie) (zie aanhangsel 3).

   In elk experiment moeten gelijktijdig uitgevoerde negatieve controles (NC) en positieve controles (PC) worden gebruikt om aan te tonen dat de levensvatbaarheid (aan de hand van de NC), de barrièrefunctie en de resulterende gevoeligheid (aan de hand van de positieve controles) van de weefsels binnen een gedefinieerd historisch aanvaardbaarheidsbereik liggen. Als PC-stof wordt een waterige SDS-oplossing van 5 % aanbevolen. Als negatieve controlestoffen zijn water of met fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing (PBS) geschikt.

   Metingen van de cellevensvatbaarheid

   Volgens de testprocedure is het essentieel dat de levensvatbaarheid niet onmiddellijk na de blootstelling aan de teststof wordt gemeten, maar pas nadat het behandelde en gewassen weefsel voldoende lang is geïncubeerd in vers medium. Gedurende deze periode kan het weefsel herstellen van zwak irriterende effecten en vertonen zich duidelijke cytotoxische effecten. Bij de optimalisering van twee van de op RhE gebaseerde testmodellen die aan deze testmethode ten grondslag liggen (11) (12) (13) (14) (15), is gebleken dat een na-incubatie van 42 uur optimaal is.

   De MTT-omzettingstest is een gestandaardiseerde kwantitatieve methode, en de aangewezen methode voor het meten van de cellevensvatbaarheid binnen deze testmethode. De test werkt goed met geconstrueerd driedimensionaal weefsel. Het huidmonster wordt 3 uur in een MTT-oplossing met een geschikte concentratie (bv. 0,3 - 1 mg/ml) gelegd. De levensvatbare cellen zetten het MTT om in blauw formazan. Het neergeslagen blauwe formazanproduct wordt vervolgens met een oplosmiddel (bv. isopropanol, aangezuurde isopropanol) uit het weefsel geëxtraheerd, en de formazanconcentratie wordt bepaald door de OD te meten bij 570 nm, bij een bandbreedte van maximaal ± 30 nm, of door middel van een HPLC/UPLC-spectrofotometrieprocedure (zie punt 34) (36).

   De optische eigenschappen van de teststof of chemische effecten van de teststof op het MTT (teststoffen kunnen de kleurproductie bijvoorbeeld voorkomen of omkeren, of juist veroorzaken) kunnen de test storen en tot een foutieve bepaling van de levensvatbaarheid leiden. Dit kan gebeuren als een bepaalde teststof niet volledig van de huid wordt verwijderd door wassen, of als de stof in de epidermis penetreert. Als de teststof rechtstreekse effecten op het MTT heeft (bv. MTT-reductie), zelf gekleurd is, of tijdens de weefselbehandeling gekleurd raakt, moeten er aanvullende controles worden uitgevoerd om storing van de levensvatbaarheidsmeting door de teststof te detecteren en daarvoor te corrigeren (zie de punten 29 en 33). Een gedetailleerde beschrijving van hoe voor rechtstreekse MTT-reductie en interferentie door kleurstoffen kan worden gecorrigeerd, is te vinden in de SOP’s voor de vier gevalideerde modellen die in deze testmethode zijn opgenomen (32) (33) (34) (35).

   Om rechtstreeks MTT reducerende stoffen te herkennen moet elke teststof worden toegevoegd aan vers bereide MTT-oplossing. Als het MTT-mengsel met de teststof blauw/paars wordt, wordt de teststof als een rechtstreeks MTT reducerende stof beschouwd en moet een verdere functionele toetsing van niet-levensvatbare RhE-weefsels worden uitgevoerd, ongeacht of de meting van de standaard extinctie (OD) of een HPLC/UPLC-spectrofotometrieprocedure wordt gebruikt. Bij deze aanvullende functionele toetsing worden gedode weefsels gebruikt die slechts een residuele metabole activiteit vertonen, maar de teststof wel absorberen op vergelijkbare wijze als levensvatbare weefsels. Om een niet-specifieke MTT-reductie (NSMTT) te genereren wordt elke MTT reducerende teststof op ten minste twee gedode duploweefsels aangebracht, die de gehele testprocedure ondergaan (32) (33) (34) (35). Per teststof is één NSMTT-controle voldoende, ongeacht het aantal onafhankelijk uitgevoerde tests/testruns. De werkelijke levensvatbaarheid van het weefsel wordt dan berekend als de procentuele levensvatbaarheid van het weefsel verkregen met levende weefsels die zijn blootgesteld aan de MTT reducerende stof, minus het percentage niet-specifieke MTT-reductie verkregen met de gedode weefsels die aan de zelfde MTT reducerende stof zijn blootgesteld, ten opzichte van de negatieve controle die gelijktijdig met de te corrigeren test is uitgevoerd (%NSMTT).

   Om na te gaan of gekleurde teststoffen of teststoffen die gekleurd worden wanneer ze in contact komen met water of isopropanol, de test zouden kunnen verstoren en te beslissen of er aanvullende controles nodig zijn, moet een spectrumanalyse van de teststof in water (milieu tijdens blootstelling) en/of isopropanol (extractieoplossing) worden uitgevoerd. Als de teststof in water en/of isopropanol licht absorbeert in het bereik van 570 ± 30 nm, moeten er extra kleurstofcontroles worden uitgevoerd of moet als alternatief een HPLC/UPLC-spectrofotometrieprocedure worden gebruikt, in welk geval deze controles niet nodig zijn (zie de punten 33 en 34). Bij het uitvoeren van de meting van de standaard extinctie (OD) wordt elke verstorende gekleurde teststof op ten minste twee levensvatbare duploweefsels aangebracht, die de hele testprocedure doorlopen maar tijdens de MTT-incubatiestap geïncubeerd worden met medium in plaats van MTT-oplossing om zo tot een niet-specifieke kleurcontrole (NSClevend-controle) te komen. Vanwege de inherente biologische variabiliteit van levende weefsels moet de NSClevend-controle gelijktijdig worden uitgevoerd met het testen van de gekleurde teststof. In geval van meerdere testen moet er voor elke test die wordt uitgevoerd (in elke testrun), een onafhankelijke NSClevend-controle worden verricht. De werkelijke levensvatbaarheid van het weefsel wordt dan berekend als de procentuele levensvatbaarheid verkregen met levende weefsels die zijn blootgesteld aan de verstorende teststof en geïncubeerd met MTT-oplossing, minus het percentage niet-specifieke kleur verkregen met levende weefsels die zijn blootgesteld aan de verstorende teststof en geïncubeerd in medium zonder MTT, gelijktijdig uitgevoerd met de te corrigeren test (%NSClevend).

   Voor teststoffen waarvan wordt vastgesteld dat ze zowel rechtstreekse reductie van MTT (zie punt 29) als kleurinterferentie veroorzaken (zie punt 30), is naast de hierboven beschreven NSMTT- en NSClevend-controles nog een derde reeks controles nodig, wanneer de meting van de standaard extinctie (OD) wordt uitgevoerd. Dit geldt doorgaans voor donkergekleurde (bv. blauwe, paarse of zwarte) teststoffen die de MTT-test verstoren, omdat hun intrinsieke kleur de beoordeling van hun vermogen om rechtstreeks MTT te reduceren zoals beschreven in punt 29 belemmert. Deze teststoffen binden mogelijk zowel aan levende als gedode weefsels en daarom corrigeert de NSMTT-controle mogelijk niet alleen voor potentiële rechtstreekse MTT-reductie door de teststof, maar ook voor kleurinterferentie die voortkomt uit de binding van de teststof aan de gedode weefsels. Dit zou kunnen leiden tot een dubbele correctie voor kleurinterferentie, aangezien de NSClevend-controle al voor kleurinterferentie als gevolg van de binding van de teststof aan levende weefsels corrigeert. Om een mogelijke dubbele correctie voor kleurinterferentie te vermijden moet een derde controle voor niet-specifieke kleur in gedode weefsels (NSCgedood) worden uitgevoerd. In deze extra controle wordt de teststof aangebracht op ten minste twee duplo’s van gedood weefsel, die de gehele testprocedure doorlopen maar in de MTT-incubatiestap geïncubeerd worden met medium in plaats van met MTT-oplossing. Per teststof is één NSCgedood-controle voldoende, ongeacht het aantal onafhankelijke tests/testruns dat wordt uitgevoerd, maar deze moet gelijktijdig worden uitgevoerd met de NSMTT-controle en, waar mogelijk, met dezelfde weefselbatch. De werkelijke levensvatbaarheid van het weefsel wordt dan berekend als de procentuele levensvatbaarheid verkregen met levende weefsels die zijn blootgesteld aan de teststof minus %NSMTT minus %NSClevend plus het percentage niet-specifieke kleur verkregen met gedode weefsels die zijn blootgesteld aan de verstorende teststof en geïncubeerd met medium zonder MTT, ten opzichte van de negatieve controle die gelijktijdig met de te corrigeren test is uitgevoerd (%NSCgedood).

   Het is van belang op te merken dat niet-specifieke MTT-reductie en niet-specifieke kleurinterferenties ertoe kunnen leiden dat de meetwaarden voor het weefselextract buiten het lineariteitsbereik van de spectrofotometer vallen. Daarom moet elk laboratorium, alvorens te beginnen met het testen van teststoffen met het oog op regelgeving, eerst het lineariteitsbereik van de spectrofotometer bepalen met in de handel verkregen MTT-formazan (CAS-nr. 57360-69-7). Meting van de standaard extinctie (OD) met een spectrofotometer is een geschikte methode voor de beoordeling van rechtstreeks MTT reducerende stoffen en teststoffen die kleurinterferentie vertonen, als de OD’s van de weefselextracten die worden verkregen met de teststof zonder correctie voor rechtstreekse MTT-reductie en/of kleurinterferentie, binnen het lineariteitsbereik van de spectrofotometer vallen of als de ongecorrigeerde procentuele levensvatbaarheid die met de teststof wordt verkregen, al ≤ 50 % is. Niettemin moeten de resultaten voor teststoffen die een %NSMTT en/of een %NSClevend van ≥ 50 % van de negatieve controle opleveren, met omzichtigheid worden benaderd, aangezien dit de drempelwaarde is die als scheiding tussen ingedeelde en niet-ingedeelde stoffen fungeert (zie punt 36).

   Voor gekleurde teststoffen die vanwege een te sterke interferentie met de MTT-test niet compatibel zijn met de meting van de standaard extinctie (OD), kan wellicht de alternatieve HPLC/UPLC-spectrofotometrieprocedure voor het meten van MTT-formazan worden toegepast (zie punt 34) (36). In het HPLC/UPLC-spectrofotometriesysteem kan het MTT-formazan voordat het gekwantificeerd wordt, van de teststof worden gescheiden (36). Daarom zijn er bij gebruik van HPLC/UPLC-spectrofotometrie geen NSClevend- of NSCgedood-controles nodig, ongeacht de geteste chemische stof. Als echter vermoed wordt dat de teststof rechtstreeks MTT reduceert of een kleur heeft die de beoordeling van het vermogen om rechtstreeks MTT te reduceren (zoals beschreven in punt 29) belemmert, moeten er wel NSMTT-controles worden toegepast. Bij gebruik van HPLC/UPLC-spectrofotometrie voor het meten van MTT-formazan wordt de procentuele levensvatbaarheid van het weefsel berekend als percentage van de piekoppervlakte voor MTT-formazan verkregen met levende weefsels die aan de teststof zijn blootgesteld, ten opzichte van de piekoppervlakte voor MTT-formazan verkregen met de gelijktijdige negatieve controle. Voor teststoffen die rechtstreeks MTT kunnen reduceren, wordt de levensvatbaarheid van het weefsel berekend als de procentuele levensvatbaarheid van het weefsel verkregen met levende weefsels die aan de teststof zijn blootgesteld, minus %NSMTT. Tot slot zij erop gewezen dat rechtstreeks MTT reducerende stoffen die mogelijk ook kleurinterferentie vertonen, als ze na de behandeling in de weefsels achterblijven en MTT zo sterk reduceren dat dit OD’s (met standaard OD-meting) of piekoppervlakten (met HPLC/UPLC-spectrofotometrie) oplevert voor de geteste weefselextracten die buiten het lineariteitsbereik van de spectrofotometer vallen, niet beoordeeld kunnen worden, hoewel dergelijke gevallen naar verwachting slechts zeer zelden voorkomen.

   HPLC/UPLC-spectrofotometrie kan voor alle typen teststoffen (al dan niet gekleurd, al dan niet MTT reducerend) worden gebruikt voor het meten van MTT-formazan (36). Vanwege de diversiteit van HPLC/UPLC-spectrofotometriesystemen moet de deugdelijkheid van het HPLC/UPLC-spectrofotometriesysteem worden aangetoond alvorens het wordt gebruikt voor het kwantificeren van MTT-formazan in weefselextracten, door aan de aanvaardbaarheidscriteria te voldoen voor een reeks standaard deugdelijkheidsparameters op basis van de parameters beschreven in de voor de industrie bestemde leidraad van de Amerikaanse Food and Drug Administration voor de validering van bioanalytische methoden (36) (37). Deze kritische parameters en de bijbehorende aanvaardbaarheidscriteria worden weergegeven in aanhangsel 4. Als aan de in aanhangsel 4 gestelde aanvaardbaarheidscriteria is voldaan, wordt het HPLC/UPLC-spectrofotometriesysteem als deugdelijk beschouwd en kan het worden gebruikt voor het meten van MTT-formazan onder de experimentele omstandigheden die worden beschreven in deze testmethode.

   Aanvaardbaarheidscriteria

   Bij elke testmethode met deugdelijke weefselbatches (zie punt 23) geeft de OD die men meet voor met de negatieve controle behandelde weefsels, per definitie de kwaliteit weer van de weefsels die het hele proces van verzending en ontvangst, evenals alle stappen uit het irritatietestprotocol hebben doorgemaakt. De OD-waarden van controles mogen niet onder historisch vastgestelde ondergrenzen komen. Evenzo moet het vermogen van de weefsels om op een irriterende stof te reageren onder de specifieke omstandigheden van de testmethode (zie aanhangsel 3 en voor nadere informatie de SOP’s van de vier testmodellen die in deze TG zijn opgenomen (32) (33) (34) (35)) tot uitdrukking komen in metingen met weefsels die met PC, d.w.z. 5 % waterige SDS-oplossing, zijn behandeld. De bijbehorende en geschikte grenzen voor de toegestane variabiliteit tussen duploweefsels, d.w.z. standaarddeviaties (SD’s), moeten binnen de aanvaardbaarheidsgrenzen vallen die voor het gebruikte testmodel zijn vastgesteld (zie aanhangsel 3).

   Interpretatie van resultaten en voorspellingsmodel

   De met elke teststof verkregen OD-waarden kunnen worden gebruikt voor de berekening van een levensvatbaarheid die genormaliseerd is ten opzichte van de negatieve controle, die op 100 % wordt gesteld. Wanneer HPLC/UPLC-spectrofotometrie wordt gebruikt, wordt de procentuele levensvatbaarheid van het weefsel berekend als percentage van de piekoppervlakte voor MTT-formazan verkregen met levende weefsels die aan de teststof zijn blootgesteld, ten opzichte van de piekoppervlakte voor MTT-formazan verkregen met de gelijktijdige negatieve controle. De drempelwaarde van de procentuele cellevensvatbaarheid die als scheiding tussen irriterende en niet-geclassificeerde teststoffen fungeert, en de statistische procedure(s) die wordt/worden gebruikt om de resultaten te evalueren en irriterende stoffen te identificeren, moeten duidelijk worden gespecificeerd en gedocumenteerd, en de juistheid daarvan moet worden aangetoond (zie SOP’s van de testmodellen voor informatie). De drempelwaarden voor de voorspelling van irritatie zijn hieronder gegeven:

   • De teststof wordt geïdentificeerd als stof die moet worden ingedeeld en geëtiketteerd overeenkomstig VN-GHS-/CLP (categorie 2 of categorie 1), indien de gemiddelde procentuele levensvatbaarheid van het weefsel na blootstelling en na-incubatie minder is dan of gelijk is aan (≤) 50 %. Aangezien de RhE-testmodellen die onder deze testmethode vallen, geen onderscheid kunnen maken tussen de VN-GHS/CLP-categorieën 1 en 2, zijn er voor de uiteindelijke indeling van de teststof aanvullende gegevens over huidcorrosie nodig (zie ook de IATA-leidraad van de OESO (3)). Indien wordt vastgesteld dat de teststof niet-corrosief is (op basis van TM B.40, B.40 bis of B.65) en de levensvatbaarheid van het weefsel na blootstelling aan de teststof en na-incubatie minder is dan of gelijk is aan (≤) 50 %, wordt de teststof beschouwd als irriterend voor de huid overeenkomstig VN-GHS/CLP-categorie 2.

   • Afhankelijk van het regelgevend kader in de OESO-landen mag de teststof als niet irriterend voor de huid worden beschouwd overeenkomstig de VN-GHS-/CLP-categorie „Geen categorie”, indien de levensvatbaarheid van het weefsel na blootstelling en na-incubatie meer is dan (gt;) 50 %.

   GEGEVENS EN RAPPORTAGE

   Gegevens

   Voor elk experiment moeten gegevens van individuele weefselmonsters (bv. de OD-waarden en de berekende procentuele cellevensvatbaarheid voor elke teststof, met inbegrip van de indeling) in tabelvorm worden gerapporteerd, met vermelding van gegevens uit herhaalde experimenten, indien van toepassing. Daarnaast moeten voor elk experiment gemiddelden ± standaarddeviatie worden vermeld. Waargenomen interacties met het MTT-reagens en gekleurde teststoffen moeten voor alle geteste stoffen worden gemeld.

   Testverslag

   In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

   • Teststof en controlestoffen:

     • stof die uit één component bestaat: chemische identificatiegegevens, zoals IUPAC- of CAS-naam, CAS-nummer, SMILES- of InChI-code, structuurformule, zuiverheid, chemische identiteit van onzuiverheden, indien van toepassing en praktisch haalbaar enz.;

     • stof die uit meerdere componenten bestaat, UVCB en mengsel: voor zover mogelijk, karakterisering aan de hand van chemische identiteit (zie hierboven), kwantitatief voorkomen en relevante fysisch-chemische eigenschappen van de bestanddelen;

     • fysisch voorkomen, oplosbaarheid in water en aanvullende fysisch-chemische eigenschappen, indien relevant;

     • bron, partijnummer indien beschikbaar;

     • behandeling van de teststof/controlestoffen voorafgaand aan het testen, indien van toepassing (bv. opwarming, malen);

     • stabiliteit van de teststof, uiterste gebruiksdatum, of datum voor heranalyse, indien bekend;

     • bewaaromstandigheden.

     Het gebruikte RhE-model en -protocol (en motivering voor de keuze, indien van toepassing)

   • Testomstandigheden:

     • het gebruikte RhE-model (inclusief batchnummer);

     • kalibratie-informatie voor de meetapparatuur die voor het kwantificeren van MTT-formazan is gebruikt (bv. een spectrofotometer), golflengte en bandbreedte (indien van toepassing), en lineariteitsbereik van de meetapparatuur; een beschrijving van de methode die voor het kwantificeren van MTT-formazan is gebruikt;

     • een beschrijving van de kwalificatie van het HPLC/UPLC-spectrofotometriesysteem, indien van toepassing; volledige ondersteunende informatie over het specifieke gebruikte huidmodel, met inbegrip van de deugdelijkheid daarvan. Hieronder moet ten minste informatie zijn over:

       1. levensvatbaarheid;

       2. barrièrefunctie;

       3. morfologie;

       4. reproduceerbaarheid en voorspelbaarheid;

       5. kwaliteitscontroles (QC) van het model;

     • verwijzingen naar historische gegevens over het model. Hieronder valt ten minste de aanvaardbaarheid van de QC-gegevens met verwijzing naar historische batchgegevens.

     • aantoning van bekwaamheid in de toepassing van de testmethode voorafgaand aan routinematig gebruik door middel van het testen van de stoffen voor bekwaamheidstoetsing.

   • Testprocedure:

     • gedetailleerde gegevens over de gebruikte procedure (met inbegrip van de gebruikte procedures voor het wassen na de blootstellingsperiode); de gebruikte dosis van de teststof en de controles;

     • duur en temperatuur van de blootstelling en de na-incubatietijd;

     • indicatie van de controles die zijn gebruikt voor rechtstreeks MTT-reducerende stoffen en/of gekleurde teststoffen, indien van toepassing;

     • het aantal gebruikte duploweefsels per teststof en controles (positieve controle, negatieve controle en NSMTT, NSClevend en NSCgedood, indien van toepassing);

     • een beschrijving van de toegepaste beslissingscriteria/het toegepaste voorspellingsmodel op basis van het gebruikte RhE-model;

     • een beschrijving van eventuele modificaties van de testprocedure (met inbegrip van procedures voor het wassen).

   • Aanvaardbaarheidscriteria voor de test en testruns:

     • gemiddelden van de positieve en negatieve controles en aanvaardbaarheidsbereiken op basis van historische gegevens; aanvaardbare variabiliteit tussen de duploweefsels voor de positieve en negatieve controles;

     • aanvaardbare variabiliteit tussen de duploweefsels voor de teststof.

   • Resultaten:

     • een tabel met gegevens voor de afzonderlijke teststof voor elke testrun en elke duplometing met inbegrip van OD of MTT-formazan-piekoppervlakte, procentuele levensvatbaarheid van de weefsels, gemiddelde procentuele levensvatbaarheid van de weefsels en standaarddeviatie;

     • indien van toepassing: resultaten van de gebruikte controles voor rechtstreeks MTT reducerende stoffen en/of gekleurde teststoffen, met inbegrip van OD of MTT-formazan-piekoppervlakte, %NSMTT, %NSClevend, %NSCgedood, standaarddeviatie en uiteindelijke gecorrigeerde percentage voor de levensvatbaarheid van de weefsels;

     • resultaten verkregen met de teststof(fen) en controles ten opzichte van de vastgestelde aanvaardbaarheidscriteria voor de test en testruns;

     • een beschrijving van andere waargenomen effecten;

     • de afgeleide indeling met vermelding van het gebruikte voorspellingsmodel/de gehanteerde beslissingscriteria.

   • Bespreking van de resultaten

   • Conclusies

   LITERATUUR

   1. Verenigde Naties (VN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, VN New York en Genève, 2013. Beschikbaar op: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.

   2. EURL-CEVMA (2009). Statement on the „Performance Under UN GHS of Three In Vitro Assays for Skin Irritation Testing and the Adaptation of the Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM Skin Irritation Performance Standards”, gepubliceerd door het raadgevend wetenschappelijk comité van het CEVMA (ESAC31), 9 april 2009. Beschikbaar op: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/about-ecvam/archive-publications/publication//ESAC31_skin-irritation-statement_20090922.pdf

   3. OESO (2014). Guidance Document on an Integrated Approach on Testing and Assessment (IATA) for Skin Corrosion and Irritation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 203), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   4. Hoofdstuk B.4 van deze bijlage, Acute huidirritatie/corrosie.

   5. Hoofdstuk B.40 van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie: transcutane elektrische weerstand (TEW).

   6. Hoofdstuk B.40 bis van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie: testmethode met gereconstrueerde humane epidermis (RhE).

   7. Hoofdstuk B.65 van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie: testmethode op basis van de membraanbarrière.

   8. OESO (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Reconstructed Human Epidermis (RhE) Test Methods for Skin Irritation in Relation to TG 439. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 220). Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   9. OESO (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   10. Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001). A Prevalidation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation, Results and Evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57-93.

   11. Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002). Refinement of the EPISKIN Protocol for the Assessment of Acute Skin Irritation of Chemicals: Follow-Up to the ECVAM Prevalidation Study, Toxicol. in Vitro 16, 765–770.

   12. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. and Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests, ALTEX 21, 107–114.

   13. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests – An Assessment of the Performance of the Optimised Test, ATLA 33, 351-367.

   14. Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. (2005). The In Vitro Acute Skin Irritation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model Within the Framework of the ECVAM Validation Process, ATLA 33, 329-349.

   15. Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002). Follow-Up to the ECVAM Prevalidation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation, The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irritation Task Force report 2, ATLA 30, 109-129.

   16. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test, ATLA 35, 559-601.

   17. Hoffmann S. (2006). ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α.

   18. Eskes C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals, ATLA 35, 603-619.

   19. Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007). In Vitro Acute Skin Irritancy of Chemicals Using the Validated EPISKIN Model in a Tiered Strategy - Results and Performances with 184 Cosmetic Ingredients, ALTEX, 14, 351-358.

   20. EURL-CEVMA (2007). Statement on the Validity of In Vitro Tests for Skin Irritation, gepubliceerd door het raadgevend wetenschappelijk comité van het Europees Centrum voor de validatie van alternatieve methoden (CEVMA) (ESAC26), 27 april 2007. Beschikbaar op: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/about-ecvam/archive-publications/publication//ESAC26_statement_SkinIrritation_20070525_C.pdf

   21. EURL-CEVMA (2007). Performance Standards for Applying Human Skin Models to In Vitro Skin Irritation Testing. NB: dit zijn de oorspronkelijke prestatienormen die zijn gebruikt voor de validering van de twee testmethoden. Deze prestatienormen mogen niet meer worden gebruikt omdat er intussen een bijgewerkte versie (8) beschikbaar is.

   22. EURL-CEVMA (2008). Statement on the Scientific Validity of In Vitro Tests for Skin Irritation Testing, gepubliceerd door het raadgevend wetenschappelijk comité van het CEVMA (ESAC29), 5 november 2008. https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/about-ecvam/archive-publications/publication/ESAC_Statement_SkinEthic-EpiDerm-FINAL-0812-01.pdf

   23. OESO (2010). Explanatory Background Document to the OECD Draft Test Guideline on In Vitro Skin Irritation Testing. Environment, Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, (No 137), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, OESO, Parijs.

   24. Katoh, M., Hamajima, F., Ogasawara, T. and Hata K. (2009). Assessment of Human Epidermal Model LabCyte EPI-MODEL for In Vitro Skin Irritation Testing According to European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM)-Validated Protocol, J Toxicol Sci, 34, 327-334

   25. Katoh, M. and Hata K. (2011). Refinement of LabCyte EPI-MODEL24 Skin Irritation Test Method for Adaptation to the Requirements of OECD Test Guideline 439, AATEX, 16, 111-122

   26. OESO (2011). Validation Report for the Skin Irritation Test Method Using LabCyte EPI-MODEL24. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 159), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   27. OESO (2011). Peer Review Report of Validation of the Skin Irritation Test Using LabCyte EPI-MODEL24. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 155), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   28. Kojima, H., Ando, Y., Idehara, K., Katoh, M., Kosaka, T., Miyaoka, E., Shinoda, S., Suzuki, T., Yamaguchi, Y., Yoshimura, I., Yuasa, A., Watanabe, Y. and Omori, T. (2012). Validation Study of the In Vitro Skin Irritation Test with the LabCyte EPI-MODEL24, Altern Lab Anim, 40, 33-50.

   29. Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004). In Vitro Skin Irritation: Fact and Future. State of the Art Review of Mechanisms and Models, Toxicol. In Vitro 18, 231-243.

   30. Eskes, C. et al. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403).

   31. Mosmann, T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays, J. Immunol. Methods 65, 55-63.

   32. EpiSkin™ (February 2009). SOP, Version 1.8ECVAM Skin Irritation Validation Study: Validation of the EpiSkin™ Test Method 15 min - 42 hours for the Prediction of acute Skin Irritation of Chemicals

   33. EpiDerm™ (Revised March 2009). SOP, Version 7.0, Protocol for: In Vitro EpiDerm™ Skin Irritation Test (EPI-200-SIT), for Use with MatTek Corporation’s Reconstructed Human Epidermal Model EpiDerm (EPI-200).

   34. SkinEthic™ RHE (February 2009) SOP, Version 2.0, SkinEthic Skin Irritation Test-42bis Test Method for the Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals: 42 Minutes Application + 42 Hours Post-Incubation.

   35. LabCyte (June 2011). EPI-MODEL24 SIT SOP, Version 8.3, Skin Irritation Test Using the Reconstructed Human Model „LabCyte EPI-MODEL24”

   36. Alépée, N., Barroso, J., De Smedt, A., De Wever, B., Hibatallah, J., Klaric, M., Mewes, K.R., Millet, M., Pfannenbecker, U., Tailhardat, M., Templier, M., and McNamee, P. Use of HPLC/UPLC-Spectrophotometry for Detection of MTT Formazan in In Vitro Reconstructed Human Tissue (RhT)-Based Test Methods Employing the MTT Assay to Expand their Applicability to Strongly Coloured Test Chemicals. Manuscript in voorbereiding.

   37. US FDA (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Mei 2001. Beschikbaar op: [http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm070107.pdf].

   38. Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995). Irritant Contact Dermatitis, in: Practical Contact Dermatitis, pp 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York.

   39. EURL-CEVMA (2009). Performance Standards for In Vitro Skin Irritation Test Methods Based on Reconstructed Human Epidermis (RhE). NB: dit is de huidige versie van de prestatienormen van het CEVMA, bijgewerkt in 2009 met het oog op de tenuitvoerlegging van het VN-GHS. Deze prestatienormen mogen niet meer worden gebruikt omdat er intussen een bijgewerkte versie (8) beschikbaar is met betrekking tot deze TG.

   40. EURL-CEVMA (2009). ESAC Statement on the Performance Standards (PS) for In Vitro Skin Irritation Testing Using Reconstructed Human Epidermis, gepubliceerd door het raadgevend wetenschappelijk comité van het CEVMA (ESAC31), 8 juli 2009.

   41. Europese Commissie (2001). Richtlijn 2001/59/EG van de Commissie van 6 augustus 2001 tot achtentwintigste aanpassing aan de vooruitgang van de techniek van Richtlijn 67/548/EEG van de Raad betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffen, PB L 225, 1-333.

   Aanhangsel 1

   DEFINITIES

   Betrouwbaarheid :
   indicatie van de mate waarin een testmethode, uitgevoerd volgens een vast protocol, op reproduceerbare wijze binnen één laboratorium en tussen laboratoria verspreid over de tijd kan worden uitgevoerd. De betrouwbaarheid wordt beoordeeld door berekening van intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid (9).
   Cellevensvatbaarheid :
   parameter waarmee de totale activiteit van een celpopulatie wordt weergegeven, bijvoorbeeld als het vermogen van cellulaire mitochondriale dehydrogenasen om de vitale kleurstof MTT (3-[4,5-dimethylthiazool-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromide) te reduceren. Deze parameter is, afhankelijk van het gemeten eindpunt en de opzet van de test, gecorreleerd met het totale aantal levende cellen en/of de vitaliteit van de cellen.
   Chemische stof :
   een substantie of mengsel.
   Concordantie :
   dit is een maat voor de prestaties voor testmodellen die een categoriale uitkomst geven en het is één aspect van relevantie. Deze term en de term nauwkeurigheid worden soms door elkaar gebruikt; de term wordt gedefinieerd als het percentage van alle geteste chemische stoffen die correct als positief of negatief worden geclassificeerd. De concordantie is sterk afhankelijk van de prevalentie van positieven in de typen teststoffen die worden onderzocht (9).
   ET50 :
   kan worden geraamd door vaststelling van de blootstellingstijd die nodig is om de cellevensvatbaarheid met 50 % te doen dalen bij aanbrenging van de ijkstof in een bepaalde, vaste concentratie. Zie ook IC50.
   Gevoeligheid :
   het percentage van alle positieve/actieve teststoffen dat door de test correct wordt ingedeeld. Dit is een maat voor de nauwkeurigheid van een testmethode die categoriale resultaten oplevert en is een belangrijke factor voor de beoordeling van de relevantie van een testmethode (9).
   GHS (mondiaal geharmoniseerd classificatie- en etiketteringssysteem voor chemische stoffen van de Verenigde Naties (VN)) :
   een systeem voor de indeling van chemische stoffen (stoffen en mengsels) op basis van gestandaardiseerde soorten en niveaus van gevaren van fysische aard en gevaren voor de gezondheid en het milieu, en dat de desbetreffende voorlichtingselementen bepaalt, zoals pictogrammen, signaalwoorden, gevarenaanduidingen, voorzorgsmaatregelen en veiligheidsinformatiebladen, waarmee informatie over de schadelijke effecten van de stoffen kenbaar wordt gemaakt teneinde mensen (waaronder werkgevers, werknemers, transporteurs, consumenten en spoedhulpverleners) en het milieu te beschermen (1).
   HPLC :
   hogeprestatievloeistofchromatografie.
   IATA :
   Integrated Approach on Testing and Assessment (geïntegreerde test- en beoordelingsbenadering).
   IC50 :
   kan worden geraamd door vaststelling van de concentratie waarin een ijkstof de levensvatbaarheid van de weefsels met 50 % doet dalen (IC50) na een vaste blootstellingstijd. Zie ook ET50.
   In-vivohuidirritatie :
   het ontstaan van reversibele beschadiging van de huid na het aanbrengen van een teststof gedurende maximaal 4 uur. Huidirritatie is een lokaal optredende reactie van het aangedane huidweefsel die zich kort na stimulatie voordoet (38). Huidirritatie wordt veroorzaakt door een lokale ontstekingsreactie van het natuurlijke (niet-specifieke) immuunsysteem van het huidweefsel. Het voornaamste kenmerk is dat het een reversibel proces is waarbij ontstekingsreacties en de meeste klinische symptomen van ontstekinggerelateerde irritatie (erytheem, oedeem, jeuk en pijn) optreden.
   Mengsel :
   een mengsel of oplossing bestaande uit twee of meer stoffen.
   MTT :
   3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide; thiazolylblauw tetrazoliumbromide.
   Nauwkeurigheid :
   de mate van overeenstemming tussen resultaten verkregen met de testmethode en erkende referentiewaarden. Dit is een maat voor de prestaties van de testmethode en één aspect van relevantie. Deze term en de term concordantie, waaronder het percentage correcte uitkomsten van een testmethode wordt verstaan, worden vaak door elkaar gebruikt (9).
   NSCgedood :
   niet-specifieke kleur in gedode weefsels.
   NSClevend :
   niet-specifieke kleur in levende weefsels.
   NSMTT :
   niet-specifieke MTT-reductie.
   Oneindige dosis :
   hoeveelheid op de epidermis aangebrachte teststof die groter is dan de hoeveelheid die nodig is om het epidermisoppervlak volledig en gelijkmatig te bedekken.
   PC :
   positieve controle, een monster met alle bestanddelen van een testsysteem dat met een chemische stof behandeld werd waarvan bekend is dat deze een positieve respons opwekt. Om te verzekeren dat variabiliteit in de positievecontrolerespons doorheen de tijd kan worden beoordeeld, mag de grootte van de positieve respons niet buitensporig zijn.
   Prestatienormen :
   normen, gebaseerd op een gevalideerde testmethode, die de basis vormen voor de beoordeling van de vergelijkbaarheid van een voorgestelde, in mechanistisch en functioneel opzicht gelijksoortige testmethode. Hieronder begrepen zijn: i) essentiële componenten van de testmethode; ii) een minimumlijst van referentiestoffen die zijn gekozen uit de stoffen die zijn gebruikt om de aanvaardbare prestaties van de gevalideerde testmethode aan te tonen, en iii) de vergelijkbare nauwkeurigheids- en betrouwbaarheidsniveaus die door de voorgestelde testmethode moeten worden gehaald wanneer ze worden beoordeeld aan de hand van de minimumlijst van referentiestoffen; deze waarden zijn gebaseerd op de waarden die voor de gevalideerde testmethode zijn verkregen (9).
   Relevantie :
   beschrijving van het verband van de test met het te onderzoeken effect en of de test betekenis heeft en nuttig is voor een bepaald doel. Het is de mate waarin de test het te onderzoeken biologische effect correct meet of voorspelt. Relevantie omvat een beoordeling van de nauwkeurigheid (concordantie) van een testmethode (9).
   Specificiteit :
   het percentage van alle negatieve/inactieve teststoffen dat door de test correct wordt ingedeeld. Dit is een maat voor de nauwkeurigheid van een testmethode die categoriale resultaten oplevert en is een belangrijke factor voor de beoordeling van de relevantie van een testmethode (9).
   Stof :
   een chemisch element en de verbindingen ervan, zoals zij voorkomen in natuurlijke toestand of bij de productie ontstaan, met inbegrip van alle additieven die nodig zijn voor het behoud van de stabiliteit ervan en alle onzuiverheden ten gevolge van het toegepaste procedé, doch met uitzondering van elk oplosmiddel dat kan worden afgescheiden zonder aantasting van de stabiliteit van de stof of wijziging van de samenstelling ervan.
   Stof die uit één component bestaat :
   een stof die wordt gekenmerkt door haar kwantitatieve samenstelling en waarin een hoofdcomponent aanwezig is in een concentratie van ten minste 80 % (w/w).
   Stof die uit meerdere componenten bestaat :
   een stof die wordt gekenmerkt door haar kwantitatieve samenstelling en waarin meer dan één hoofdcomponent aanwezig is in een concentratie van ≥ 10 % (w/w) en < 80 % (w/w). Een stof die uit meerdere componenten bestaat, is het resultaat van een fabricageproces. Het verschil tussen mengsels en stoffen die uit meerdere componenten bestaan, is dat mengsels worden verkregen door twee of meer stoffen zonder chemische reactie met elkaar te vermengen. Een stof die uit meerdere componenten bestaat, is het resultaat van een chemische reactie.
   Testrun :
   een testrun bestaat uit een of meer teststoffen die gelijktijdig worden getest met een negatieve en een positieve controle.
   Teststof :
   iedere stof of ieder mengsel die/dat met deze testmethode wordt getest.
   UPLC :
   ultrahogeprestatievloeistofchromatografie.
   UVCB :
   stoffen met een onbekende of variabele samenstelling, complexe reactieproducten en biologische materialen.
   Vervangende test :
   een test, ontworpen ter vervanging van een voor de identificatie van gevaren en/of risicobeoordeling geaccepteerde en routinematig gebruikte test, waarvan is vastgesteld dat hij, in vergelijking met de geaccepteerde test, de gezondheid van mens of dier of het milieu, naargelang het geval, gelijke of betere bescherming biedt voor alle mogelijke testsituaties en chemische stoffen (9).

   Aanhangsel 2

   TESTMODELLEN DIE IN DEZE TESTMETHODE ZIJN OPGENOMEN

   Nr.	Naam van het testmodel	Type valideringsstudie	Referenties
   1	EpiSkin™	Volledige prospectieve valideringsstudie (2003-2007). De componenten van dit model werden gebruikt voor het vaststellen van de essentiële testmethodecomponenten van de oorspronkelijke en de bijgewerkte prestatienormen van het Europees Centrum voor de validatie van alternatieve methoden (CEVMA) (39) (40) (21)(*) . Bovendien vormden de gegevens van deze methode met betrekking tot het identificeren van niet-ingedeelde vs. ingedeelde stoffen de belangrijkste basis voor het vaststellen van de waarden voor specificiteit en gevoeligheid in de oorspronkelijke prestatienormen(*) .	(2) (10) (11) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (23) (32) (39) (40)
   2	EpiDerm™ SIT (EPI-200)	EpiDerm™ (oorspronkelijk): in eerste instantie werd het testmodel samen met nr. 1 aan een volledige prospectieve validering onderworpen tussen 2003 en 2007. De componenten van dit model werden gebruikt voor het vaststellen van de essentiële testmethodecomponenten van de oorspronkelijke en de bijgewerkte prestatienormen van het CEVMA (39) (40) (21)(*) . EpiDerm™ SIT (EPI-200): in 2008 werd een gewijzigde versie van de oorspronkelijke EpiDerm™ gevalideerd aan de hand van de oorspronkelijke prestatienormen van het CEVMA (21)(*) (2) (21) (22) (23) (33)	(2) ( (10) (12) (13) (15) (16) (17) (18) (20) (21) (23) (33) (39) (40)
   3	SkinEthic™ RHE	Valideringsstudie op basis van de oorspronkelijke prestatienormen van het CEVMA (21) in 2008(*) .	(2) (21) (22) (23) (31)
   4	LabCyte EPI-MODEL24 SIT	Valideringsstudie (2011-2012) op basis van de prestatienormen van OESO TG 439 (8) die gebaseerd zijn op de bijgewerkte prestatienormen van het CEVMA(*) (39) (40).	(24) (25) (26) (27) (28) (35) (39) (40) en prestatienormen voor deze TG (8)(*)

   Aanhangsel 3

   SPECIFIEKE PROTOCOLPARAMETERS VOOR ELK VAN DE TESTMETHODEN DIE IN DEZE TESTMETHODE ZIJN OPGENOMEN

   De protocollen voor de RhE-modellen vertonen grote overeenkomsten en schrijven in het bijzonder allemaal een na-incubatietijd voor van 42 uur (32) (33) (34) (35). De variaties zitten voornamelijk in drie parameters die verband houden met de verschillende barrièrefuncties van de testmodellen, te weten: A) pre-incubatietijd en -volume, B) het aanbrengen van de teststoffen en C) na-incubatievolume.

   	EpiSkinTM (SM)	EpiDermTM SIT (EPI-200)	SkinEthic RHETM	LabCyte EPI-MODEL24 SIT
   A) Pre-incubatie
   Incubatietijd	18 - 24 uur	18 - 24 uur	< 2 uur	15 - 30 uur
   Hoeveelheid medium	2 ml	0,9 ml	0,3 of 1 ml	0,5 ml
   B) Het aanbrengen van de teststof
   Voor vloeistoffen	10 μl (26 μl/cm2)	30 μl (47 μl/cm2)	16 μl (32 μl/cm2)	25 μl (83 μl/cm2)
   Voor vaste stoffen	10 mg (26 mg/cm2) + DW (5 μl)	25 mg (39 mg/cm2) + DPBS (25 μl)	16 mg (32 mg/cm2) + DW (10 μl)	25 mg (83 mg/cm2) + DW (25 μl)
   Gebruik van nylongaas	niet gebruikt	indien nodig	aangebracht	niet gebruikt
   Totale aanbrengingstijd	15 minuten	60 minuten	42 minuten	15 minuten
   Aanbrengingstemperatuur	kamertemp.	a) 25 min bij kamertemp. b) 35 min bij 37 °C	kamertemp.	kamertemp.
   C) Na-incubatievolume
   Hoeveelheid medium	2 ml	0,9 ml x 2	2 ml	1 ml
   D) Maximaal aanvaardbare variabiliteit
   Standaarddeviatie tussen duploweefsels	SD 18	SD 18	SD 18	SD 18

   Aanhangsel 4

   KRITISCHE PARAMETERS EN AANVAARDBAARHEIDSCRITERIA VOOR KWALIFICATIES VAN EEN HPLC/UPLC-SPECTROFOTOMETRIESYSTEEM VOOR METING VAN UIT RHE-WEEFSELS GEËXTRAHEERD MTT-FORMAZAN

   Parameter	Protocol ontleend aan FDA-leidraad (36) (37)	Aanvaardbaarheidscriteria
   Selectiviteit	Analyse van isopropanol, levende blanco (isopropanolextract van onbehandelde levende RhE-weefsels), dode blanco (isopropanolextract van onbehandelde gedode RhE-weefsels)	Oppervlakteinterferentie ≤ 20 % van OppervlakteLLOQ (1)
   Precisie	Kwaliteitscontroles (d.w.z. MTT-formazan bij 1,6 μg/ml, 16 μg/ml en 160 μg/ml ) in isopropanol (n=5)	CV ≤ 15 % of ≤ 20 % voor de LLOQ
   Nauwkeurigheid	Kwaliteitscontroles in isopropanol (n=5)	%Afw. ≤ 15 % of ≤ 20 % voor de LLOQ
   Matrixeffect	Kwaliteitscontroles in levende blanco (n=5)	85 % ≤ percentage matrixeffect ≤ 115 %
   Carry-over	Analyse van isopropanol na een ULOQ(2)-standaard	Oppervlakteinterferentie ≤ 20 % van OppervlakteLLOQ
   Reproduceerbaarheid (binnen één dag)	3 onafhankelijke kalibratiecurven (op basis van 6 achtereenvolgende 1/3 verdunningen van MTT-formazan in isopropanol beginnend bij de ULOQ, d.w.z. 200 μg/ml); Kwaliteitscontroles in isopropanol (n=5)	Kalibratiecurven: %Afw. ≤ 15 % of ≤ 20 % voor de LLOQ Kwaliteitscontroles: %Afw. ≤ 15 % en CV ≤ 15 %
   Reproduceerbaarheid (van dag tot dag)	Dag 1 1 kalibratiecurve en kwaliteitscontroles in isopropanol (n=3) Dag 2 1 kalibratiecurve en kwaliteitscontroles in isopropanol (n=3) Dag 3 1 kalibratiecurve en kwaliteitscontroles in isopropanol (n=3)
   Kortetermijnstabiliteit van MTT-formazan in RhE-weefselextract	Kwaliteitscontroles op levende blanco (n=3) geanalyseerd op de dag van bereiding en na 24 uur bewaring bij kamertemperatuur	%Afw. ≤ 15 %
   Langetermijnstabiliteit van MTT-formazan in RhE-weefselextract, indien nodig	Kwaliteitscontroles op levende blanco (n=3) geanalyseerd op de dag van bereiding en na meerdere dagen bewaring bij een gespecificeerde temperatuur (bv. 4 °C, – 20 °C, – 80 °C)	%Afw. ≤ 15 %

   ”

8. In deel B worden de volgende hoofdstukken toegevoegd:

   REPRODUCTIE-/ONTWIKKELINGSTOXICITEIT, SCREENINGTEST

   INLEIDING

   Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 421 (2016) van de OESO. OESO-richtlijnen voor het testen van chemische stoffen worden periodiek in het licht van de wetenschappelijke vorderingen getoetst. De oorspronkelijke screeningtestrichtlijn 421 werd vastgesteld in 1995 op basis van een protocol voor een voorbereidende screeningtest voor reproductietoxiciteit (Preliminary Reproduction Toxicity Screening Test) die was besproken op twee bijeenkomsten van deskundigen, in 1990 in Londen (1) en in 1992 in Tokio (2).

   Deze testmethode is bijgewerkt met eindpunten die relevant zijn voor hormoonontregelaars, naar aanleiding van de prioritaire actie die de OESO in 1998 is gestart om bestaande testrichtlijnen te herzien en nieuwe testrichtlijnen te ontwikkelen voor het screenen en testen op potentiële hormoonontregelaars (3). Zo werd OESO TG 407 (toxiciteitsonderzoek (oraal) op knaagdieren bij herhaalde toediening (28 dagen), hoofdstuk B.7 van deze bijlage) in 2008 uitgebreid door er geschikte parameters in op te nemen om de endocriene werking van teststoffen vast te kunnen stellen. Met de bijwerking van TG 421 werd beoogd om in screeningtestrichtlijnen een aantal voor hormoonontregelaars relevante eindpunten op te nemen, waarbij de blootstellingsperioden bepaalde gevoelige perioden in de ontwikkeling (prenatale en vroeg-postnatale perioden) beslaan.

   De aanvullende, voor hormoonontregelaars relevante eindpunten die werden geselecteerd en die ook deel uitmaken van TG 443 (uitgebreid onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie, hoofdstuk B.56 van deze bijlage), werden in TG 421 opgenomen op basis van een haalbaarheidsstudie waarin wetenschappelijke en technische vragen met betrekking tot de opname ervan werden onderzocht, alsook aanpassingen van de testopzet die eventueel voor de opname ervan noodzakelijk zouden zijn (4).

   Deze testmethode is ontworpen voor het verkrijgen van beperkte informatie over de effecten van een teststof op het mannelijke en vrouwelijke voortplantingsvermogen, zoals de gonadale functie, paringsgedrag, conceptie, ontwikkeling van de vrucht en geboorte. Deze testmethode is geen alternatief noch een vervanging voor de bestaande testmethoden B.31, B.34, B.35 of B.56.

   INLEIDENDE OVERWEGINGEN

   Deze screeningtestmethode kan worden gebruikt om oriënterende gegevens te verkrijgen over mogelijke effecten op de voortplanting en/of ontwikkeling, hetzij in een vroeg stadium van de beoordeling van de toxicologische eigenschappen van chemische stoffen, hetzij voor chemische stoffen waarbij dergelijke effecten worden vermoed. De methode kan ook worden gebruikt als deel van een reeks initiële screeningtests voor bestaande chemische stoffen waarvoor weinig of geen toxicologische gegevens beschikbaar zijn, als bereikbepalingsonderzoek voor uitvoeriger onderzoeken naar reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit, of wanneer het gebruik ervan anderszins relevant wordt geacht. Bij het uitvoeren van het onderzoek moeten de richtsnoeren en overwegingen worden gevolgd die worden beschreven in de OESO-leidraad nr. 19 over het herkennen, beoordelen en gebruiken van klinische verschijnselen als humane eindpunten voor proefdiergebruik bij veiligheidsbeoordelingen (5).

   Deze testmethode verschaft geen volledige informatie over alle aspecten van reproductie en ontwikkeling. Met name voor het detecteren van postnatale gevolgen van prenatale blootstelling of effecten die tijdens postnatale blootstelling zijn veroorzaakt, is de informatie die deze methode oplevert slechts beperkt. Als gevolg van (onder andere) het betrekkelijk kleine aantal dieren in de dosisgroepen, de selectiviteit van de eindpunten en de korte onderzoeksduur, kan met deze methode geen bewijs worden verkregen om definitief te concluderen dat een stof geen effecten veroorzaakt. Als er verder geen gegevens zijn uit andere tests op reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit, zijn positieve resultaten evenwel nuttig voor een eerste gevarenbeoordeling en kunnen ze als basis dienen voor beslissingen over de noodzaak en timing van aanvullende tests.

   De resultaten die worden verkregen met de parameters die met het endocriene systeem te maken hebben, moeten worden gezien in samenhang met het conceptueel kader van de OESO voor het testen en beoordelen van hormoonontregelende stoffen (6). In dit conceptueel kader is de uitgebreide TG 421 van de OESO ondergebracht in niveau 4 als eenin-vivobepaling waarmee gegevens kunnen worden verkregen over schadelijke effecten op eindpunten die relevant zijn voor het endocrien systeem. Een endocrien signaal hoeft op zichzelf echter niet als voldoende bewijs te worden beschouwd dat de teststof een hormoonontregelaar is.

   Bij deze testmethode wordt aangenomen dat de teststof oraal wordt toegediend. Als andere blootstellingsroutes worden gebruikt, moet de methode mogelijk worden aangepast.

   Voordat de testmethode wordt gebruikt op een mengsel om gegevens te genereren voor een beoogd regelgevingsdoel, moet worden nagegaan of, en zo ja, waarom deze methode betrouwbare resultaten oplevert voor dat doel. Zulke overwegingen zijn niet nodig wanneer het testen van het mengsel wettelijk vereist is.

   De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1.

   PRINCIPE VAN DE TEST

   De teststof wordt in geleidelijk oplopende doseringen aan verschillende groepen mannetjes en vrouwtjes toegediend. De mannetjes moeten ten minste vier weken lang de teststof toegediend krijgen, tot en met de dag voordat ze worden gedood (inclusief twee weken voorafgaand aan het paren, tijdens de paringsperiode en ongeveer twee weken na het paren). Gezien de beperkte doseringsperiode vóór paring, is de vruchtbaarheid mogelijk geen bijzonder gevoelige indicator voor testiculaire toxiciteit. Een uitvoerig histologisch onderzoek van de testes is daarom noodzakelijk. De combinatie van een twee weken durende doseringsperiode voor het paren, gevolgd door waarnemingen op het gebied van paring/vruchtbaarheid, met een totale doseringsperiode van ten minste vier weken gevolgd door een uitvoerige histopathologie van de mannelijke geslachtsklieren, wordt voldoende geacht om het merendeel van de effecten op de mannelijke vruchtbaarheid en de spermatogenese te kunnen detecteren.

   De vrouwtjes moeten het hele onderzoek lang de teststof toegediend krijgen. Dit betekent twee weken voorafgaand aan het paren (zodat het onderzoek ten minste twee volledige oestruscycli omvat), de variabele tijd tot conceptie, de duur van de dracht en ten minste dertien dagen na het werpen, tot en met de dag voordat ze worden gedood.

   De duur van het onderzoek, na acclimatisering en beoordeling van de oestruscyclus voorafgaand aan de behandeling, is afhankelijk van het gedrag van het vrouwtje en beloopt ongeveer 63 dagen (ten minste 14 dagen vóór het paren, (tot) 14 dagen paring, 22 dagen dracht, en ten slotte een zoogperiode van 13 dagen).

   Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks zorgvuldig geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens de testperiode sterven of worden gedood, wordt obductie verricht. Dieren die aan het eind van de test nog in leven zijn, worden gedood en ook hierop wordt obductie verricht.

   BESCHRIJVING VAN DE METHODE

   Keuze van de diersoort

   Deze testmethode is ontworpen om te worden toegepast met ratten. Indien de in deze testmethode gespecificeerde parameters worden onderzocht bij een andere knaagdiersoort moet dit uitvoerig worden gemotiveerd. In het internationale valideringsprogramma voor de detectie van hormoonontregelaars in OESO TG 407 (die overeenkomt met hoofdstuk B.7 van deze bijlage) zijn alleen ratten gebruikt. Stammen met een lage vruchtbaarheid of waarvan bekend is dat er vaak ontwikkelingsstoornissen optreden, mogen niet worden gebruikt. Er moet gebruikgemaakt worden van gezonde dieren die nog niet eerder gepaard hebben en nog niet eerder aan experimenten zijn onderworpen. Van de proefdieren moeten soort, stam, geslacht, gewicht en leeftijd bekend zijn. Per geslacht mag bij aanvang van het onderzoek het gewicht van de dieren die worden gebruikt, niet meer dan 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken. Wanneer het onderzoek wordt uitgevoerd als voorstudie voor een onderzoek van langere duur of een onderzoek over een volledige generatie, verdient het de voorkeur dat de dieren in beide onderzoeken tot dezelfde stam behoren en dezelfde oorsprong hebben.

   Huisvesting en voeding

   Alle procedures moeten in overeenstemming zijn met de plaatselijke normen voor de verzorging van proefdieren. De temperatuur in de proefdierruimte moet 22 °C (± 3 °) zijn. De relatieve luchtvochtigheid moet ten minste 30 % zijn en (behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte) bij voorkeur niet hoger dan 70 % zijn, maar er moet worden gestreefd naar 50-60 %. Verlichting gebeurt met kunstlicht met een fotoperiode van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende mengbaarheid met de teststof te zorgen, wanneer de stof in het voer wordt toegediend.

   De dieren moeten in kleine groepen van hetzelfde geslacht worden gehuisvest; de dieren kunnen individueel worden gehuisvest als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is. Indien de dieren in groepen in kooien worden ondergebracht, mogen per kooi niet meer dan vijf dieren worden gehuisvest. Het paren moet plaatsvinden in kooien die voor dat doel geschikt zijn. Drachtige vrouwtjes moeten in aparte kooien worden ondergebracht en nestmateriaal krijgen. Zogende vrouwtjes moeten samen met hun jongen in aparte kooien worden ondergebracht.

   Het voeder moet regelmatig op verontreinigingen worden onderzocht. Een monster van het voedsel moet worden bewaard totdat het verslag is afgerond.

   Voorbereiding van de dieren

   Gezonde jonge volwassen dieren worden aselect ingedeeld in de controle- en behandelgroepen. De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. De dieren krijgen een unieke identificatie en blijven, voordat de test begint, minimaal vijf dagen in hun kooi om in het laboratorium te acclimatiseren.

   Voorbereiding van de doses

   Aanbevolen wordt om de teststof oraal toe te dienen, tenzij andere toedieningswegen geschikter worden geacht. Wanneer voor de orale weg wordt gekozen, wordt de teststof gewoonlijk via een sonde toegediend; als alternatieve mogelijkheid kunnen teststoffen echter ook via het voer of het drinkwater worden toegediend.

   Waar nodig wordt de teststof in een geschikt vehiculum opgelost of gesuspendeerd. Aanbevolen wordt eerst na te gaan of het mogelijk is een waterige oplossing/suspensie te gebruiken, als dit niet kan een oplossing/emulsie in olie (bv. maïsolie) te overwegen en daarna eventueel andere vehicula. Wanneer een ander vehiculum dan water wordt gebruikt, moeten de toxische kenmerken daarvan bekend zijn. Voorts moeten de stabiliteit en homogeniteit van de teststof in het vehiculum worden bepaald.

   PROCEDURE

   Aantal en geslacht van de dieren

   Aanbevolen wordt dat elke groep aan het begin van de test ten minste 10 mannetjes en 12-13 vrouwtjes telt. Bij de vrouwtjes wordt vóór blootstelling de oestruscyclus beoordeeld. Dieren die geen normale 4-5-daagse cyclus hebben, worden niet het onderzoek opgenomen. Daarom wordt aanbevolen met extra vrouwtjes te beginnen om uiteindelijk op 10 vrouwtjes per groep uit te komen. Behalve in geval van duidelijke toxische effecten wordt verwacht dat dit ten minste 8 drachtige vrouwtjes per groep zal opleveren, hetgeen normaal gesproken het minimaal aanvaardbare aantal drachtige vrouwtjes per groep is. Het doel is voldoende drachten en nakomelingen tot stand te brengen om een betekenisvolle evaluatie mogelijk te maken van de mogelijke invloed van de stof op de vruchtbaarheid, de dracht en het gedrag van moeder en jongen, en op de groei en ontwikkeling van de F1-nakomelingen, vanaf de conceptie tot dag 13 na het werpen.

   Dosering

   In het algemeen zijn drie testgroepen en een controlegroep vereist. De dosisniveaus kunnen worden gebaseerd op informatie uit acute-toxiciteitstests of op de resultaten van onderzoeken bij herhaalde toediening. Afgezien van de toediening van de teststof worden de dieren in de controlegroep op identieke wijze behandeld als de dieren in de testgroepen. Indien bij de toediening van de teststof van een vehiculum gebruik wordt gemaakt, moet dit aan de controlegroep in het hoogste gebruikte volume toegediend worden.

   De dosisniveaus moeten worden gekozen in het licht van de bestaande gegevens over toxiciteit en (toxico)kinetica. Er moet ook rekening mee gehouden worden dat er verschillen kunnen zijn in gevoeligheid tussen drachtige en niet-drachtige dieren. Het hoogste dosisniveau moet zo worden gekozen dat toxische effecten optreden, maar geen sterfte of ernstig lijden. Daarna moet een dalende reeks dosisniveaus worden gekozen teneinde een eventuele doseringsgerelateerde respons en het laagste dosisniveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld (No-Observed Adverse Effect Level, NOAEL) aan te tonen. Intervallen van een factor twee of vier zijn vaak optimaal om de dalende dosisniveaus vast te stellen en het is vaak beter een vierde testgroep toe te voegen dan zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor 10) tussen de doseringen te gebruiken.

   Bij algemene toxiciteit (bv. verminderd lichaamsgewicht, effecten op lever, hart, longen of nieren enz.) of andere veranderingen die mogelijk geen toxische reacties zijn (bv. verminderde voedselinname, leververgroting), moeten de waargenomen effecten op hormoongevoelige eindpunten met de nodige omzichtigheid worden geïnterpreteerd.

   Limiettest

   Als volgens de hier beschreven procedures een onderzoek met orale toediening wordt uitgevoerd met één dosisniveau van ten minste 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag of, in het geval van toediening via het voer of het drinkwater, het equivalente percentage in het voer of het drinkwater, en er geen waarneembare toxische effecten optreden, en deze ook niet kunnen worden verwacht op grond van gegevens betreffende stoffen met verwante structuur, is het niet noodzakelijk een volledige test met meerdere dosisniveaus te doen. De limiettest is bruikbaar, behalve wanneer vanwege de verwachte blootstelling van de mens een hogere orale dosis nodig wordt geacht. Voor andere toedieningsvormen, zoals inhalatie of toediening op de huid, zal de maximaal haalbare concentratie vaak worden bepaald door de fysisch-chemische eigenschappen van de teststoffen.

   Toediening van de doses

   De dieren krijgen de teststof 7 dagen per week dagelijks toegediend. Indien de teststof via een maagsonde aan het dier wordt toegediend, moet dit in één enkele dosis gebeuren met gebruikmaking van een maagbuisje of een geschikte intubatiecanule. Het maximale volume dat in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het dier. Het volume mag niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht, behalve wanneer het om een waterige oplossing gaat: in dat geval mag 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden gebruikt. Afgezien van irriterende of bijtende teststoffen die normaliter bij hogere concentraties ergere effecten vertonen, moet de variabiliteit in het voor de proef gebruikte volume zo klein mogelijk worden gehouden door de concentratie zodanig aan te passen dat bij alle dosisniveaus een constant volume wordt gewaarborgd.

   Het is belangrijk dat er bij een teststof die via het voer of het drinkwater wordt toegediend, voor wordt gezorgd dat de hoeveelheden teststof de normale voer- of waterbalans niet verstoren. Wanneer de teststof in het voer wordt toegediend, kan een constante concentratie in het voer (in ppm) of een constante dosis in verhouding tot het lichaamsgewicht van de dieren worden gebruikt; daarbij moet worden aangegeven welk alternatief is gebruikt. Wanneer de teststof met een sonde wordt toegediend, moeten de doses dagelijks op vaste tijdstippen worden gegeven. De doses moeten ten minste wekelijks worden aangepast om een constant dosisniveau als functie van het lichaamsgewicht van het dier te verkrijgen.

   Proefopzet

   Voor beide geslachten moet de toediening ten minste 2 weken voor het paren beginnen, nadat de dieren ten minste vijf dagen lang zijn geacclimatiseerd en de vrouwtjes gescreend zijn op normale oestruscycli (in een voorbehandelingsperiode van 2 weken). Het onderzoek moet zodanig worden ingepland dat de beoordeling van de oestruscyclus begint kort nadat de dieren volledig geslachtsrijp zijn. Dit kan enigszins variëren voor verschillende rattenstammen in verschillende laboratoria, bv. voor Sprague Dawley-ratten op een leeftijd van 10 weken, voor Wistar-ratten op een leeftijd van ongeveer 12 weken. Moederdieren met jongen moeten op dag 13 na het werpen worden gedood of kort daarna. De dag van de geboorte (d.w.z. wanneer het werpen is voltooid) wordt gedefinieerd als dag 0 na het werpen. Vrouwtjes die geen tekenen van copulatie vertonen, worden 24-26 dagen na de laatste dag van de paringsperiode gedood. Voor beide geslachten wordt de toediening gedurende de paringsperiode voortgezet. Daarna moeten de mannetjes de teststof ten minste nog toegediend krijgen tot de minimale totale doseringsperiode van 28 dagen is afgerond. Vervolgens worden ze gedood of, anders, in leven gehouden en verder behandeld voor een eventuele tweede paring.

   De dagelijkse toediening aan de moederdieren moet doorgaan gedurende de dracht en ten minste tot en met dag 13 na het werpen of de dag voordat ze gedood worden. Voor onderzoeken waarbij de toediening van de teststof door middel van inhalatie of dermaal plaatsvindt, moet deze ten minste worden voortgezet tot en met dag 19 van de dracht en zo spoedig mogelijk en niet later dan postnatale dag (PND) 4 worden hervat.

   In aanhangsel 2 wordt de proefopzet in een diagram weergegeven.

   De paringsprocedure

   Normaal gesproken moet men voor dit onderzoek één mannetje met één vrouwtje (1:1) laten paren. Hierop zijn uitzonderingen mogelijk in geval van incidentele sterfte van mannetjes. Het vrouwtje moet bij hetzelfde mannetje worden geplaatst totdat aanwijzingen voor copulatie zijn waargenomen of er twee weken zijn verstreken. Elke ochtend worden de vrouwtjes onderzocht op de aanwezigheid van sperma of vaginale plug. Dag 0 van de dracht wordt gedefinieerd als de dag waarop aanwijzingen voor paring worden bevestigd (observatie van een vaginale plug en/of sperma). Wanneer het paren geen succes heeft, kan worden overwogen de vrouwtjes opnieuw te laten dekken door mannetjes van dezelfde groep waarvan de vruchtbaarheid is aangetoond.

   Nestgrootte

   Op PND 4 kan de grootte van de nesten worden aangepast door eliminatie van extra jongen door willekeurige selectie, zodat elk nest uiteindelijk zoveel mogelijk bestaat uit vier of vijf jongen per geslacht, afhankelijk van de normale nestgrootte van de gebruikte rattenstam. Bij twee van de overtollige jongen moeten bloedmonsters worden afgenomen, gepoold en gebruikt ter bepaling van de serumspiegels van T4. Selectieve eliminatie van jongen, bijvoorbeeld op grond van lichaamsgewicht of anogenitale afstand (AGD), is niet gepast. Als het door het aantal mannelijke of vrouwelijke jongen niet mogelijk is om op vier of vijf per geslacht per nest uit te komen, is gedeeltelijke aanpassing (bv. zes mannetjes en vier vrouwtjes) aanvaardbaar. Er worden geen jongen geëlimineerd als de nestgrootte daardoor onder de streefgrootte (8 of 10 jongen/nest) zou komen. Als er maar één jong beschikbaar is boven de streefgrootte, wordt er slechts één jong geëlimineerd en gebruikt voor het nemen van een bloedmonster ter bepaling van serum-T4.

   Als de nestgrootte niet wordt aangepast, worden er op PND 4 twee jongen per nest gedood en worden er bloedmonsters genomen voor het meten van de serumspiegels van schildklierhormonen. De twee jongen per nest moeten zo mogelijk vrouwelijke jongen zijn om de mannelijke jongen te bewaren voor de beoordeling van de tepelretentie, tenzij er na verwijdering van deze jongen geen enkel vrouwtje meer overblijft voor de beoordeling aan het einde van het onderzoek. Er worden geen jongen geëlimineerd als de nestgrootte daardoor onder de 8 of 10 jongen/nest (afhankelijk van de normale nestgrootte van de gebruikte rattenstam) zou komen. Als er maar één jong beschikbaar is boven de normale nestgrootte, wordt er slechts één jong geëlimineerd en gebruikt voor het nemen van een bloedmonster ter bepaling van serum-T4.

   Waarnemingen bij levende dieren

   Klinische waarnemingen

   Gedurende de hele testperiode moeten er minstens eenmaal per dag, en vaker als er tekenen van toxiciteit worden waargenomen, algemene klinische waarnemingen worden verricht. Deze moet bij voorkeur elke dag op dezelfde tijd(en) plaatsvinden, rekening houdend met de piekperiode voor de verwachte effecten na de toediening. Met de teststof samenhangende veranderingen in het gedrag, tekenen van een moeilijke of langdurige worp en alle tekenen van toxiciteit, inclusief sterfte, moeten worden vastgelegd, met inbegrip van de aanvang, de ernst en de duur van de toxiciteitsverschijnselen.

   Lichaamsgewicht en consumptie van voer en water

   De mannetjes en vrouwtjes moeten worden gewogen op de eerste dag dat zij de teststof krijgen toegediend, vervolgens ten minste eenmaal per week en aan het einde van het onderzoek. De vrouwtjes moeten worden gewogen op de dagen 0, 7, 14 en 20 tijdens de dracht, binnen 24 uur na de geboorte (dag 0 of 1 na het werpen) en ten minste op de dagen 4 en 13 na het werpen. Deze waarnemingen worden voor elk volwassen dier apart gerapporteerd.

   Vóór het paren, tijdens de dracht en tijdens het zogen, moet ten minste wekelijks de voerconsumptie worden gemeten. Tijdens de paringsperiode is deze meting facultatief. Wanneer de teststof via het drinkwater wordt toegediend, moet ook de waterconsumptie gedurende deze perioden worden gemeten.

   Oestruscycli

   Voordat de behandeling begint, moeten de oestruscycli worden gecontroleerd om te selecteren op vrouwelijke proefdieren met regelmatige cycli (zie punt 22). Ook moeten er van het begin van de behandelingsperiode totdat paring is gebleken, dagelijks vaginale uitstrijkjes worden onderzocht. Indien vermoed wordt dat effecten van acute stress bij het begin van de behandeling de oestruscyclus zouden kunnen verstoren, kunnen de laboratoria de proefdieren gedurende 2 weken blootstellen en vervolgens ten minste 2 weken lang dagelijks vaginale uitstrijkjes nemen ter controle van de oestruscycli gedurende de periode vóór paring tot in de paringsperiode, totdat paring gebleken is. Wanneer monsters van vaginale/cervicale cellen worden genomen, moet erop worden gelet verstoring van het slijmvlies, die tot schijndracht kan leiden, te voorkomen (7) (8).

   Parameters met betrekking tot de nakomelingen

   De drachttijd moet worden geregistreerd en wordt berekend vanaf dag 0 van de dracht. Elke worp moet zo spoedig mogelijk na de geboorte worden onderzocht, teneinde het aantal en geslacht van de jongen vast te stellen, alsmede het aantal doodgeborenen, levendgeborenen, ondermaatse jongen (jongen die aanmerkelijk kleiner zijn dan de corresponderende controlejongen) en de aanwezigheid van macroscopisch zichtbare afwijkingen.

   Levende jongen moeten worden geteld en gesekst en de nesten moeten binnen 24 uur na de geboorte (dag 0 of 1 na het werpen) en ten minste op de dagen 4 en 13 na het werpen worden gewogen. Naast de in punt 35 beschreven waarnemingen moet elk afwijkend gedrag van de nakomelingen worden geregistreerd.

   De AGD van elk jong moet worden gemeten op dezelfde postnatale dag tussen postnatale dag 0 en het einde van postnatale dag 4. Het lichaamsgewicht van elk jong moet worden bepaald op de dag dat de AGD wordt gemeten en de AGD moet genormaliseerd worden tot een maat voor jonggrootte, bij voorkeur de derdemachtswortel van het lichaamsgewicht (9). Het aantal tepels/tepelhoven bij mannelijke jongen moet worden geteld op postnatale dag 12 of 13, zoals aanbevolen in OESO-leidraad 151 (10).

   Klinische biochemie

   Er worden bloedmonsters genomen van een gedefinieerde plaats op basis van het volgende schema:

   • van ten minste twee jongen per nest op PND 4 als het aantal jongen dit toelaat (zie de punten 33-34);

   • van alle moederdieren en ten minste twee jongen per nest op het tijdstip van doden op dag 13, en

   • van alle volwassen mannetjes op het tijdstip van doden.

   Alle bloedmonsters worden onder passende omstandigheden bewaard. In de bloedmonsters van de jongen op dag 13 en de volwassen mannetjes worden de serumspiegels van schildklierhormonen (T4) bepaald. Een verdere bepaling van T4 in bloedmonsters van moederdieren en jongen op dag 4 wordt verricht indien relevant. Eventueel kunnen ook andere hormonen worden gemeten indien relevant. Voor de schildklierhormoonanalyse kan bloed van jongen per nest gepoold worden. De schildklierhormonen (T4 en TSH) worden bij voorkeur als „totaal” gemeten.

   De volgende factoren kunnen van invloed zijn op de variabiliteit en de absolute concentraties van de hormoonbepalingen:

   • tijdstip waarop de dieren worden gedood, vanwege de schommelingen in de hormoonconcentraties gedurende de dag;

   • wijze waarop de dieren worden gedood: onnodige stress bij de dieren, waardoor de hormoonconcentraties kunnen worden beïnvloed, moet worden voorkomen;

   • testkits voor hormoonbepalingen, die verschillende standaardkrommen kunnen hebben.

   Plasmamonsters die specifiek voor hormoonbepaling zijn bedoeld, moeten telkens op hetzelfde moment van de dag worden genomen. De verschillende in de handel verkrijgbare „assay kits” kunnen verschillende numerieke waarden opleveren bij de analyse van hormoonconcentraties.

   Pathologie

   Macroscopische obductie

   Op het tijdstip waarop ze worden gedood of tijdens het onderzoek sterven, worden de dieren macroscopisch onderzocht op afwijkingen of pathologische veranderingen. Bijzondere aandacht moet worden geschonken aan de organen van het voortplantingssysteem. Het aantal implantatieplaatsen moet worden geregistreerd. In de ochtend van de dag van obductie moeten er vaginale uitstrijkjes onderzocht worden om de fase van de oestruscyclus te bepalen en deze in verband te kunnen brengen met de histopathologie van de eierstokken.

   De testes en epididymides, evenals de prostaat en de zaadblaasjes met coagulans afscheidende klieren als geheel van alle volwassen mannetjes moeten zo nodig worden ontdaan van aanhechtend weefsel en zo spoedig mogelijk na de sectie nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. Optionele organen die eventueel ook gewogen kunnen worden, zijn onder meer het m levator ani plus bulbocavernosuscomplex, de Cowperse klieren en de glans penis bij mannetjes en de gepaarde ovaria (nat gewicht) en uterus (inclusief cervix) bij vrouwtjes; indien deze gewichten worden meegenomen, moeten ze zo snel mogelijk na de sectie worden opgenomen.

   Dode jongen en jongen die op dag 13 na het werpen, of kort daarna, zijn gedood, moeten in elk geval uitwendig zorgvuldig worden onderzocht op macroscopisch zichtbare afwijkingen. Daarbij wordt met name gelet op de uitwendige voortplantingsorganen, die op tekenen van een afwijkende ontwikkeling worden onderzocht. Op dag 13 moet van 1 mannelijk en 1 vrouwelijk jong per nest de schildklier worden geconserveerd.

   Van alle volwassen dieren moeten de ovaria, testes, secundaire geslachtsorganen (uterus en cervix, epididymides, prostaat, zaadblaasjes met coagulans uitscheidende klieren), schildklier en alle organen die macroscopische letsels vertonen, worden geconserveerd. Voor routineonderzoek van testes en epididymides wordt fixatie in formaline niet aanbevolen. Voor deze weefsels is het gebruik van Bouin’s fixatief of gemodificeerde Davidson-oplossing een aanvaardbare methode (11). De tunica albuginea kan voorzichtig en ondiep met een naald worden ingeprikt op de beide polen van het orgaan, zodat het fixatief snel kan binnendringen.

   Histopathologie

   De ovaria, testes en epididymides van de dieren in de hoogste dosisgroep en de controlegroep moeten aan een uitvoerig histologisch onderzoek worden onderworpen (met speciale aandacht voor de stadia van de spermatogenese en de histopathologie van de interstitiële testiculaire celstructuur). De overige geconserveerde organen, waaronder de schildklier van jongen en van volwassen dieren, kunnen worden onderzocht indien nodig. Het gewicht van de schildklier kan na de fixatie worden bepaald. Aanhechtend weefsel moet zeer voorzichtig en pas na fixatie worden verwijderd, om beschadiging van de weefsels te voorkomen. Weefselbeschadigingen kunnen de histopathologische analyse negatief beïnvloeden. Wanneer er veranderingen worden waargenomen in de groep met de hoogste dosering, moeten ook de dieren in de andere doseringsgroepen worden onderzocht. In de richtsnoeren voor histopathologisch onderzoek (11) zijn nadere gegevens opgenomen over de sectie, de fixatie, het snijden van coupes en de histopathologie van endocriene weefsels.

   GEGEVENS EN RAPPORTAGE

   Gegevens

   Er worden voor elk dier apart gegevens verstrekt. Daarnaast moeten alle gegevens worden samengevat in tabelvorm, waarbij voor elke testgroep worden vermeld: het aantal dieren aan het begin van de test, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of met het oog op een humane behandeling is gedood, het tijdstip van sterfte of humane doding, het aantal vruchtbare dieren, het aantal drachtige vrouwtjes, het aantal dieren met toxiciteitsverschijnselen, een beschrijving van de waargenomen toxiciteitsverschijnselen met vermelding van de aanvang, de duur en de ernst van de toxische effecten, de aard van de histopathologische veranderingen en alle relevante gegevens over de nesten. In aanhangsel 3 is een opzet van een overzichtstabel opgenomen die heel praktisch is gebleken voor de beoordeling van effecten op de voortplanting en de ontwikkeling.

   Vanwege de beperkte omvang van het onderzoek, zijn statistische analyses in de vorm van toetsen voor „significantie” voor veel eindpunten, vooral die in verband met de voortplanting, van beperkte waarde. Als er statistische analyses worden gebruikt, moeten de gekozen methoden geschikt zijn voor de verdeling van de onderzochte variabele en moeten ze vóór de start van het onderzoek worden gekozen. De statistische analyse van de AGD en de tepelretentie moet worden gebaseerd op de gegevens voor afzonderlijke jongen, waarbij rekening wordt gehouden met nesteffecten. Waar passend is het nest de analyse-eenheid. De statistische analyse van lichaamsgewicht van de jongen moet worden gebaseerd op de gegevens voor afzonderlijke jongen, waarbij rekening wordt gehouden met nestgrootte. Vanwege de geringe groepsgrootte kan het ook nuttig zijn om gebruik te maken van historische controlegegevens (bv. voor nestgrootte), indien beschikbaar, ter ondersteuning van de interpretatie van het onderzoek.

   Evaluatie van de resultaten

   De resultaten van dit toxiciteitsonderzoek worden beoordeeld aan de hand van de waargenomen effecten en de resultaten van de obductie en het microscopisch onderzoek. De beoordeling omvat het verband tussen de dosis van de teststof en de aanwezigheid of afwezigheid, de frequentie en de ernst van afwijkingen zoals macroscopisch letsel, gespecificeerde doelorganen, onvruchtbaarheid, klinische afwijkingen, aantasting van de reproductie- en nestresultaten, veranderingen in het lichaamsgewicht, effecten op de mortaliteit en andere toxische effecten.

   Vanwege de korte behandelperiode van de mannetjes moeten bij de beoordeling van effecten op de voortplanting bij mannetjes niet alleen de vruchtbaarheidsgegevens, maar ook de histopathologie van de testes en de epididymides in aanmerking worden genomen. Ook het gebruik van historische controlegegevens over voortplanting/ontwikkeling (bv. voor nestgrootte, AGD, tepelretentie, T4-serumspiegels), indien beschikbaar, kan nuttig zijn ter ondersteuning van de interpretatie van het onderzoek.

   Voor de kwaliteitscontrole wordt voorgesteld historische controlegegevens te verzamelen en variatiecoëfficiënten te berekenen voor numerieke gegevens, met name voor de parameters die verband houden met het opsporen van hormoonontregelaars. Deze gegevens kunnen voor vergelijkingsdoeleinden worden gebruikt wanneer daadwerkelijk uitgevoerd onderzoek wordt geëvalueerd.

   Testverslag

   In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

   • Teststof:

     • bron, partijnummer, uiterste gebruiksdatum, indien beschikbaar;

     • stabiliteit van de teststof, indien bekend.

   • Stof die uit één component bestaat:

     • fysisch voorkomen, oplosbaarheid in water en aanvullende relevante fysisch-chemische eigenschappen;

     • chemische identificatiegegevens, zoals IUPAC- of CAS-naam, CAS-nummer, SMILES- of InChI-code, structuurformule, zuiverheid, chemische identiteit van onzuiverheden, indien van toepassing en praktisch haalbaar enz.

   • Stof die uit meerdere componenten bestaat, UVCB’s en mengsels:

     • voor zover mogelijk, karakterisering aan de hand van chemische identiteit (zie hierboven), kwantitatief voorkomen en relevante fysisch-chemische eigenschappen van de bestanddelen.

   • Vehiculum (indien van toepassing):

     • motivering voor de keuze van het vehiculum, indien geen water wordt gebruikt.

   • Proefdieren:

     • gebruikte soort/stam;

     • aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;

     • herkomst, leefomstandigheden, voeding enz.;

     • gewicht van elk dier aan het begin van de test;

     • motivering voor het gebruik van een ander soort dan ratten.

   • Testomstandigheden:

     • achtergrond voor de keuze van de dosisniveaus;

     • gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof, de bereiding van het voer en de bereikte concentratie, stabiliteit en homogeniteit van het preparaat;

     • gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof;

     • omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/drinkwater (in ppm) naar de feitelijke dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing;

     • gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het water;

     • gedetailleerde beschrijving van de randomisatieprocedure voor de selectie van te ruimen jongen, indien van toepassing.

   • Resultaten:

     • lichaamsgewicht en veranderingen in het lichaamsgewicht;

     • indien beschikbaar, voedselverbruik en waterverbruik;

     • gegevens over de toxische reactie naar geslacht en dosis, met inbegrip van vruchtbaarheid, dracht en andere gegevens over toxiciteit;

     • duur van de dracht;

     • toxische of andere effecten op de reproductie, de jongen, de postnatale groei enz.;

     • aard, ernst en duur van (al dan niet reversibele) klinische waarnemingen;

     • aantal volwassen vrouwtjes met een normale of abnormale oestruscyclus en cyclusduur van deze vrouwtjes;

     • aantal levend geboren jongen en verliezen na implantatie;

     • gegevens over het lichaamsgewicht van jongen;

     • AGD van alle jongen (en lichaamsgewicht op de dag van de AGD-meting);

     • tepelretentie bij mannelijke jongen;

     • schildklierhormoonspiegels bij dag 13-jongen en volwassen mannetjes (en moederdieren en dag 4-jongen indien gemeten);

     • aantal jongen met macroscopisch zichtbare afwijkingen, macroscopische beoordeling van de uitwendige geslachtsorganen, aantal ondermaatse jongen;

     • tijdstip van sterfte tijdens het onderzoek en of de dieren overleefden tot het einde van het onderzoek;

     • aantal implantaties, nestgrootte en nestgewichten op het moment van registratie;

     • lichaamsgewicht bij het doden van de dieren en gegevens over het gewicht van organen voor de ouderdieren;

     • obductiebevindingen;

     • een gedetailleerde beschrijving van histopathologische bevindingen;

     • resorptiegegevens (indien beschikbaar);

     • een statistische behandeling van de resultaten, indien van toepassing.

   Bespreking van de resultaten.

   Conclusies.

   Interpretatie van resultaten

   Op basis van dit onderzoek kan de reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit worden beoordeeld bij de toediening van herhaalde doses (zie de punten 5 en 6). Het onderzoek zou een indicatie kunnen geven of verder onderzoek nodig is en biedt oriëntatiepunten voor de opzet van vervolgonderzoeken. OESO-leidraad nr. 43 moet worden geraadpleegd voor hulp bij de interpretatie van resultaten op het gebied van reproductie- en ontwikkelingstoxiciteit (12). In OESO-leidraad nr. 106 over de histologische beoordeling van endocriene en voortplantingstests bij knaagdieren (11) is informatie te vinden over het prepareren en beoordelen van (endocriene) organen en vaginale uitstrijkjes, die van nut kan zijn voor deze TG.

   LITERATUUR

   1. OESO (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Op aanvraag verkrijgbaar bij de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   2. OESO (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. Op aanvraag verkrijgbaar bij de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   3. OESO (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998. Op aanvraag verkrijgbaar bij de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   4. OESO (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   5. OESO (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   6. OESO (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 150), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   7. Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97.

   8. Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York.

   9. Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. and Reynolds V.L.(1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383-390.

   10. OESO (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   11. OESO (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 106), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   12. OESO (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   Aanhangsel 1

   DEFINITIES (ZIE OOK OESO-LEIDRAAD 150 (6))

   Androgene werking: het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme als een natuurlijk androgeen hormoon (bv. testosteron) te werken.

   Antiandrogene werking: het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme de werking van een natuurlijk androgeen hormoon (bv. testosteron) te onderdrukken.

   Antioestrogene werking: het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme de werking van een natuurlijk oestrogeen hormoon (bv. 17β-oestradiol) te onderdrukken.

   Antithyreoïde werking: het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme de werking van een natuurlijk schildklierhormoon (bv. T3) te onderdrukken.

   Chemische stof: een stof of mengsel.

   Dosering: een algemene term die de dosis, de frequentie en de duur van de toediening omvat.

   Dosis: de toegediende hoeveelheid teststof. De dosis wordt uitgedrukt als gewicht van de teststof per eenheid lichaamsgewicht van het proefdier per dag (bv. mg/kg lichaamsgewicht/dag), of als constante voedingsconcentratie.

   Manifeste toxiciteit: een algemene term die duidelijke toxiciteitsverschijnselen beschrijft die optreden na de toediening van de teststof. Deze verschijnselen moeten een beoordeling van de gevaren mogelijk maken en van een zodanige aard zijn dat verwacht mag worden dat bij een hogere toegediende dosis ernstige toxische verschijnselen en waarschijnlijk sterfte optreden.

   Maternale toxiciteit: schadelijke effecten bij drachtige vrouwtjes, die hetzij specifiek optreden (direct effect), hetzij niet-specifiek (indirect effect).

   NOAEL: afkorting van „no-observed-adverse-effect level”, het niveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld. Dit is het hoogste dosisniveau waarbij nog geen aan de behandeling gebonden nadelige effecten worden vastgesteld.

   Oestrogene werking: het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme als een natuurlijk oestrogeen hormoon (bv. 17β-oestradiol) te werken.

   Ontwikkelingstoxiciteit: de wijze waarop reproductietoxiciteit zich manifesteert, in de vorm van pre-, peri- en postnatale, structurele of functionele afwijkingen bij nakomelingen.

   Reproductietoxiciteit: schadelijke effecten op de nakomelingen en/of verstoring van de voortplantingsfuncties of het voortplantingsvermogen bij mannetjes en vrouwtjes.

   Teststof: elke volgens deze testmethode getest(e) stof of mengsel.

   Thyreoïde werking: het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme als een natuurlijk schildklierhormoon (bv. T3) te werken.

   Validering: een wetenschappelijke methode die erop gericht is om de operationele vereisten en beperkingen van een testmethode te beschrijven en de betrouwbaarheid en relevantie ervan voor een bepaald doel aan te tonen.

   Verstoring van de vruchtbaarheid: afwijkingen in de voortplantingsfuncties of het voortplantingsvermogen bij mannetjes of vrouwtjes.

   Aanhangsel 2

   DIAGRAM VAN DE PROEFOPZET MET DE MAXIMALE ONDERZOEKSDUUR OP BASIS VAN EEN VOLLEDIGE 14-DAAGSE PARINGSPERIODE

   

   Aanhangsel 3

   OVERZICHTSTABEL VAN DE EFFECTEN OP REPRODUCTIE/ONTWIKKELING

   WAARNEMINGEN	WAARDEN
   Dosering (eenheden)	0 (controle)	…	…	…	…
   Paren bij begin (N)
   Oestruscyclus (ten minste gemiddelde duur en frequentie van onregelmatige cycli)
   Vrouwtjes met aanwijzingen voor copulatie (N)
   Vrouwtjes die drachtig worden (N)
   Dagen conceptie 1 - 5 (N)
   Dagen conceptie 6 -...(1) (N)
   Dracht ≤ 21 dagen (N)
   Dracht = 22 dagen (N)
   Dracht ≥ 23 dagen (N)
   Moederdieren met levend geboren jongen (N)
   Moederdieren met levende jongen op postnatale dag 4 (N)
   Implantaten/moederdier (gemiddeld)
   Levende jongen/moederdier bij geboorte (gemiddeld)
   Levende jongen/moederdier op dag 4 (gemiddeld)
   Geslachtsverhouding (m/v) bij geboorte (gemiddeld)
   Geslachtsverhouding (m/v) op dag 4 (gemiddeld)
   Gewicht van het nest bij geboorte (gemiddeld)
   Gewicht van het nest op dag 4 (gemiddeld)
   Gewicht van de jongen bij geboorte (gemiddeld)
   Gewicht van de jongen op het moment van AGD-meting (gemiddeld bij mannetjes, gemiddeld bij vrouwtjes)
   AGD jongen op dezelfde postnatale dag, geboorte - dag 4 (gemiddeld bij mannetjes, gemiddeld bij vrouwtjes)
   Gewicht van de jongen op dag 4 (gemiddeld)
   Tepelretentie bij mannelijke jongen op dag 13 (gemiddeld)
   Gewicht van de jongen op dag 13 (gemiddeld)
   AFWIJKENDE JONGEN
   Moederdieren met 0
   Moederdieren met 1
   Moederdieren met ≥ 2
   VERLIES VAN NAKOMELINGEN

   TOXICITEITSONDERZOEK BIJ HERHAALDE TOEDIENING IN COMBINATIE MET DE SCREENINGTEST VOOR REPRODUCTIE/ONTWIKKELINGSTOXICITEIT

   INLEIDING

   Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 422 (2016) van de OESO. OESO-richtlijnen voor het testen van chemische stoffen worden periodiek in het licht van de wetenschappelijke vorderingen getoetst. De oorspronkelijke screeningtestrichtlijn 422 werd vastgesteld in 1996 op basis van een protocol voor een gecombineerde screeningtest voor toxiciteit bij herhaalde toediening en reproductie/ontwikkelingstoxiciteit (Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Screening Test) die was besproken op twee bijeenkomsten van deskundigen, in 1990 in Londen (1) en in 1992 in Tokyo (2).

   Deze testmethode combineert een screeninggedeelte voor reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit, gebaseerd op de ervaring die in de aangesloten landen is opgedaan bij het gebruik van de oorspronkelijke methode op bestaande chemische stoffen met een hoog productievolume en in verkennende tests met positieve controlestoffen (3) (4), en een gedeelte voor toxiciteit bij herhaalde toediening, in overeenstemming met OESO-testrichtlijn 407 (toxiciteitsonderzoek (oraal) op knaagdieren bij herhaalde toediening (28 dagen), overeenkomend met hoofdstuk B.7 van deze bijlage).

   Deze testmethode is bijgewerkt met eindpunten die relevant zijn voor hormoonontregelaars, naar aanleiding van de prioritaire actie die de OESO in 1998 is gestart om bestaande testrichtlijnen te herzien en nieuwe testrichtlijnen te ontwikkelen voor het screenen en testen op potentiële hormoonontregelaars (5). In dit verband werd TG 407 (overeenkomend met hoofdstuk B.7 van deze bijlage) in 2008 uitgebreid met parameters die geschikt zijn om de endocriene activiteit van de teststoffen te detecteren. Met de bijwerking van TG 422 werd beoogd om in screeningtestrichtlijnen een aantal voor hormoonontregelaars relevante eindpunten op te nemen, waarbij de blootstellingsperioden bepaalde gevoelige perioden in de ontwikkeling (prenatale en vroeg-postnatale perioden) beslaan.

   De aanvullende, voor hormoonontregelaars relevante eindpunten die werden geselecteerd en die ook deel uitmaken van TG 443 (uitgebreid onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie, overeenkomend met hoofdstuk B.56 van deze bijlage), werden in TG 422 opgenomen op basis van een haalbaarheidsstudie waarin wetenschappelijke en technische vragen met betrekking tot de opname ervan werden onderzocht, alsook aanpassingen van de testopzet die eventueel voor de opname ervan noodzakelijk zouden zijn (6).

   Deze testmethode is ontworpen voor het verkrijgen van beperkte informatie over de effecten van een teststof op het mannelijke en vrouwelijke voortplantingsvermogen, zoals de gonadale functie, paringsgedrag, conceptie, ontwikkeling van de vrucht en geboorte. Deze testmethode is geen alternatief noch een vervanging voor de bestaande testmethoden B.31, B.34, B.35 of B.56.

   INLEIDENDE OVERWEGINGEN

   Bij de bepaling en evaluatie van de toxische eigenschappen van een teststof moet aan de hand van acute-toxiciteitstests eerst informatie over de toxiciteit worden verkregen. Daarna kan de orale toxiciteit door middel van herhaalde toediening worden bepaald. Dit onderzoek geeft informatie over mogelijke gevaren voor de gezondheid die zich kunnen voordoen bij herhaalde blootstelling gedurende een betrekkelijk beperkte tijd. De methode omvat het basale toxiciteitsonderzoek bij herhaalde toediening dat kan worden gebruikt voor stoffen waarvoor een onderzoek van 90 dagen niet gerechtvaardigd is (bv. als het productievolume binnen bepaalde grenzen blijft), of als voorstudie voor een langetermijnonderzoek. Bij het uitvoeren van het onderzoek moeten de richtsnoeren en overwegingen worden gevolgd die worden beschreven in de OESO-leidraad nr. 19 over het herkennen, beoordelen en gebruiken van klinische verschijnselen als humane eindpunten voor proefdiergebruik bij veiligheidsbeoordelingen (7).

   De methode omvat bovendien een screeningtest voor reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit en kan daarom ook worden gebruikt om oriënterende gegevens te verkrijgen over mogelijke effecten op het mannelijke en vrouwelijke voortplantingsvermogen, zoals de gonadale functie, paringsgedrag, conceptie, ontwikkeling van de vrucht en geboorte, hetzij in een vroeg stadium van de beoordeling van de toxicologische eigenschappen van teststoffen hetzij voor teststoffen waarbij dergelijke effecten worden vermoed. Deze testmethode verschaft geen volledige informatie over alle aspecten van reproductie en ontwikkeling. Met name voor het detecteren van postnatale gevolgen van prenatale blootstelling of effecten die tijdens postnatale blootstelling zijn veroorzaakt, is de informatie die deze methode oplevert slechts beperkt. Als gevolg van (onder andere) de selectiviteit van de eindpunten en de korte onderzoeksduur kan met deze methode geen bewijs worden verkregen om definitief te concluderen dat een stof geen effecten veroorzaakt op de voortplanting en ontwikkeling. Als er verder geen gegevens zijn uit andere tests op reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit, zijn positieve resultaten evenwel nuttig voor een eerste gevarenbeoordeling en kunnen ze als basis dienen voor beslissingen over de noodzaak en timing van aanvullende tests.

   De resultaten die worden verkregen met de parameters die met het endocriene systeem te maken hebben, moeten worden gezien in samenhang met het conceptueel kader van de OESO voor het testen en beoordelen van hormoonontregelende stoffen (8). In dit conceptueel kader is de uitgebreide TG 422 van de OESO ondergebracht in niveau 4 als eenin-vivobepaling waarmee gegevens kunnen worden verkregen over schadelijke effecten op eindpunten die relevant zijn voor het endocrien systeem. Een endocrien signaal hoeft op zichzelf echter niet als voldoende bewijs te worden beschouwd dat de teststof een hormoonontregelaar is.

   Bij deze testmethode ligt het accent ook op neurologische effecten als specifiek eindpunt. Benadrukt moet worden dat het noodzakelijk is de dieren zorgvuldig klinisch te observeren om zoveel mogelijk informatie te verzamelen. Ze moet het mogelijk maken potentieel neurotoxische chemicaliën te identificeren, die in dit opzicht nader verdienen te worden onderzocht. Bovendien kan de methode een ruwe indicatie geven van immunologische effecten.

   Als er geen gegevens zijn uit andere onderzoeken naar systemische toxiciteit, reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit, neurotoxiciteit en/of immutoxiciteit, zijn positieve resultaten bovendien nuttig voor een eerste gevarenbeoordeling en kunnen ze als basis dienen voor beslissingen over de noodzaak en timing van aanvullende tests. De test kan vooral nuttig zijn als onderdeel van de Screening Information Data Set (SIDS) van de OESO voor de beoordeling van bestaande chemische stoffen waarvoor weinig of geen toxicologische gegevens beschikbaar zijn, en kan als alternatief dienen voor het uitvoeren van twee aparte tests voor respectievelijk toxiciteit bij herhaalde toediening (OSEO-TG 407, die overeenkomt met hoofdstuk B.7 van deze bijlage) en reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit (OSEO-TG 421, die overeenkomt met hoofdstuk B.63 van deze bijlage). De test kan ook worden gebruikt als bereikbepalingsonderzoeken voor uitvoeriger onderzoeken naar reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit, of wanneer het gebruik ervan anderszins relevant wordt geacht.

   In het algemeen wordt aangenomen dat er verschillen in gevoeligheid zijn tussen drachtige en niet-drachtige dieren. In deze gecombineerde test kan het dan ook moeilijker zijn om dosisniveaus te bepalen die geschikt zijn voor zowel de beoordeling van algemene systemische toxiciteit als specifieke reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit, ten opzichte van de situatie waarin de afzonderlijke tests apart worden uitgevoerd. Bovendien kunnen de testresultaten voor algemene systemische toxiciteit moeilijker te interpreteren zijn dan wanneer een apart onderzoek bij herhaalde toediening wordt uitgevoerd, vooral wanneer de serum- en histopathologieparameters in het onderzoek niet tegelijkertijd worden beoordeeld. Vanwege de technische complexiteit vergt de uitvoering van deze gecombineerde screeningtest ruime ervaring met testen op toxiciteit. Anderzijds kan de gecombineerde test, afgezien van het geringere aantal dieren dat nodig is, een beter middel bieden om rechtstreekse effecten op voorplanting/ontwikkeling te onderscheiden van effecten die voortvloeien uit andere (systemische) effecten.

   In deze test is de doseringsperiode langer dan in een klassiek 28-daags onderzoek bij herhaalde toediening. Er zijn echter minder dieren van elk geslacht per groep nodig dan wanneer een klassiek 28-daags onderzoek bij herhaalde toediening wordt uitgevoerd naast een screeningtest voor reproductie/ontwikkelingstoxiciteit.

   Bij deze testmethode wordt aangenomen dat de teststof oraal wordt toegediend. Als andere blootstellingsroutes worden gebruikt, moet de methode mogelijk worden aangepast.

   Voordat de testmethode wordt gebruikt op een mengsel om gegevens te genereren voor een beoogd regelgevingsdoel, moet worden nagegaan of, en zo ja, waarom deze methode betrouwbare resultaten oplevert voor dat doel. Zulke overwegingen zijn niet nodig wanneer het testen van het mengsel wettelijk vereist is.

   De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1.

   PRINCIPE VAN DE TEST

   De teststof wordt in geleidelijk oplopende doseringen aan verschillende groepen mannetjes en vrouwtjes toegediend. De mannetjes moeten ten minste vier weken lang de teststof toegediend krijgen, tot en met de dag voordat ze worden gedood (inclusief twee weken voorafgaand aan het paren, tijdens de paringsperiode en ongeveer twee weken na het paren). Gezien de beperkte doseringsperiode voor het paren, is de vruchtbaarheid mogelijk geen bijzonder gevoelige indicator voor testiculaire toxiciteit. Een uitvoerig histologisch onderzoek van de testes is daarom noodzakelijk. De combinatie van een twee weken durende doseringsperiode voor het paren, gevolgd door waarnemingen op het gebied van paring/vruchtbaarheid, met een totale doseringsperiode van ten minste vier weken gevolgd door een uitvoerige histopathologie van de mannelijke geslachtsklieren, wordt voldoende geacht om het merendeel van de effecten op de mannelijke vruchtbaarheid en de spermatogenese te kunnen detecteren.

   De vrouwtjes moeten het hele onderzoek lang de teststof toegediend krijgen. Dit betekent twee weken voorafgaand aan het paren (zodat het onderzoek ten minste twee volledige oestruscycli omvat), de variabele tijd tot conceptie, de duur van de dracht en ten minste dertien dagen na het werpen, tot en met de dag voordat ze worden gedood.

   De duur van het onderzoek, na acclimatisering en beoordeling van de oestruscyclus voorafgaand aan de behandeling, is afhankelijk van het gedrag van het vrouwtje en beloopt ongeveer 63 dagen (ten minste 14 dagen vóór het paren, (tot) 14 dagen paring, 22 dagen dracht, en ten slotte een zoogperiode van 13 dagen).

   Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks zorgvuldig geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven of worden gedood, wordt obductie verricht. Dieren die aan het eind van het onderzoek nog in leven zijn, worden gedood en ook hierop wordt obductie verricht.

   BESCHRIJVING VAN DE METHODE

   Keuze van de diersoort

   Deze testmethode is ontworpen om te worden toegepast met ratten. Indien de in TG 422 gespecificeerde parameters worden onderzocht bij een andere knaagdiersoort moet dit uitvoerig worden gemotiveerd. In het internationale valideringsprogramma voor de detectie van hormoonontregelaars voor TG 407 zijn alleen ratten gebruikt. Stammen met een lage vruchtbaarheid of waarvan bekend is dat er vaak ontwikkelingsstoornissen optreden, mogen niet worden gebruikt. Er moet gebruikgemaakt worden van gezonde dieren die nog niet eerder gepaard hebben en nog niet eerder aan experimenten zijn onderworpen. Van de proefdieren moeten soort, stam, geslacht, gewicht en leeftijd bekend zijn. Per geslacht mag bij aanvang van het onderzoek het gewicht van de dieren die worden gebruikt, niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken. Wanneer het onderzoek wordt uitgevoerd als voorstudie voor een onderzoek van langere duur of een onderzoek over een volledige generatie, verdient het de voorkeur dat de dieren in beide onderzoeken tot dezelfde stam behoren en dezelfde oorsprong hebben.

   Huisvesting en voeding

   Alle procedures moeten in overeenstemming zijn met de plaatselijke normen voor de verzorging van proefdieren. De temperatuur in de proefdierruimte moet 22 °C (± 3 °C) zijn. De relatieve luchtvochtigheid moet ten minste 30 % bedragen en mag, behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte, bij voorkeur niet hoger zijn dan 70 %. Verlichting gebeurt met kunstlicht met een fotoperiode van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende mengbaarheid met de teststof te zorgen, wanneer de stof in het voer wordt toegediend.

   De dieren moeten in kleine groepen van hetzelfde geslacht worden gehuisvest; de dieren kunnen individueel worden gehuisvest als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is. Indien de dieren in groepen in kooien worden ondergebracht, mogen per kooi niet meer dan vijf dieren worden gehuisvest. Het paren moet plaatsvinden in kooien die voor dat doel geschikt zijn. Drachtige vrouwtjes moeten in aparte kooien worden ondergebracht en nestmateriaal krijgen. Zogende vrouwtjes moeten samen met hun jongen in aparte kooien worden ondergebracht.

   Het voeder moet regelmatig op verontreinigingen worden onderzocht. Een monster van het voedsel moet worden bewaard totdat het verslag is afgerond.

   Voorbereiding van de dieren

   Gezonde jonge volwassen dieren worden gerandomiseerd en in de behandelgroepen en kooien ingedeeld. De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. De dieren krijgen een unieke identificatie en blijven, voordat de test begint, minimaal vijf dagen in hun kooi om in het laboratorium te acclimatiseren.

   Voorbereiding van de doses

   Aanbevolen wordt om de teststof oraal toe te dienen, tenzij andere toedieningswegen geschikter worden geacht. Wanneer voor de orale weg wordt gekozen, wordt de teststof gewoonlijk via een sonde toegediend; als alternatieve mogelijkheid kunnen teststoffen echter ook via het voer of het drinkwater worden toegediend.

   Waar nodig wordt de teststof in een geschikt vehiculum opgelost of gesuspendeerd. Aanbevolen wordt eerst te bezien of het mogelijk is een waterige oplossing/suspensie te gebruiken, als dit niet kan een oplossing/suspensie in olie (bv. maïsolie) te overwegen en daarna eventueel andere vehicula. Van niet-waterige vehicula moeten de toxische kenmerken bekend zijn. Voorts moeten de stabiliteit en homogeniteit van de teststof in het vehiculum worden bepaald.

   PROCEDURE

   Aantal en geslacht van de dieren

   Aanbevolen wordt dat elke groep aan het begin van de test ten minste 10 mannetjes en 12-13 vrouwtjes telt. Bij de vrouwtjes wordt vóór blootstelling de oestruscyclus beoordeeld. Dieren die geen normale 4-5-daagse cyclus hebben, worden niet het onderzoek opgenomen. Daarom wordt aanbevolen met extra vrouwtjes te beginnen om uiteindelijk op 10 vrouwtjes per groep uit te komen. Behalve in geval van duidelijke toxische effecten wordt verwacht dat dit ten minste 8 drachtige vrouwtjes per groep zal opleveren, hetgeen normaal gesproken het minimaal aanvaardbare aantal drachtige vrouwtjes per groep is. Het doel is voldoende drachten en nakomelingen tot stand te brengen om een betekenisvolle evaluatie mogelijk te maken van de mogelijke invloed van de stof op de vruchtbaarheid, de dracht en het gedrag van moeder en jongen, en op de groei en ontwikkeling van de F1-nakomelingen, vanaf de conceptie tot dag 13 na het werpen. Indien het de bedoeling is tussentijds dieren te doden, moet het aantal dieren worden verhoogd met het aantal dat tussentijds zal worden gedood. Er moet worden overwogen een aanvullende satellietgroep van vijf dieren per geslacht op te nemen in de controlegroep en de groep met het hoogste dosisniveau, voor waarneming van reversibiliteit, persistentie of vertraagd tot uiting komen van systemische toxische effecten gedurende ten minste 14 dagen na de behandeling. De dieren in de satellietgroepen zullen niet paren en worden dan ook niet gebruikt voor de beoordeling van reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit.

   Dosering

   In het algemeen zijn drie testgroepen en een controlegroep vereist. Als er geen bruikbare algemene toxiciteitsgegevens beschikbaar zijn, kan een bereikbepalingonderzoek worden uitgevoerd (bij dieren van dezelfde stam en dezelfde herkomst) om de orde van grootte van de te gebruiken doses te helpen bepalen. Afgezien van de toediening van de teststof worden de dieren in de controlegroep op identieke wijze behandeld als de dieren in de testgroepen. Indien bij de toediening van de teststof van een vehiculum gebruik wordt gemaakt, moet dit aan de controlegroep in het hoogste gebruikte volume toegediend worden.

   De dosisniveaus moeten worden gekozen in het licht van de bestaande gegevens over toxiciteit en (toxico)kinetica. Er moet ook rekening mee gehouden worden dat er verschillen kunnen zijn in gevoeligheid tussen drachtige en niet-drachtige dieren. Het hoogste dosisniveau moet zo worden gekozen dat toxische effecten optreden, maar geen sterfte of duidelijk lijden. Daarna moet een dalende reeks dosisniveaus gekozen worden om het verband tussen dosering en respons aan te tonen en bij het laagste niveau te komen tot een dosis zonder schadelijke effecten. Intervallen van een factor twee tot vier zijn vaak optimaal en het is vaak beter een vierde testgroep toe te voegen dan zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor 10) tussen de doseringen te gebruiken.

   Bij algemene toxiciteit (bv. verminderd lichaamsgewicht, effecten op lever, hart, longen of nieren enz.) of andere veranderingen die mogelijk geen toxische reacties zijn (bv. verminderde voedselinname, leververgroting), moeten de waargenomen effecten op hormoongevoelige eindpunten met de nodige omzichtigheid worden geïnterpreteerd.

   Limiettest

   Als volgens de hier beschreven procedures een onderzoek met orale toediening wordt uitgevoerd met één dosisniveau van ten minste 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag of, in het geval van toediening via het voer, het equivalente percentage in het voer, of het drinkwater (berekend overeenkomstig het lichaamsgewicht), en er geen waarneembare toxische effecten optreden, en deze ook niet kunnen worden verwacht op grond van gegevens betreffende stoffen met verwante structuur, is het niet noodzakelijk een volledig onderzoek met meerdere dosisniveaus te doen. De limiettest is van toepassing tenzij blootstelling bij mensen een hogere dosering noodzakelijk maakt. Voor andere toedieningsvormen, zoals inhalatie of toediening op de huid, zal de maximaal haalbare blootstelling vaak worden bepaald door de fysisch-chemische eigenschappen van de teststoffen.

   Toediening van de doses

   De dieren krijgen de teststof 7 dagen per week dagelijks toegediend. Indien de teststof via een maagsonde aan het dier wordt toegediend, moet dit in één enkele dosis gebeuren met gebruikmaking van een maagbuisje of een geschikte intubatiecanule. Het maximale volume dat in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het dier. Het volume mag niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht, behalve wanneer het om een waterige oplossing gaat: in dat geval mag 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden gebruikt. Afgezien van irriterende of bijtende teststoffen die normaliter bij hogere concentraties ergere effecten vertonen, moet de variabiliteit in het voor de proef gebruikte volume zo klein mogelijk worden gehouden door de concentratie zodanig aan te passen dat bij alle dosisniveaus een constant volume wordt gewaarborgd.

   Het is belangrijk dat er bij teststoffen die via het voer of het drinkwater worden toegediend, voor wordt gezorgd dat de hoeveelheden teststof de normale voer- of waterbalans niet verstoren. Wanneer de teststof in het voer wordt toegediend, kan een constante concentratie in het voer (in ppm) of een constante dosis in verhouding tot het lichaamsgewicht van de dieren worden gebruikt; daarbij moet worden aangegeven welk alternatief is gebruikt. Wanneer de teststof met een sonde wordt toegediend, moeten de doses dagelijks op vaste tijdstippen worden gegeven. De doses moeten ten minste wekelijks worden aangepast om een constant dosisniveau als functie van het lichaamsgewicht van het dier te verkrijgen. Indien een gecombineerd onderzoek wordt gebruikt als voorstudie van een langdurig chronisch toxiciteitsonderzoek of een volledig reproductietoxiciteitsonderzoek, moet in beide onderzoeken dezelfde voeding worden gebruikt.

   Proefopzet

   Voor beide geslachten moet de toediening 2 weken voor het paren beginnen, nadat de dieren ten minste vijf dagen lang zijn geacclimatiseerd en de vrouwtjes gescreend zijn op normale oestruscycli (in een voorbehandelingsperiode van 2 weken). Het onderzoek moet zodanig worden ingepland dat de beoordeling van de oestruscyclus begint kort nadat de dieren volledig geslachtsrijp zijn. Dit kan enigszins variëren voor verschillende rattenstammen in verschillende laboratoria, bv. voor Sprague Dawley-ratten op een leeftijd van 10 weken, voor Wistar-ratten op een leeftijd van ongeveer 12 weken. Moederdieren met jongen moeten op dag 13 na het werpen worden gedood of kort daarna. Om de moederdieren voorafgaand aan de bloedafname een dag te laten vasten (als daaraan de voorkeur wordt gegeven) hoeven de vrouwtjes en hun jongen niet op dezelfde dag gedood te worden. De dag van de geboorte (d.w.z. wanneer het werpen is voltooid) wordt gedefinieerd als dag 0 na het werpen. Vrouwtjes die geen tekenen van copulatie vertonen, worden 24-26 dagen na de laatste dag van de paringsperiode gedood. Voor beide geslachten wordt de toediening gedurende de paringsperiode voortgezet. Daarna moeten de mannetjes de teststof ten minste nog toegediend krijgen tot de minimale totale doseringsperiode van 28 dagen is afgerond. Vervolgens worden ze gedood of, anders, in leven gehouden en verder behandeld voor een eventuele tweede paring.

   De dagelijkse toediening aan de moederdieren moet doorgaan gedurende de dracht en ten minste tot en met dag 13 na het werpen of de dag voordat ze gedood worden. Voor onderzoeken waarbij de toediening van de teststof door middel van inhalatie of dermaal plaatsvindt, moet deze ten minste worden voortgezet tot en met dag 19 van de dracht en zo spoedig mogelijk en niet later dan postnatale dag (PND) 4 worden hervat.

   Dieren in eventuele satellietgroepen die bestemd zijn voor vervolgwaarnemingen, paren niet. Ze moeten nog 14 dagen nadat de eerste moederdieren gedood worden, zonder behandeling geobserveerd worden om de persistentie van de toxische effecten c.q. het herstel alsmede het eventuele optreden van vertraagde toxiciteit te kunnen waarnemen.

   In aanhangsel 2 wordt de proefopzet in een diagram weergegeven.

   Oestruscycli

   Voordat de behandeling begint, moeten de oestruscycli worden gecontroleerd om te selecteren op vrouwelijke proefdieren met regelmatige cycli (zie punt 27). Ook moeten er van het begin van de behandelingsperiode totdat paring is gebleken, dagelijks vaginale uitstrijkjes worden onderzocht. Indien vermoed wordt dat effecten van acute stress bij het begin van de behandeling de oestruscyclus zouden kunnen verstoren, kunnen de laboratoria de proefdieren gedurende 2 weken blootstellen en vervolgens ten minste 2 weken lang dagelijks vaginale uitstrijkjes nemen ter controle van de oestruscycli gedurende de periode vóór paring tot in de paringsperiode, totdat paring gebleken is. Wanneer monsters van vaginale/cervicale cellen worden genomen, moet erop worden gelet verstoring van het slijmvlies, die tot schijndracht kan leiden, te voorkomen (8) (9).

   De paringsprocedure

   Normaal gesproken moet men voor dit onderzoek één mannetje met één vrouwtje (1:1) laten paren. Hierop zijn uitzonderingen mogelijk in geval van incidentele sterfte van mannetjes. Het vrouwtje moet bij hetzelfde mannetje worden geplaatst totdat aanwijzingen voor copulatie zijn waargenomen of er twee weken zijn verstreken. Elke ochtend worden de vrouwtjes onderzocht op de aanwezigheid van sperma of vaginale plug. Dag 0 van de dracht wordt gedefinieerd als de dag waarop aanwijzingen voor paring worden bevestigd (observatie van een vaginale plug en/of sperma). Wanneer het paren geen succes heeft gehad, kan worden overwogen de vrouwtjes opnieuw te laten dekken door mannetjes van dezelfde groep waarvan de vruchtbaarheid is aangetoond.

   Nestgrootte

   Op PND 4 kan de grootte van de nesten worden aangepast door eliminatie van extra jongen door willekeurige selectie, zodat elk nest uiteindelijk zoveel mogelijk bestaat uit vier of vijf jongen per geslacht, afhankelijk van de normale nestgrootte van de gebruikte rattenstam. Bij twee van de overtollige jongen moeten bloedmonsters worden afgenomen, gepoold en gebruikt ter bepaling van de serumspiegels van T4. Selectieve eliminatie van jongen, bijvoorbeeld op grond van lichaamsgewicht of anogenitale afstand (AGD), is niet gepast. Als het door het aantal mannelijke of vrouwelijke jongen niet mogelijk is om op vier of vijf per geslacht per nest uit te komen, is gedeeltelijke aanpassing (bv. zes mannetjes en vier vrouwtjes) aanvaardbaar. Er worden geen jongen geëlimineerd als de nestgrootte daardoor onder de streefgrootte (8 of 10 jongen/nest) zou komen. Als er maar één jong beschikbaar is boven de streefgrootte, wordt er slechts één jong geëlimineerd en gebruikt voor het nemen van een bloedmonster ter bepaling van serum-T4.

   Als de nestgrootte niet wordt aangepast, worden er op PND 4 twee jongen per nest gedood en worden er bloedmonsters genomen voor het meten van de serumspiegels van schildklierhormonen. De twee jongen per nest moeten zo mogelijk vrouwelijke jongen zijn om de mannelijke jongen te bewaren voor de beoordeling van de tepelretentie, tenzij er na verwijdering van deze jongen geen enkel vrouwtje meer overblijft voor de beoordeling bij beëindiging van het onderzoek. Er worden geen jongen geëlimineerd als de nestgrootte daardoor onder de 8 of 10 jongen/nest (afhankelijk van de normale nestgrootte van de gebruikte rattenstam) zou komen. Als er maar één jong beschikbaar is boven de normale nestgrootte, wordt er slechts één jong geëlimineerd en gebruikt voor het nemen van een bloedmonster ter bepaling van serum-T4.

   Waarnemingen

   Algemene klinische waarnemingen moeten ten minste eenmaal per dag plaatsvinden, bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip en met inachtneming van de piekperiode van de te verwachten effecten na toediening. De gezondheidstoestand van de dieren moet worden geregistreerd. De dieren moeten ten minste tweemaal per dag worden geobserveerd op ziekteverschijnselen en sterfte.

   Alle ouderdieren worden eenmaal vóór de eerste blootstelling nauwkeurig klinisch onderzocht (om intra-individuele vergelijking mogelijk te maken) en vervolgens ten minste eenmaal per week. Dit onderzoek moet buiten de kooi op een vaste onderzoekplaats en bij voorkeur steeds op dezelfde dag uitgevoerd worden. De gegevens moeten zorgvuldig worden opgetekend, bij voorkeur met behulp van scoringssystemen die door het testlaboratorium expliciet zijn gedefinieerd. Er moet zo veel mogelijk worden gezorgd dat variaties in de testomstandigheden minimaal zijn en dat de waarnemers niet weten welke behandeling een gegeven dier heeft ondergaan. Tekenen waarop moet worden gelet zijn onder meer (maar niet alleen): veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en uitscheiding, en onwillekeurige reacties zoals traanvorming, rechtopstaan van het haar, verandering van de pupilgrootte of een ongewoon ademhalingspatroon. Ook verandering in gang, houding en reactiviteit op vastpakken, alsmede de aanwezigheid van klonische of tonische bewegingen, stereotiep gedrag (bv. overmatige lichaamsverzorging, herhaaldelijk ronddraaien), een moeilijke of langdurige worp of bizar gedrag (bv. zelfverminking, achteruitlopen) moeten worden opgetekend (10).

   In de loop van het onderzoek moet op enig moment bij vijf mannetjes en vijf vrouwtjes, die aselect worden gekozen uit elke groep, de sensorische reactiviteit op stimuli van verschillende aard (bv. auditief, visueel of proprioceptief) (8) (9) (11) worden bepaald en moet een bepaling van de grijpkracht (12) en de motorische activiteit (13) plaatsvinden. Meer informatie over de procedures die kunnen worden gevolgd, is te vinden in de desbetreffende literatuur. Er kunnen evenwel ook andere dan de genoemde procedures worden toegepast. Bij mannetjes moeten deze functionele waarnemingen tegen het einde van hun doseringsperiode worden gedaan, kort voordat ze gedood zullen worden, maar ook voordat er bloed wordt afgenomen voor hematologische en klinisch-chemische bepalingen (zie de punten 53-56, waaronder voetnoot 1). Vrouwtjes moeten tijdens deze functionele tests in een vergelijkbare fysiologische toestand verkeren en moeten bij voorkeur eenmaal worden getest in de laatste week van de zoogperiode (bv. zoogdag 6-13), kort voordat ze gedood worden. Probeer moederdieren en jongen steeds zo kort mogelijk van elkaar te scheiden.

   Als het onderzoek wordt verricht als voorstudie voor een daaropvolgend subchronisch onderzoek van 90 dagen of langetermijnonderzoek, kunnen de eenmalige functionele waarnemingen tegen het einde van het onderzoek achterwege worden gelaten. In dat geval moeten de functionele waarnemingen in het bedoelde vervolgonderzoek plaatsvinden. Daar staat echter tegenover dat de beschikbaarheid van gegevens betreffende functionele waarnemingen uit het onderzoek met herhaalde toediening, de keuze van de dosisniveaus voor het daaropvolgende subchronische of langetermijnonderzoek ten goede kan komen.

   Bij wijze van uitzondering kunnen functionele waarnemingen ook achterwege worden gelaten bij groepen die anders tekenen van toxiciteit vertonen in een mate die aanzienlijk zou interfereren met de uitvoering van de functionele test.

   De drachttijd moet worden geregistreerd en wordt berekend vanaf dag 0 van de dracht. Elke worp moet zo spoedig mogelijk na de geboorte te worden onderzocht, teneinde het aantal en geslacht van de jongen vast te stellen, alsmede het aantal doodgeborenen, levendgeborenen, ondermaatse jongen (jongen die aanmerkelijk kleiner zijn dan de corresponderende controlejongen) en de aanwezigheid van macroscopisch zichtbare afwijkingen.

   Levende jongen moeten worden geteld en gesekst en de nesten moeten binnen 24 uur na de geboorte (dag 0 of 1 na het werpen) en ten minste op dag 4 en dag 13 na het werpen worden gewogen. Naast de in punt 43 en 44 beschreven waarnemingen voor ouderdieren moet elk afwijkend gedrag van de nakomelingen worden geregistreerd.

   De AGD van elk jong moet worden gemeten op dezelfde postnatale dag tussen postnatale dag 0 en het einde van postnatale dag 4. Het lichaamsgewicht van elk jong moet worden bepaald op de dag dat de AGD wordt gemeten en de AGD moet genormaliseerd worden tot een maat voor jonggrootte, bij voorkeur de derdemachtswortel van het lichaamsgewicht (14). Het aantal tepels/tepelhoven bij mannelijke jongen moet worden geteld op postnatale dag 12 of 13, zoals aanbevolen in OESO-leidraad 151 (15).

   Lichaamsgewicht en consumptie van voer en water

   De mannetjes en vrouwtjes moeten worden gewogen op de eerste dag dat zij de teststof krijgen toegediend, vervolgens ten minste eenmaal per week en aan het einde van het onderzoek. De vrouwtjes moeten worden gewogen op de dagen 0, 7, 14 en 20 tijdens de dracht, binnen 24 uur na de geboorte (dag 0 of 1 na het werpen) en ten minste op dag 4 en dag 13 na het werpen. Deze waarnemingen worden voor elk volwassen dier apart gerapporteerd.

   Vóór het paren, tijdens de dracht en tijdens het zogen, moet ten minste wekelijks de voerconsumptie worden gemeten. Tijdens de paringsperiode is deze meting facultatief. Wanneer de teststof via het drinkwater wordt toegediend, moet ook de waterconsumptie gedurende deze perioden worden gemeten.

   Hematologie

   Tijdens het onderzoek moeten eenmaal bij vijf mannetjes en vijf vrouwtjes, die aselect worden gekozen uit elke groep, de volgende hematologische onderzoeken worden verricht: hematocriet, hemoglobinegehalten, aantal rode bloedcellen, reticulocyten, totaal aantal en gedifferentieerde aantallen witte bloedcellen, aantal bloedplaatjes en bloedstollingstijd/vermogen. Indien de teststof of de vermeende metabolieten ervan oxiderende eigenschappen hebben, of hiervan een vermoeden bestaat, moeten andere bepalingen worden uitgevoerd, zoals van de methemoglobineconcentratie en de Heinz-lichaampjes.

   Bij het nemen van de bloedmonsters moet worden genoteerd uit welk lichaamsdeel en hoe de monsters zijn genomen. Tijdens de bloedafname moeten de vrouwtjes in een vergelijkbare fysiologische toestand verkeren. Om praktische problemen in verband met de variabiliteit in het begin van de dracht te vermijden, kan de bloedafname bij vrouwtjes aan het einde van de periode voor het paren worden uitgevoerd als alternatief voor de monstername net voor of tijdens het euthanaseren van de dieren. De bloedmonsters van de mannetjes moeten bij voorkeur net voor of tijdens het euthanaseren van de dieren worden genomen. Als alternatieve mogelijkheid kan de bloedafname bij mannetjes ook aan het einde van de periode voor het paren worden uitgevoerd, wanneer dat tijdstip ook voor de vrouwtjes wordt gekozen.

   De bloedmonsters moeten onder passende omstandigheden worden bewaard.

   Klinische biochemie

   Klinisch-biochemische bepalingen die bedoeld zijn om wezenlijke toxische effecten in weefsels en met name effecten op de nieren en lever te onderzoeken, moeten worden verricht op bloedmonsters die zijn genomen bij de geselecteerde vijf mannetjes en vijf vrouwtjes uit elke groep. Het is aan te bevelen in de nacht voordat de bloedmonsters worden genomen de dieren voedsel te onthouden⁽⁵⁾. Onderzoek van plasma of serum moet omvatten: natrium, kalium, glucose, totaal cholesterol, ureum, creatinine, totaal proteïne en albumine, ten minste twee enzymen die een indicatie geven van hepatocellulaire effecten (zoals alanineaminotransferase, aspartaataminotransferase en sorbitoldehydrogenase), en galzuren. Bepaling van andere enzymen (van hepatische of andere oorsprong) en bilirubine kan onder bepaalde omstandigheden nuttige informatie geven.

   Er worden bloedmonsters genomen van een gedefinieerde plaats op basis van het volgende schema:

   • van ten minste twee jongen per nest op PND 4 als het aantal jongen dit toelaat (zie de punten 40-41);

   • van alle moederdieren en ten minste twee jongen per nest op het tijdstip van doden op dag 13, en

   • van alle volwassen mannetjes op het tijdstip van doden.

   Alle bloedmonsters worden onder passende omstandigheden bewaard. In de bloedmonsters van de jongen op dag 13 en de volwassen mannetjes worden de serumspiegels van schildklierhormonen (T4) bepaald. Een verdere bepaling van T4 in bloedmonsters van moederdieren en jongen op dag 4 wordt verricht indien relevant. Eventueel kunnen ook andere hormonen worden gemeten indien relevant. Voor de schildklierhormoonanalyse kan bloed van jongen per nest gepoold worden. De schildklierhormonen (T4 en TSH) worden bij voorkeur als „totaal” gemeten.

   Als optie kunnen tijdens de laatste week van het onderzoek de volgende urineonderzoeken worden verricht bij vijf aselect gekozen mannetjes uit elke groep, waarbij op regelmatige tijdstippen urinemonsters moeten worden genomen: uitzien, volume, osmolaliteit of relatieve dichtheid, pH, eiwit, glucose en bloed/bloedcellen.

   Bovendien moet worden overwogen serummarkers van algemene weefselbeschadiging te onderzoeken. Andere onderzoeken die moeten worden uitgevoerd als van de teststof bekend is, of vermoed wordt, dat zij de desbetreffende metabolische profielen beïnvloedt, zijn: calcium, fosfaat, triglyceriden en glucose bij nuchtere toestand, specifieke hormonen, methemoglobine en cholesterinase. Deze moeten per geval geïdentificeerd worden.

   De volgende factoren kunnen van invloed zijn op de variabiliteit en de absolute concentraties van de hormoonbepalingen:

   • tijdstip waarop de dieren worden gedood, vanwege de schommelingen in de hormoonconcentraties gedurende de dag;

   • wijze waarop de dieren worden gedood: onnodige stress bij de dieren, waardoor de hormoonconcentraties kunnen worden beïnvloed, moet worden voorkomen;

   • testkits voor hormoonbepalingen, die verschillende standaardkrommen kunnen hebben.

   Plasmamonsters die specifiek voor hormoonbepaling zijn bedoeld, moeten telkens op hetzelfde moment van de dag worden genomen. De verschillende in de handel verkrijgbare „assay kits” kunnen verschillende numerieke waarden opleveren bij de analyse van hormoonconcentraties.

   In het geval van ontoereikende basisgegevens uit het verleden moet worden overwogen de hematologische en klinisch-biochemische variabelen te bepalen, bij voorkeur bij een groep dieren die niet in de testgroepen zijn opgenomen, of anders voordat met de toediening wordt begonnen. Voor vrouwtjes moeten de gegevens verkregen zijn bij zogende dieren.

   PATHOLOGIE

   Macroscopische obductie

   Bij alle volwassen dieren in het onderzoek moet een volledige macroscopische obductie worden uitgevoerd, waaronder een zorgvuldig onderzoek van het huidoppervlak, alle lichaamsopeningen alsmede de schedelholte, de borstholte en de buikholte, en de inhoud daarvan. Bijzondere aandacht moet worden geschonken aan de organen van het voortplantingssysteem. Het aantal implantatieplaatsen moet worden geregistreerd. Op de dag van obductie moeten er vaginale uitstrijkjes onderzocht worden om de fase van de oestruscyclus te bepalen en deze in verband te kunnen brengen met de histopathologie van de vrouwelijke geslachtsorganen.

   De testes en epididymides, evenals de prostaat en de zaadblaasjes met coagulans afscheidende klieren als geheel van alle volwassen mannetjes moeten zo nodig worden ontdaan van aanhechtend weefsel en zo spoedig mogelijk na de sectie nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. Optionele organen die eventueel ook gewogen kunnen worden, zijn onder meer het m levator ani plus bulbocavernosuscomplex, de Cowperse klieren en de glans penis bij mannetjes en de gepaarde ovaria (nat gewicht) en uterus (inclusief cervix) bij vrouwtjes; indien deze gewichten worden meegenomen, moeten ze zo snel mogelijk na de sectie worden opgenomen. Van alle volwassen dieren moeten de ovaria, testes, epididymides, secundaire geslachtsorganen en alle organen die macroscopische letsels vertonen, worden geconserveerd.

   Van alle volwassen mannetjes en vrouwtjes en één mannelijk en één vrouwelijk dag 13-jong uit elk nest moeten de schildklieren in een fixeermiddel worden bewaard dat geschikt is voor het beoogde latere histopathologische onderzoek. Het gewicht van de schildklier kan na de fixatie worden bepaald. Aanhechtend weefsel moet zeer voorzichtig en pas na fixatie worden verwijderd, om beschadiging van de weefsels te voorkomen. Weefselbeschadigingen kunnen de histopathologische analyse negatief beïnvloeden. De bloedmonsters moeten worden genomen net voor of tijdens het euthanaseren van de dieren; er moet worden genoteerd uit welk lichaamsdeel. De monsters moeten onder de juiste omstandigheden worden bewaard (zie punt 56).

   Bovendien moeten van ten minste vijf volwassen mannetjes en vrouwtjes die aselect worden gekozen uit elke groep (afgezien van dieren die stervend zijn aangetroffen en/of zijn gedood vóór beëindiging van het onderzoek) de lever, nieren, bijnieren, thymus, milt, hersenen en het hart zo nodig worden ontdaan van aanhechtend weefsel en zo spoedig mogelijk na de sectie nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. De volgende weefsels moeten in een fixeermiddel worden bewaard dat zowel voor het type weefsel als voor het beoogde latere histopathologische onderzoek geschikt is: elk macroscopisch waarneembaar letsel, hersenen (representatieve delen waaronder cerebrum, cerebellum en pons), ruggenmerg, oog, maag, dunne en dikke darm (inclusief Peyerse platen), lever, nieren, bijnieren, milt, hart, thymus, luchtpijp en longen (conserveren door opblazen met een fixatief en dan onderdompelen), geslachtsklieren (testes en ovaria), secundaire geslachtsorganen (uterus en cervix, epididymides, prostaat, zaadblaasjes plus coagulans uitscheidende klieren), vagina, urineblaas, lymfeklieren (naast de meest proximale afvoerende lymfeklier moet ook een andere lymfeklier worden uitgenomen, afhankelijk van de ervaringen van het laboratorium (16)), perifere zenuwen (nervus ischiadicus of nervus tibialis), bij voorkeur dicht bij de spier, skeletspier en bot, met beenmerg (een coupe, of in plaats daarvan een direct op een objectglaasje aangebracht stukje beenmergaspiraat). Aanbevolen wordt de testes te fixeren door middel van onderdompeling in Bouin-oplossing of gemodificeerde Davidson-oplossing (16) (17) (18); fixatie in formaline wordt voor deze weefsels niet aanbevolen. De tunica albuginea kan voorzichtig en ondiep met een naald worden ingeprikt op de beide polen van het orgaan, zodat het fixatief snel kan binnendringen. Uit de klinische en andere bevindingen kan de noodzaak blijken verder weefsel te onderzoeken. Ook organen waarvan op basis van de bekende eigenschappen van de teststof verondersteld wordt dat ze kunnen worden aangetast, moeten worden bewaard.

   De volgende weefsels kunnen nuttige aanwijzingen geven voor met het endocrien systeem samenhangende effecten: geslachtsklieren (ovaria en testes), secundaire geslachtsorganen (uterus inclusief cervix, epididymides, zaadblaasjes met coagulans afscheidende klieren, dorsolaterale en ventrale prostaat), vagina, hypofyse, mannelijke borstklier en bijnier. Er bestaat onvoldoende documentatie over veranderingen in de mannelijke borstklieren, maar deze parameter zou kan erg gevoelig kunnen zijn voor stoffen met oestrogene werking. De waarneming van niet in de lijst van punt 65 opgenomen organen/weefsels is facultatief.

   Dode jongen en jongen die op dag 13 na het werpen, of kort daarna, zijn gedood, moeten in elk geval uitwendig zorgvuldig worden onderzocht op macroscopisch zichtbare afwijkingen. Daarbij wordt met name gelet op de uitwendige voortplantingsorganen, die op tekenen van een afwijkende ontwikkeling worden onderzocht.

   Histopathologie

   Bij alle dieren in de groep behandeld met het hoogste dosisniveau en bij de dieren in de controlegroep moet een volledig histopathologisch onderzoek worden verricht op de bewaarde organen en weefsels (met speciale aandacht voor de stadia van de spermatogenese en de histopathologie van de interstitiële testiculaire celstructuur). Van jongen en van de overgebleven volwassen dieren kan de schildklier worden onderzocht indien nodig. Wanneer er behandelingsgerelateerde veranderingen worden waargenomen in de hogedosisgroep, moeten ook de dieren in de andere doseringsgroepen worden onderzocht. In de richtsnoeren voor histopathologisch onderzoek (10) zijn nadere gegevens opgenomen over de sectie, de fixatie, het snijden van coupes en de histopathologie van endocriene weefsels.

   Alle macroscopisch waarneembare beschadigingen moeten onderzocht worden. Om bij te dragen tot de bepaling van de NOAEL moeten de doelorganen in andere dosisgroepen worden onderzocht, vooral in groepen waarvoor een NOAEL wordt geclaimd.

   Bij het histopathologisch onderzoek van de dieren in de satellietgroepen moet speciaal worden gelet op die organen en weefsels waarin effecten blijken te zijn opgetreden bij de andere behandelde groepen.

   GEGEVENS EN RAPPORTAGE

   Gegevens

   Er worden voor elk dier apart gegevens verstrekt. Daarnaast moeten alle gegevens worden samengevat in tabelvorm, waarbij voor elke testgroep worden vermeld: het aantal dieren aan het begin van de test, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of met het oog op een humane behandeling is gedood, het tijdstip van sterfte of doding, het aantal vruchtbare dieren, het aantal drachtige vrouwtjes, het aantal dieren met toxiciteitsverschijnselen, een beschrijving van de waargenomen toxiciteitsverschijnselen met vermelding van de aanvang, de duur en de ernst van de toxische effecten, de aard van de histopathologische veranderingen en alle relevante gegevens over de nesten. In aanhangsel 3 is een opzet van een overzichtstabel opgenomen die heel praktisch is gebleken voor de beoordeling van effecten op de voortplanting en de ontwikkeling.

   Waar mogelijk moeten getalsmatige resultaten met behulp van een geschikte en algemeen erkende statistische methode worden geëvalueerd. Het gebruik van meerdere t-tests moet worden voorkomen door vergelijking van het effect over een dosisbereik. De statistische methoden moeten gedurende de opzet van het onderzoek worden gekozen. De statistische analyse van de AGD en de tepelretentie moet worden gebaseerd op de gegevens voor afzonderlijke jongen, waarbij rekening wordt gehouden met nesteffecten. Waar passend is het nest de analyse-eenheid. De statistische analyse van lichaamsgewicht van de jongen moet worden gebaseerd op de gegevens voor afzonderlijke jongen, waarbij rekening wordt gehouden met nestgrootte. Vanwege de beperkte omvang van het onderzoek, zijn statistische analyses in de vorm van toetsen voor „significantie” voor veel eindpunten, vooral die in verband met de voortplanting, van beperkte waarde. Sommige van de meest gebruikte methoden, met name parametrische toetsen voor het meten van de centrale tendens, zijn niet geschikt. Als er statistische analyses worden gebruikt, moeten de gekozen methoden geschikt zijn voor de verdeling van de onderzochte variabele en moeten ze vóór de start van het onderzoek worden gekozen.

   Evaluatie van de resultaten

   De resultaten van dit toxiciteitsonderzoek worden beoordeeld aan de hand van de waargenomen effecten en de resultaten van de obductie en het microscopisch onderzoek. De beoordeling omvat het verband tussen de dosis van de teststof en de aanwezigheid of afwezigheid, de frequentie en de ernst van afwijkingen zoals macroscopisch letsel, gespecificeerde doelorganen, onvruchtbaarheid, klinische afwijkingen, aantasting van de reproductie- en nestresultaten, veranderingen in het lichaamsgewicht, effecten op de mortaliteit en andere toxische effecten.

   Vanwege de korte behandelperiode van de mannetjes, moeten bij de beoordeling van effecten op de voortplanting bij mannetjes niet alleen de vruchtbaarheidsgegevens, maar ook de histopathologie van de testes en de epididymides in aanmerking worden genomen. Ook het gebruik van historische controlegegevens over voortplanting/ontwikkeling (bv. voor nestgrootte, AGD, tepelretentie, T4-serumspiegels), indien beschikbaar, kan nuttig zijn ter ondersteuning van de interpretatie van het onderzoek.

   Voor de kwaliteitscontrole wordt voorgesteld historische controlegegevens te verzamelen en variatiecoëfficiënten te berekenen voor numerieke gegevens, met name voor de parameters die verband houden met het opsporen van hormoonontregelaars. Deze gegevens kunnen voor vergelijkingsdoeleinden worden gebruikt wanneer daadwerkelijk uitgevoerd onderzoek wordt geëvalueerd.

   Testverslag

   In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

   • Teststof:

     • bron, partijnummer, uiterste gebruiksdatum, indien beschikbaar;

     • stabiliteit van de teststof, indien bekend.

   • Stof die uit één component bestaat:

     • fysisch voorkomen, oplosbaarheid in water en aanvullende relevante fysisch-chemische eigenschappen;

     • chemische identificatiegegevens, zoals IUPAC- of CAS-naam, CAS-nummer, SMILES- of InChI-code, structuurformule, zuiverheid, chemische identiteit van onzuiverheden, indien van toepassing en praktisch haalbaar enz.

   • Stof die uit meerdere componenten bestaat, UVCB’s en mengsels:

     • voor zover mogelijk, karakterisering aan de hand van chemische identiteit (zie hierboven), kwantitatief voorkomen en relevante fysisch-chemische eigenschappen van de bestanddelen

     .

   • Vehiculum (indien van toepassing):

     • motivering voor de keuze van het vehiculum, indien geen water wordt gebruikt.

   • Proefdieren:

     • gebruikte soort/stam;

     • aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;

     • herkomst, leefomstandigheden, voeding enz.;

     • gewicht van elk dier aan het begin van de test;

     • motivering voor het gebruik van een ander soort dan ratten.

   • Testomstandigheden:

     • achtergrond voor de keuze van de dosisniveaus;

     • gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof, de bereiding van het voer en de bereikte concentratie, stabiliteit en homogeniteit van het preparaat;

     • gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof;

     • omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/drinkwater (in ppm) naar de feitelijke dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing;

     • gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het water;

     • gedetailleerde beschrijving van de randomisatieprocedure voor de selectie van te ruimen jongen, indien van toepassing.

   • Resultaten:

     • lichaamsgewicht en veranderingen in het lichaamsgewicht;

     • waar van toepassing, voedselverbruik en waterverbruik;

     • gegevens over de toxische reactie naar geslacht en dosis, met inbegrip van vruchtbaarheid, dracht en andere gegevens over

     • toxiciteit;

     • duur van de dracht; toxische of andere effecten op de reproductie, de jongen, de postnatale groei enz.;

     • aard, ernst en duur van (al dan niet reversibele) klinische waarnemingen;

     • bepalingen van de sensorische activiteit, grijpkracht en motorische activiteit;

     • uitgevoerde hematologische onderzoeken en de relevante referentiewaarden;

     • uitgevoerde klinisch-biochemische onderzoeken en de relevante referentiewaarden;

     • aantal volwassen vrouwtjes met een normale of abnormale oestruscyclus en cyclusduur van deze vrouwtjes;

     • aantal levend geboren jongen en verliezen na implantatie;

     • aantal jongen met macroscopisch zichtbare afwijkingen; macroscopische beoordeling van de uitwendige geslachtsorganen, aantal ondermaatse jongen;

     • tijdstip van sterfte tijdens het onderzoek en of de dieren overleefden tot het einde van het onderzoek;

     • aantal implantaties, nestgrootte en nestgewichten op het moment van registratie;

     • gegevens over het lichaamsgewicht van jongen;

     • AGD van alle jongen (en lichaamsgewicht op de dag van de AGD-meting);

     • tepelretentie bij mannelijke jongen;

     • schildklierhormoonspiegels bij dag 13-jongen en volwassen mannetjes (en moederdieren en dag 4-jongen indien gemeten);

     • lichaamsgewicht bij het doden van de dieren en gegevens over het gewicht van organen voor de ouderdieren;

     • obductiebevindingen;

     • een gedetailleerde beschrijving van histopathologische bevindingen;

     • resorptiegegevens (indien beschikbaar);

     • een statistische behandeling van de resultaten, indien van toepassing.

   • Bespreking van de resultaten.

   • Conclusies.

   Interpretatie van resultaten

   Op basis van dit onderzoek kan de reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit worden beoordeeld bij de toediening van herhaalde doses. Aangezien de nadruk wordt gelegd op zowel het eindpunt algemene toxiciteit als het eindpunt reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit, kan met de resultaten van het onderzoek in het bijzonder onderscheid worden gemaakt tussen reproductie-/ontwikkelingseffecten die zich voordoen bij afwezigheid van algemene toxiciteit, en reproductie-/ontwikkelingseffecten die alleen tot uitdrukking komen bij niveaus die ook toxisch zijn voor ouderdieren (zie de punten 7-11). Het onderzoek zou een indicatie kunnen geven of verder onderzoek nodig is en zou oriëntatiepunten kunnen bieden voor de opzet van vervolgonderzoeken. OESO-leidraad nr. 43 moet worden geraadpleegd voor hulp bij de interpretatie van resultaten op het gebied van reproductie- en voortplantingstoxiciteit (19). In OESO-leidraad nr. 106 over de histologische beoordeling van endocriene en voortplantingstests bij knaagdieren (16) is informatie te vinden over het prepareren en beoordelen van (endocriene) organen en vaginale uitstrijkjes, die van nut kan zijn voor deze testmethode.

   LITERATUUR

   OESO (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Op aanvraag verkrijgbaar bij de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   OESO (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. Op aanvraag verkrijgbaar bij de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   Mitsumori K., Kodama Y., Uchida O., Takada K., Saito M. Naito K., Tanaka S., Kurokawa Y., Usami, M., Kawashima K., Yasuhara K., Toyoda K., Onodera H., Furukawa F., Takahashi M. and Hayashi Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). J. Toxicol, Sci., 19, 141-149.

   Tanaka S., Kawashima K., Naito K., Usami M., Nakadate M., Imaida K., Takahashi M., Hayashi Y., Kurokawa Y. and Tobe M. (1992). Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test (OECD): Familiarization Using Cyclophosphamide. Fundam. Appl. Toxicol., 18, 89-95.

   OESO (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998. Op aanvraag verkrijgbaar bij de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   OESO (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   OESO (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   Goldman J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M.and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97.

   Sadleir R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (Eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York.

   IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document (No 60).

   Moser V.C., McDaniel K.M. and Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl.Pharmacol., 108, 267-283.

   Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C. and Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233-236.

   Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13, 599-609.

   Gallavan R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Reynolds. (1999). „Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights”, Reproductive Toxicology, 13: 383-390.

   OESO (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   OESO (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 106), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   Hess RA and Moore BJ. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (Eds.). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85.

   Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM. (2002). Fixation of Testes and Eyes Using a Modified Davidson’s Fluid: Comparison with Bouin’s Fluid and Conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.

   OESO (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   OESO (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption (No 150), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   Aanhangsel 1

   DEFINITIES (ZIE OOK (20) OESO-LEIDRAAD 150)

   Androgene werking het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme als een natuurlijk androgeen hormoon (bv. testosteron) te werken.

   Antiandrogene werking het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme de werking van een natuurlijk androgeen hormoon (bv. testosteron) te onderdrukken.

   Antioestrogene werking het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme de werking van een natuurlijk oestrogeen hormoon (bv. 17β-oestradiol) te onderdrukken.

   Antithyreoïde werking het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme de werking van een natuurlijk schildklierhormoon (bv. T3) te onderdrukken.

   Chemische stof een stof of mengsel.

   Dosering een algemene term die de dosis, de frequentie en de duur van de toediening omvat.

   Dosis de toegediende hoeveelheid teststof. De dosis wordt uitgedrukt als gewicht van de teststof per eenheid lichaamsgewicht van het proefdier per dag (bv. mg/kg lichaamsgewicht/dag), of als constante voedingsconcentratie.

   Manifeste toxiciteit een algemene term die duidelijke toxiciteitsverschijnselen beschrijft die optreden na de toediening van de teststof. Deze verschijnselen moeten een beoordeling van de gevaren mogelijk maken en van een zodanige aard zijn dat verwacht mag worden dat bij een hogere toegediende dosis ernstige toxische verschijnselen en waarschijnlijk sterfte optreden.

   Maternale toxiciteit schadelijke effecten bij drachtige vrouwtjes, die hetzij specifiek optreden (direct effect), hetzij niet-specifiek (indirect effect), en die verband houden met de dracht.

   NOAEL afkorting van„no-observed-adverse-effect level”, het niveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld. Dit is het hoogste dosisniveau waarbij nog geen aan de behandeling gebonden nadelige effecten worden vastgesteld.

   Oestrogene werking het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme als een natuurlijk oestrogeen hormoon (bv. 17β-oestradiol) te werken.

   Ontwikkelingstoxiciteit de wijze waarop reproductietoxiciteit zich manifesteert, in de vorm van pre-, peri- en postnatale, structurele of functionele afwijkingen bij nakomelingen.

   Reproductietoxiciteit schadelijke effecten op de nakomelingen en/of verstoring van de voortplantingsfuncties of het voortplantingsvermogen bij mannetjes en vrouwtjes.

   Teststof: elke volgens deze testmethode getest(e) stof of mengsel.

   Thyreoïde werking het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme als een natuurlijk schildklierhormoon (bv. T3) te werken.

   Validering een wetenschappelijke methode die erop gericht is om de operationele vereisten en beperkingen van een testmethode te beschrijven en de betrouwbaarheid en relevantie ervan voor een bepaald doel aan te tonen.

   Verstoring van de vruchtbaarheid afwijkingen in de voortplantingsfuncties of het voortplantingsvermogen bij mannetjes of vrouwtjes.

   Aanhangsel 2

   DIAGRAM VAN DE PROEFOPZET MET DE MAXIMALE ONDERZOEKSDUUR OP BASIS VAN EEN VOLLEDIGE 14-DAAGSE PARINGSPERIODE

   

   

   Aanhangsel 3

   OVERZICHTSTABEL VAN DE EFFECTEN OP REPRODUCTIE/ONTWIKKELING

   WAARNEMINGEN	WAARDEN
   Dosering (eenheden)…….	0 (controle)	…	…	…	…
   Paren bij begin (N)
   Oestruscyclus (ten minste gemiddelde duur en frequentie van onregelmatige cycli)
   Vrouwtjes met aanwijzingen voor copulatie (N)
   Vrouwtjes die drachtig worden (N)
   Dagen conceptie 1 - 5 (N)
   Dagen conceptie 6 -...(1) (N)
   Dracht ≤ 21 dagen (N)
   Dracht = 22 dagen (N)
   Dracht ≥ 23 dagen (N)
   Moederdieren met levend geboren jongen (N)
   Moederdieren met levende jongen op postnatale dag 4 (N)
   Implantaten/moederdier (gemiddeld)
   Levende jongen/moederdier bij geboorte (gemiddeld)
   Levende jongen/moederdier op dag 4 (gemiddeld)
   Geslachtsverhouding (m/v) bij geboorte (gemiddeld)
   Geslachtsverhouding (m/v) op dag 4 (gemiddeld)
   Gewicht van het nest bij geboorte (gemiddeld)
   Gewicht van het nest op dag 4 (gemiddeld)
   Gewicht van de jongen bij geboorte (gemiddeld)
   Gewicht van de jongen op het moment van AGD-meting (gemiddeld bij mannetjes, gemiddeld bij vrouwtjes)
   AGD jongen op dezelfde postnatale dag, geboorte - dag 4 (gemiddeld bij mannetjes, gemiddeld bij vrouwtjes)
   Gewicht van de jongen op dag 4 (gemiddeld)
   Gewicht van de jongen op dag 13 (gemiddeld)
   Tepelretentie bij mannelijke jongen op dag 13 (gemiddeld)
   AFWIJKENDE JONGEN
   Moederdieren met 0
   Moederdieren met 1
   Moederdieren met ≥ 2
   VERLIES VAN NAKOMELINGEN
   Vóór geboorte (implantaties minus levend geborenen)
   Vrouwtjes met 0
   Vrouwtjes met 1
   Vrouwtjes met 2
   Vrouwtjes met ≥ 3
   Na geboorte (levend geboren en minus levende jongen op PND 13)
   Vrouwtjes met 0
   Vrouwtjes met 1
   Vrouwtjes met 2
   Vrouwtjes met ≥ 3

   IN-VITRO HUIDCORROSIE: TESTMETHODE OP BASIS VAN DE MEMBRAANBARRIÈRE

   INLEIDING

   Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 435 (2015) van de OESO. Onder huidcorrosie wordt verstaan: het ontstaan van irreversibele schade aan de huid in de vorm van zichtbare necrose door de epidermis heen in de dermis, na het aanbrengen van een teststof (zoals gedefinieerd door het mondiaal geharmoniseerd classificatie- en etiketteringssysteem voor chemische stoffen (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals, GHS) van de Verenigde Naties (VN) (1) en Verordening (EU) nr. 1272/2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking van stoffen en mengsels (CLP-verordening)⁽⁶⁾). Deze testmethode, die gelijkwaardig is aan de bijgewerkte testrichtlijn 435 van de OESO, bevat een in-vitrotestmethode op basis van de membraanbarrière die kan worden gebruikt om corrosieve chemische stoffen te identificeren. De testmethode maakt gebruik van een kunstmatige membraan die is ontwikkeld om op een vergelijkbare manier op corrosieve chemische stoffen te reageren als dierenhuid in situ.

   De traditionele manier om huidcorrosiviteit te beoordelen is door de teststof op de huid van levende dieren aan te brengen en na een bepaalde tijdsperiode de mate van weefselschade te beoordelen (2). Behalve deze testmethode is er een aantal anderein-vitrotestmethoden vastgesteld als alternatief (3) (4) voor de standaardin-vivoprocedure met konijnenhuid (hoofdstuk B.4 van deze bijlage, gelijkwaardig aan TG 404 van de OESO) die wordt gebruik om corrosieve chemische stoffen te identificeren (2). In de gefaseerde test- en evaluatiestrategie van het VN-GHS voor de beoordeling en classificatie van huidcorrosiviteit en de OESO-leidraad voor een geïntegreerde test- en beoordelingsbenadering (Integrated Approach on Testing and Assessment, IATA) voor huidcorrosie en -irritatie wordt aanbevolen om de gevalideerde en erkende in-vitrotestmethoden uit de modules 3 en 4 te gebruiken (1) (5). De IATA omvat verschillende modules met gedeelde informatiebronnen en analyse-instrumenten en i) biedt richtsnoeren voor de integratie en het gebruik van bestaande gegevens die zijn verzameld met behulp van test- en niet-testmethoden om het potentieel voor huidirritatie en -corrosie van chemische stoffen te beoordelen en ii) draagt een benadering aan voor wanneer verder testen nodig is, onder meer wanneer er negatieve resultaten worden gevonden (5). Volgens deze modulaire aanpak kan een chemische stof op grond van positieve resultaten van in-vitrotestmethoden als corrosief worden ingedeeld, zonder dat er dierproeven nodig zijn, waardoor het gebruik van dieren voor dergelijke proeven wordt verminderd en verfijnd, en pijn en leed waarmee het gebruik van dieren voor dit doel gepaard zou kunnen gaan, worden vermeden.

   Er zijn valideringsstudies afgerond voor het in-vitromembraanbarrièremodel dat in de handel verkrijgbaar is als Corrositex^®(6) (7) (8). Daarin scoorde het een algemene nauwkeurigheid in het voorspellen van huidcorrosiviteit van 79 % (128/163), een gevoeligheid van 85 % (76/89), en een specificiteit van 70 % (52/74) voor een databank van 163 stoffen en mengsels (7). Op basis van deze erkende validiteit wordt deze gevalideerde referentiemethode (VRM) aanbevolen voor gebruik als onderdeel van een gefaseerde teststrategie voor de beoordeling van het mogelijke huidcorrosiegevaar van chemische stoffen (5) (7). Voordat een in-vitromembraanbarrièremodel voor huidcorrosie kan worden gebruikt met het oog op regelgeving, moeten de betrouwbaarheid, relevantie (nauwkeurigheid) en beperkingen ervan voor het voorgestelde gebruik bepaald worden om te waarborgen dat deze vergelijkbaar zijn met die van de VRM (9), overeenkomstig de vooraf vastgestelde prestatienormen (10). De wederzijdse aanvaarding van gegevens in overeenstemming met de OESO-overeenkomst is pas gewaarborgd wanneer een voorgestelde nieuwe of bijgewerkte methode volgens de prestatienormen is geëvalueerd en zijn opgenomen in de gelijkwaardige OESO-testrichtlijn.Op dit moment bestrijken OESO-testrichtlijn 435 en deze testmethode slechts een enkele in-vitromethode: het model Corrositex^®, dat in de handel verkrijgbaar is.

   Andere testmethoden voor het testen op huidcorrosiviteit zijn gebaseerd op het gebruik van gereconstrueerde menselijke huid (OESO-TG 431) (3) en geïsoleerde rattenhuid (OESO TG 430) (4). Deze testrichtlijn voorziet ook in de nadere indeling van corrosieve chemische stoffen in de drie VN-GHS-subcategorieën voor corrosiviteit en de drie VN-verpakkingsgroepen voor vervoer betreffende gevaar van corrosiviteit. Deze testrichtlijn werd oorspronkelijk vastgesteld in 2006 en bijgewerkt in 2015 met verwijzingen naar de IATA-leidraad en met een bijgewerkte lijst van stoffen voor bekwaamheidstoetsing.

   DEFINITIES

   Gebruikte definities worden gegeven in het aanhangsel.

   INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN BEPERKINGEN

   Met de test die in deze testmethode wordt beschreven, kunnen corrosieve teststoffen worden geïdentificeerd en ingedeeld in subcategorieën volgens VN-GHS/CLP (tabel 1). Bovendien kan een dergelijke testmethode worden gebruikt voor het nemen van beslissingen over de corrosieve en niet-corrosieve aard van specifieke klassen van chemische stoffen, bv. organische en anorganische zuren, afgeleide zuren.⁽⁷⁾ en basen ten behoeve van bepaalde vervoerstests (7) (11) (12). In deze testmethode wordt een algemene procedure beschreven die vergelijkbaar is met de gevalideerde referentietestmethode (7). Hoewel deze testmethode geen toereikende informatie over huidirritatie oplevert, moet worden opgemerkt dat TM B.46 (gelijkwaardig aan OESO-TG 439) specifiek betrekking heeft op het gezondheidseffect huidirritatie in vitro (13). Voor een volledige beoordeling van lokale huideffecten na één blootstelling op de huid moet de OESO-leidraad voor een geïntegreerde test- en beoordelingsbenadering (Integrated Approach on Testing and Assessment, IATA) worden geraadpleegd (5).

   Tabel 1

   De VN-GHS-categorie en -subcategorieën voor huidcorrosie⁽¹⁾

   Categorie voor corrosiviteit (categorie 1) (voor autoriteiten die geen subcategorieën gebruiken)	Eventuele subcategorieën voor corrosiviteit(1) (voor autoriteiten die subcategorieën gebruiken, waaronder de CLP-verordening)	Corrosief bij ≥ 1 van de 3 dieren
   		Blootstellingstijd	Waarneming
   Corrosief	Subcategorie voor corrosiviteit 1A	≤ 3 minuten	≤ 1 uur
   	Subcategorie voor corrosiviteit 1B	> 3 minuten / ≤ 1 uur	≤ 14 dagen
   	Subcategorie voor corrosiviteit 1C	> 1 uur / ≤ 4 uur	≤ 14 dagen

   De gevalideerde referentiemethode (7) heeft als beperking dat de test op basis van de resultaten van de voorafgaande compatibiliteitstest (zie punt 13) voor veel niet-corrosieve chemische stoffen en sommige corrosieve chemische stoffen mogelijk niet geschikt is. Voor veel waterige chemische stoffen met een pH in het gebied tussen 4,5 en 8,5 is de test niet geschikt; er zij evenwel opgemerkt dat 85 % van de geteste chemische stoffen in dit pH-bereik in dierproeven niet-corrosief bleken (7). De in-vitromembraanbarrièremethode kan worden gebruikt voor het testen van vaste stoffen (al dan niet oplosbaar in water), vloeistoffen (waterig of niet-waterig) en emulsies. Teststoffen die in de compatibiliteitstest geen merkbare verandering teweegbrachten (d.w.z. kleurverandering in het chemische detectiesysteem (CDS) van de gevalideerde testmethode), kunnen niet met de membraanbarrièremethode worden getest en moeten worden getest met andere testmethoden.

   PRINCIPE VAN DE TEST

   Het testsysteem bestaat uit twee componenten: een synthetische macromoleculaire biobarrière en een chemisch detectiesysteem (CDS); via het CDS detecteert deze testmethode schade aan de membraanbarrière veroorzaakt door corrosieve teststoffen, nadat de teststof op het oppervlak van de synthetische macromoleculaire membraanbarrière is aangebracht (7), schade die waarschijnlijk wordt toegebracht volgens hetzelfde/dezelfde corrosiemechanisme(n) als bij levende huid.

   Er zijn meerdere procedures of CDS’en om de doordringing (of doorbraak) van de membraanbarrière te meten, zoals een verandering in de kleur van een pH-indicator of in een andere eigenschap van de indicatoroplossing onder de barrière.

   Er moet worden vastgesteld dat de membraanbarrière geschikt is, d.w.z. relevant en betrouwbaar, voor het beoogde doel. Daartoe moet men nagaan dat verschillende preparaten consistent zijn wat betreft hun barrière-eigenschappen, bv. dat ze een barrière in stand kunnen houden tegen niet-corrosieve chemische stoffen en dat de corrosieve eigenschappen van chemische stoffen ermee kunnen worden ingedeeld in de verschillende VN-GHS-subcategorieën voor corrosiviteit (1). De toegekende indeling is gebaseerd op de tijd die een chemische stof erover doet om door de membraanbarrière door te dringen tot de indicatoroplossing.

   AANTONING VAN BEKWAAMHEID

   Voordat de in-vitromembraanbarrièremethode routinematig wordt gebruikt op een manier die aan deze testmethode voldoet, moeten laboratoria hun technische bekwaamheid aantonen door een correcte indeling van de twaalf in tabel 2 aanbevolen stoffen voor bekwaamheidstoetsing. Wanneer een stof uit de lijst niet beschikbaar is of indien zulks gerechtvaardigd is, kan een andere stof waarvoor voldoende in-vivo- en in-vitroreferentiegegevens beschikbaar zijn, worden gebruikt (bv. uit de lijst met referentiestoffen (10)), mits dezelfde selectiecriteria als in tabel 1 worden toegepast.

   Tabel 2

   Stoffen voor bekwaamheidstoetsing⁽¹⁾

   Stof(2)	CAS RN	Chemische klasse	In-vivo-VN-GHS-subcategorie(3)	In-vitro-VN-GHS-subcategorie(3)
   Boortrifluoridedihydraat	13319-75-0	Anorganische zuren	1A	1A
   Salpeterzuur	7697-37-2	Anorganische zuren	1A	1A
   Fosforpentachloride	10026-13-8	Precursoren van anorganische zuren	1A	1A
   Valerylchloride	638-29-9	Zuurchloriden	1B	1B
   Natriumhydroxide	1310-73-2	Anorganische basen	1B	1B
   1-(2-Aminoethyl)piperazine	140-31-8	Alifatische aminen	1B	1B
   Benzeensulfonylchloride	98-09-9	Zuurchloriden	1C	1C
   N,N-Dimethylbenzylamine	103-83-3	Anilinen	1C	1C
   Tetraëthyleenpentamine	112-57-2	Alifatische aminen	1C	1C
   Eugenol	97-53-0	Fenolen	NC	NC
   Nonylacrylaat	2664-55-3	Acrylaten/methacrylaten	NC	NC
   Natriumbicarbonaat	144-55-8	Anorganische zouten	NC	NC

   PROCEDURE

   In de volgende punten worden de componenten en procedures beschreven van een testmethode op basis van een kunstmatige membraanbarrière voor het beoordelen van corrosiviteit (7) (15) op basis van de huidige VRM, d.w.z. de in de handel verkrijgbare Corrositex^®. De membraanbarrière en de compatibiliteits-/indicator- en categoriseringsoplossingen kunnen worden opgebouwd, bereid of in de handel worden verkregen zoals in het geval van de VRMCorrositex^®. Er is voor de gevalideerde referentietestmethode een voorbeeld van een testmethodeprotocol beschikbaar (7). De test moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (17-25 °C) en de componenten moeten aan de volgende voorwaarden voldoen.

   Compatibiliteitstest voor de teststof

   Voordat de membraanbarrièretest wordt uitgevoerd moet een compatibiliteitstest worden verricht om te bepalen of de teststof door het CDS gedetecteerd kan worden. Als het CDS de teststof niet detecteert, is de testmethode op basis van de membraanbarrière niet geschikt voor het beoordelen van de mogelijke corrosiviteit van die teststof en moet er een andere testmethode worden gebruikt. Het CdS en de blootstellingsomstandigheden die voor de compatibiliteitstest worden gebruikt, moeten overeenkomen met de blootstelling in de daarop volgende membraanbarrièretest.

   Tijdschaalcategorietest voor de teststof

   Indien van toepassing voor de testmethode moet een teststof die geschikt is bevonden in de compatibiliteitstest, aan een tijdschaalcategorietest worden onderworpen, d.w.z. een screeningtest om onderscheid te maken tussen zwakke en sterke zuren of basen. Zo wordt in de gevalideerde referentietestmethode een tijdschaalcategorietest gebruikt om te bepalen welke van de twee tijdschalen moet worden gebruikt al naargelang een significante zuur- of alkalireserve wordt gedetecteerd. Er moeten twee verschillende doorbraaktijdschalen worden gebruikt voor het vaststellen van corrosiviteit en de VN-GHS-subcategorie voor huidcorrosiviteit, afhankelijk van de zuur- of alkalireserve van de teststof.

   COMPONENTEN VAN DE TESTMETHODE OP BASIS VAN DE MEMBRAANBARRIÈRE

   Membraanbarrière

   De membraanbarrière bestaat uit twee componenten: een proteïneachtige, macromoleculaire, waterige gel en een permeabele dragermembraan. De proteïneachtige gel moet ondoordringbaar zijn voor vloeistoffen en vaste stoffen, maar kan gecorrodeerd en permeabel gemaakt worden. De volledig opgebouwde membraanbarrière moet worden bewaard onder van tevoren vastgestelde omstandigheden waarvan is uitgewezen dat de gel niet achteruitgaat, bv. door uitdrogen, groei van micro-organismen, verschuiven of barsten, wat ten koste zou gaan van de prestaties. De uiterste bewaartermijn moet worden vastgesteld en de membraanbarrièrepreparaten mogen na het verstrijken van die termijn niet meer worden gebruikt.

   De permeabele dragermembraan levert mechanische ondersteuning aan de proteïneachtige gel gedurende het geleerproces en de blootstelling aan de teststof. De dragermembraan moet doorzakken en verschuiven van de gel voorkomen en moet goed doorlatend zijn voor alle teststoffen.

   De proteïneachtige gel, die bestaat uit proteïnen, bv. keratine, collageen of proteïnemengsels, die een gelmatrix vormen, dient als doelwit voor de teststof. Het proteïneachtige materiaal wordt op het oppervlak van de dragermembraan aangebracht en als het gegeleerd is, wordt de membraanbarrière over de indicatoroplossing geplaatst. De proteïneachtige gel moet een egale dikte en dichtheid hebben, zonder luchtbellen of gebreken die de functionele integriteit ervan zouden kunnen aantasten.

   Chemisch detectiesysteem (CDS)

   De indicatoroplossing, dezelfde oplossing als voor de compatibiliteitstest, moet reageren op de aanwezigheid van de teststof. Er moet een pH-indicator of een combinatie van indicatoren worden gebruikt,bv. cresolrood en methyloranje, die een kleurverandering laten zien in aanwezigheid van de teststof. Het meetsysteem kan zowel visueel of elektronisch zijn.

   De detectiesystemen die worden ontwikkeld om te detecteren dat de teststof de barrièremembraan is gepasseerd, moeten worden beoordeeld op relevantie en betrouwbaarheid om de verzameling chemische stoffen die kan worden gedetecteerd, en de kwantitatieve detectiegrenzen aan te tonen.

   TESTPRESTATIE

   Opbouw van de componenten van de testmethode

   De membraanbarrière wordt zodanig in een fles (of buis) met indicatoroplossing geplaatst dat de dragermembraan volledig in contact staat met de indicatoroplossing en er geen luchtbellen aanwezig zijn. Er moet zorgvuldig op worden toegezien dat de barrière volledig intact blijft.

   Het aanbrengen van de teststof

   Er wordt een passende hoeveelheid van de teststof, bv. 500 μl van een vloeistof of 500 mg van een fijn verpulverde vaste stof (7), in een egale laag over het oppervlak van de membraanbarrière aangebracht. Voor elke teststof worden een passend aantal duplo’s, bv. vier (7), en de bijbehorende controles opgezet (zie de punten 23 tot en met 25). De tijd van het aanbrengen van de teststof op de membraanbarrière wordt geregistreerd. Om te waarborgen dat korte corrosietijden nauwkeurig worden geregistreerd, worden de aanbrengtijden van de teststof in de duploflessen gespreid.

   Meting van de doordringing door de membraanbarrière

   Elke fles wordt zorgvuldig in de gaten gehouden, de tijd van de eerste verandering in de indicatoroplossing, d.w.z. doordringing van de barrière, wordt geregistreerd en de tijd die is verstreken tussen het aanbrengen van de teststof en het doordringen door de membraanbarrière wordt bepaald.

   Controles

   In tests waarbij gebruikgemaakt wordt van een vehiculum of oplosmiddel met de teststof, moet het vehiculum of oplosmiddel compatibel zijn met het membraanbarrièresysteem, d.w.z. het membraanbarrièresysteem intact laten, en mag het de corrosiviteit van de teststof niet veranderen. Indien van toepassing moet er tegelijkertijd met de teststof een oplosmiddelcontrole (of vehiculumcontrole) worden getest om de compatibiliteit van het oplosmiddel/vehiculum met het membraanbarrièresysteem aan te tonen.

   Om te beoordelen of het testsysteem op aanvaardbare wijze presteert moet er tegelijkertijd met de teststof ook een positieve (corrosieve) controle met matig corrosieve activiteit, bv. 110 ± 15 mg natriumhydroxide (VN-GHS-subcategorie voor corrosiviteit 1B) (7) worden getest. Een tweede positieve controle van dezelfde chemische klasse als de teststof kan nuttig zijn voor het beoordelen van de relatieve corrosiviteit van een corrosieve teststof. De gekozen positieve controle(s) moet(en) matig corrosief zijn (bv. VN-GHS-subcategorie voor corrosiviteit 1B) om veranderingen in de doordringingstijd te kunnen detecteren die mogelijk onaanvaardbaar veel langer of korter zijn dan de vastgestelde referentiewaarde, waaruit blijkt dat het testsysteem niet naar behoren werkt. Voor dit doel zijn extreem corrosieve (VN-GHS-subcategorie voor corrosiviteit 1A) of niet-corrosieve chemische stoffen van beperkt nut. Met een corrosieve VN-GHS-subcategorie 1B-stof kan een te snelle of te langzame doorbraaktijd wel gedetecteerd worden. Er kan een zwak corrosieve stof (VN-GHS-subcategorie voor corrosiviteit 1C) als positieve controle worden gebruikt om te meten in hoeverre de testmethode zwak corrosieve stoffen consistent kan onderscheiden van niet-corrosieve stoffen. Ongeacht de gevolgde aanpak moet er een aanvaardbaar responsbereik voor de positieve controle(s) worden vastgesteld op basis van het historische bereik van doorbraaktijden voor de gebruikte positieve controle(s), zoals het gemiddelde ±2-3 standaarddeviaties. In elk onderzoek moet de precieze doorbraaktijd voor de positieve controle worden bepaald, zodat afwijkingen buiten het aanvaardbare bereik gedetecteerd kunnen worden.

   Als verdere kwaliteitscontrolemaatregel om de functionele integriteit van de membraanbarrière aan te tonen moet er tegelijkertijd met de teststof ook een negatieve (niet-corrosieve) controle, bv. 10 % citroenzuur, 6 % propionzuur (7), worden getest.

   Aanvaardbaarheidscriteria voor het onderzoek

   Volgens de vastgestelde tijdsparameters voor elk van de VN-GHS-subcategorieën voor corrosiviteit, moet de tijd (in minuten) die is verstreken tussen het aanbrengen van de teststof op de membraanbarrière en het doordringen door de barrière worden gebruikt om de corrosiviteit van de teststof te voorspellen. Een onderzoek wordt alleen als aanvaardbaar beschouwd als de gelijktijdige positieve controle de verwachte responstijd voor doordringing (bv. een doorbraaktijd van 8-16 minuten voor natriumhydroxide indien gebruikt als positieve controle) oplevert, de gelijktijdige negatieve controle niet corrosief is en de gelijktijdige oplosmiddelcontrole, indien in het onderzoek opgenomen, niet corrosief is en evenmin de corrosiviteit van de teststof beïnvloedt. Voordat zij een methode routinematig gebruiken op een manier die aan deze testmethode voldoet, moeten laboratoria hun technische bekwaamheid aantonen aan de hand van de twaalf stoffen die in tabel 2 worden aanbevolen. Voordat nieuwe soortgelijke „me too”-methoden die worden ontwikkeld op basis van deze testmethode en die structureel en functioneel vergelijkbaar zijn met de gevalideerde referentiemethode (14) worden gebruikt met het oog op regelgeving, moeten de vooraf vastgestelde prestatienormen worden gebruikt om de betrouwbaarheid en nauwkeurigheid van de nieuwe methode aan te tonen (10).

   Interpretatie van resultaten en indeling van de teststoffen

   De tijd (in minuten) die is verstreken tussen het aanbrengen van de teststof op de membraanbarrière en het doordringen door de barrière wordt gebruikt om de teststof in te delen in een van de VN-GHS-subcategorieën voor corrosie (1) en, indien van toepassing, een VN-verpakkingsgroep (16). Voor elke voorgestelde testmethode worden de drempeltijden vastgesteld, die als scheiding fungeren tussen elk van de drie subcategorieën voor corrosie. Bij de uiteindelijke beslissing over de drempeltijden moet de noodzaak om onderclassificatie van het corrosiegevaar (d.w.z. vals-negatieve uitkomsten) te voorkomen, in aanmerking worden genomen. In deze testrichtlijn moeten de drempeltijden voor Corrositex^®zoals beschreven in tabel 3 worden gebruikt, omdat dit vooralsnog de enige testmethode is die onder deze testrichtlijn valt (7).

   Tabel 3

   Corrositex^®-voorspellingsmodel

   Gemiddelde doorbraaktijd (minuten)		VN-GHS-prognose(3)
   Categorie 1-teststoffen(1) (bepaald door de categorietest van de methode)	Categorie 2-teststoffen(2) (bepaald door de categorietest van de methode)
   0-3 min.	0-3 min.	Corrosief optionele subcategorie 1A
   > 3 tot 60 min.	> 3 tot 30 min.	Corrosief optionele subcategorie 1B
   > 60 tot 240 min.	> 30 tot 60 min.	Corrosief optionele subcategorie 1C
   > 240 min.	> 60 min.	Niet-corrosief

   GEGEVENS EN RAPPORTAGE

   Gegevens

   Voor de teststof en de positieve controle(s) moet de tijd (in minuten) die verstrijkt tussen het aanbrengen en het doordringen door de barrière, in tabelvorm worden gerapporteerd, zowel de afzonderlijke gegevens per duplo als het gemiddelde ± de standaarddeviatie voor elke bepaling.

   Testverslag

   In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

   • Teststof en controlestoffen:

     • stof die uit één component bestaat: chemische identificatiegegevens, zoals IUPAC- of CAS-naam, CAS-nummer, SMILES- of InChI-code, structuurformule, zuiverheid, chemische identiteit van onzuiverheden, indien van toepassing en praktisch haalbaar enz.;

     • stof die uit meerdere componenten bestaat, UVCB en mengsel: voor zover mogelijk, karakterisering aan de hand van chemische identiteit (zie hierboven), kwantitatief voorkomen en relevante fysisch-chemische eigenschappen van de bestanddelen;

     • fysisch voorkomen, oplosbaarheid in water en aanvullende relevante fysisch-chemische eigenschappen;

     • bron, partijnummer indien beschikbaar;

     • behandeling van de teststof/controlestof voorafgaand aan het testen, indien van toepassing (bv. opwarming, malen);

     • stabiliteit van de teststof, uiterste gebruiksdatum, of datum voor heranalyse, indien bekend;

     • bewaaromstandigheden.

   • Vehiculum:

     • identificatiegegevens, de concentratie (indien van toepassing) en het gebruikte volume;

     • een motivering voor de keuze van het vehiculum.

   • In-vitromodel op basis van de membraanbarrière en toegepast protocol, waaronder de aangetoonde nauwkeurigheid en betrouwbaarheid

   • Testomstandigheden:

     • beschrijving van de gebruikte apparatuur en voorbereidingsprocedures;

     • herkomst en samenstelling van de gebruikte in-vitromembraanbarrière;

     • samenstelling en eigenschappen van de indicatoroplossing;

     • detectiemethode;

     • hoeveelheden van teststof en controlestoffen;

     • aantal duplo’s;

     • een beschrijving en rechtvaardiging van de tijdschaalcategorietest;

     • opbrengmethode;

     • waarnemingstijden;

     • een beschrijving van de toegepaste beoordelings- en indelingscriteria;

     • aantoning van bekwaamheid in de toepassing van de testmethode voorafgaand aan routinematig gebruik door middel van het testen van de chemische stoffen voor bekwaamheidstoetsing.

   • Resultaten:

     • een tabel met afzonderlijke ruwe gegevens van afzonderlijke test- en controlemonsters voor elke duplo;

     • beschrijvingen van andere waargenomen effecten;

     • de afgeleide indeling met vermelding van het gebruikte voorspellingsmodel/de gehanteerde beslissingscriteria.

   Bespreking van de resultaten

   Conclusies

   LITERATUUR

   1. Verenigde Naties (VN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fifth Revised Edition, VN New York en Genève, 2013. Beschikbaar op: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.

   2. Hoofdstuk B.4 van deze bijlage, Acute huidirritatie/corrosie.

   3. Hoofdstuk B.40 bis van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie: testmethode met gereconstrueerde humane epidermis (RhE).

   4. Hoofdstuk B.40 van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie: transcutane elektrische weerstand (TEW).

   5. OESO (2015). Guidance document on an Integrated Approach on Testing and Assessment (IATA) for Skin Corrosion and Irritation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 203). Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   6. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.-G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxicology In Vitro 12, 483-524.

   7. ICCVAM (1999). Corrositex^®. An In Vitro Test Method for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by ICCVAM, NTP and NICEATM. NIEHS, NIH Publication (No 99-4495.)

   8. Gordon V.C., Harvell J.D. and Maibach H.I. (1994). Dermal Corrosion, the Corrositex^® System: A DOT Accepted Method to Predict Corrosivity Potential of Test Materials. In vitro Skin Toxicology-Irritation, Phototoxicity, Sensitization. Alternative Methods in Toxicology 10, 37-45.

   9. OESO (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Series on Testing and Assessment, no. Series on Testing and Assessment (No 34).

   10. OESO (2014). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 435. Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/PerfStand-TG430-June14.pdf.

   11. CEVMA (2001). Statement on the Application of the CORROSITEX® Assay for Skin Corrosivity Testing. 15e vergadering van het raadgevend wetenschappelijk comité van het Europees Centrum voor de validatie van alternatieve methoden (ESAC), Ispra, Italië. ATLA 29, 96-97.

   12. U.S. DOT (2002). Exemption DOT-E-10904 (Fifth Revision). (September 20, 2002). Washington, D.C., U.S. DOT.

   13. Hoofdstuk B.46 van deze bijlage, In-vitrohuidirritatie: testmethode met gereconstrueerde humane epidermis. ICCVAM (2004). ICCVAM Recommended Performance Standards for In Vitro Test Methods for Skin Corrosion. NIEHS, NIH Publication No 04-4510. Beschikbaar op: http://www.ntp.niehs.nih.gov/iccvam/docs/dermal_docs/ps/ps044510.pdf.

   14. U.S. EPA (1996). Method 1120, Dermal Corrosion. Beschikbaar op: http://www.epa.gov/osw/hazard/testmethods/sw846/pdfs/1120.pdf.

   15. Verenigde Naties (VN) (2013). UN Recommendations on the Transport of Dangerous Goods (aanbevelingen van de VN inzake het vervoer van gevaarlijke goederen), modelreglementen, 18e herziene editie (Deel, Hoofdstuk 2.8), Verenigde Naties, 2013. Beschikbaar op: http://www.unece.org/fileadmin/DAM/trans/danger/publi/unrec/rev18/English/Rev18_Volume1_Part2.pdf.

   Aanhangsel

   DEFINITIES

   Betrouwbaarheid :
   indicatie van de mate waarin een testmethode, uitgevoerd volgens een vast protocol, op reproduceerbare wijze binnen één laboratorium en tussen laboratoria verspreid over de tijd kan worden uitgevoerd. De betrouwbaarheid wordt beoordeeld door berekening van intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid (9).
   Chemisch detectiesysteem (CDS) :
   een visueel of elektronisch meetsysteem met een indicatoroplossing die reageert op de aanwezigheid van een teststof,bv. door een verandering in een pH-indicator of een combinatie van indicatoren, die een kleurverandering laten zien in aanwezigheid van de teststof, of door andere typen chemische of elektrochemische reacties.
   Chemische stof :
   een stof of een mengsel.
   Concordantie :
   dit is een maat voor de prestaties van de testmethode voor testmethoden die een categoriale uitkomst geven en het is één aspect van relevantie. Deze term en de term „nauwkeurigheid” worden soms door elkaar gebruikt; de term wordt gedefinieerd als het percentage van alle geteste chemische stoffen die correct als positief of negatief worden geclassificeerd. De concordantie is sterk afhankelijk van de prevalentie van positieven in de typen teststoffen die worden onderzocht (9).
   Gevoeligheid :
   het percentage van alle positieve/actieve chemische stoffen dat door middel van de testmethode correct wordt ingedeeld. Dit is een maat voor de nauwkeurigheid van een testmethode die categoriale resultaten oplevert en is een belangrijke factor voor de beoordeling van de relevantie van een testmethode (9).
   GHS (mondiaal geharmoniseerd classificatie- en etiketteringssysteem voor chemische stoffen) :
   een systeem voor de indeling van chemische stoffen (stoffen en mengsels) op basis van gestandaardiseerde soorten en niveaus van gevaren van fysische aard en gevaren voor de gezondheid en het milieu, en dat de desbetreffende voorlichtingselementen bepaalt, zoals pictogrammen, signaalwoorden, gevarenaanduidingen, voorzorgsmaatregelen en veiligheidsinformatiebladen, waarmee informatie over de schadelijke effecten van de stoffen kenbaar wordt gemaakt teneinde mensen (waaronder werkgevers, werknemers, transporteurs, consumenten en spoedhulpverleners) en het milieu te beschermen (1).
   Huidcorrosiein vivo :
   het ontstaan van een irreversibele beschadiging van de huid, namelijk zichtbare necrose door deepidermis heen in de dermis, na het aanbrengen van een teststof gedurende ten hoogste vier uur. Corrosie-reacties worden gekenmerkt door zweren, bloedingen, bloedkorsten en, tegen het eind van de observatieperiode van 14 dagen, ontkleuring door bleking van de huid, gebieden met volledige haaruitval en littekens. Om twijfelachtig letsel te evalueren moet histopathologie worden overwogen.
   IATA :
   Integrated Approach on Testing and Assessment (geïntegreerde test- en beoordelingsbenadering).
   Mengsel :
   een mengsel of oplossing bestaande uit twee of meer stoffen.
   Nauwkeurigheid :
   de mate van overeenstemming tussen resultaten verkregen met de testmethode en erkende referentiewaarden. Dit is een maat voor de prestaties van de testmethode en één aspect van relevantie. Deze term en de term „concordantie”, waaronder het percentage correcte uitkomsten van een testmethode wordt verstaan, worden vaak door elkaar gebruikt (9).
   NC :
   niet-corrosief.
   Prestatienormen :
   normen, gebaseerd op een gevalideerde testmethode, die de basis vormen voor de beoordeling van de vergelijkbaarheid van een voorgestelde, in mechanistisch en functioneel opzicht gelijksoortige testmethode. Hieronder begrepen zijn: i) essentiële componenten van de testmethode; ii) een minimumlijst van referentiestoffen die zijn gekozen uit de stoffen die zijn gebruikt om de aanvaardbare prestaties van de gevalideerde testmethode aan te tonen, en iii) de soortgelijke betrouwbaarheids- en nauwkeurigheidsniveaus die door de voorgestelde testmethode moeten worden gehaald wanneer ze worden beoordeeld aan de hand van de minimumlijst van referentiestoffen; deze waarden zijn gebaseerd op de waarden die voor de gevalideerde testmethode zijn verkregen (9).
   Relevantie :
   beschrijving van het verband van de testmethode met het te onderzoeken effect en of de test betekenis heeft en nuttig is voor een bepaald doel. Het is de mate waarin de testmethode het te onderzoeken biologische effect correct meet of voorspelt. Relevantie omvat een beoordeling van de nauwkeurigheid (concordantie) van een testmethode (9).
   Specificiteit :
   het percentage van alle negatieve/niet-actieve chemische stoffen dat door middel van de testmethode correct wordt ingedeeld. Dit is een maat voor de nauwkeurigheid van een testmethode die categoriale resultaten oplevert en is een belangrijke factor voor de beoordeling van de relevantie van een testmethode (9).
   Stof :
   een chemisch element en de verbindingen ervan, zoals zij voorkomen in natuurlijke toestand of bij de productie ontstaan, met inbegrip van alle additieven die nodig zijn voor het behoud van de stabiliteit ervan en alle onzuiverheden ten gevolge van het toegepaste procedé, doch met uitzondering van elk oplosmiddel dat kan worden afgescheiden zonder aantasting van de stabiliteit van de stof of wijziging van de samenstelling ervan.
   Stof die uit één component bestaat :
   een stof die wordt gekenmerkt door haar kwantitatieve samenstelling en waarin een hoofdcomponent aanwezig is in een concentratie van ten minste 80 % (w/w).
   Stof die uit meerdere componenten bestaat :
   een stof die wordt gekenmerkt door haar kwantitatieve samenstelling en waarin meer dan één hoofdcomponent aanwezig is in een concentratie van ≥ 10 % (w/w) en < 80 % (w/w). Een stof die uit meerdere componenten bestaat, is het resultaat van een fabricageproces. Het verschil tussen mengsels en stoffen die uit meerdere componenten bestaan, is dat mengsels worden verkregen door twee of meer stoffen zonder chemische reactie met elkaar te vermengen. Een stof die uit meerdere componenten bestaat, is het resultaat van een chemische reactie.
   Teststof :
   alle volgens deze testmethode geteste stoffen of mengsels.
   UVCB :
   stoffen met een onbekende of variabele samenstelling, complexe reactieproducten en biologische materialen.

   IN-VITRO BEPALINGEN OP BASIS VAN STABIELE TRANSFECTIE EN TRANSACTIVATIE VOOR HET OPSPOREN VAN OESTROGEENRECEPTORAGONISTEN EN -ANTAGONISTEN

   ALGEMENE INLEIDING

   Op prestaties gebaseerde testrichtlijn van de OESO

   Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 455 (2016) van de OESO. TG 455 is een op prestaties gebaseerde testrichtlijn (performance-based test guideline, PBTG), waarin de methodologie wordt beschreven van in-vitrobepalingen op basis van stabiele transfectie en transactivatie voor het opsporen van oestrogeenreceptoragonisten en -antagonisten (estrogen receptor transactivation assays, ER TA-bepalingen). De PBTG omvat verschillende, in mechanistisch en functioneel opzicht gelijksoortige testmethoden voor het identificeren van agonisten en antagonisten van de oestrogeenreceptor (ERα, en/of ERβ) en moet de ontwikkeling bevorderen van nieuwe gelijksoortige of gewijzigde testmethoden die overeenstemmen met de valideringsbeginselen beschreven in de OESO-leidraad voor de validering en internationale aanvaarding van nieuwe of bijgewerkte testmethoden voor gevarenbeoordeling (Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment) (1) De volledig gevalideerde referentietestmethoden (aanhangsels 2 en 3) die de basis vormen voor deze PBTG zijn:

   • de bepaling op basis van stabiele transfectie en transactivatie (STTA-bepaling) (2) die gebruikmaakt van de cellijn (h) ERα-HeLa-9903, en

   • de VM7Luc-ER TA-bepaling (3) waarbij gebruikgemaakt wordt van de cellijn VM7Luc4E2⁽⁸⁾, een cellijn die voornamelijk hERα tot expressie brengt met enige bijdrage van hERβ (4) (5).

   Voor de ontwikkeling en validering van gelijksoortige bepalingen voor hetzelfde gevareneindpunt zijn prestatienormen (6) (7) beschikbaar en moeten deze worden gebruikt. Ze zorgen dat PBTG 455 snel gewijzigd kan worden, zodat nieuwe gelijksoortige bepalingen aan een bijgewerkte PBTG kunnen worden toegevoegd. Gelijksoortige bepalingen zullen evenwel pas worden toegevoegd nadat de OESO ze heeft beoordeeld en onderschrijft dat aan de prestatienormen wordt voldaan. De in TG 455 opgenomen bepalingen kunnen zonder onderscheid worden gebruikt om te voldoen aan de eisen die aan OESO-landen worden gesteld wat betreft de testresultaten voor transactivatie van de oestrogeenreceptor, en in aanmerking te komen voor wederzijdse aanvaarding van gegevens in overeenstemming met de OESO-overeenkomst.

   Achtergrond en beginselen van de bepalingen die in deze testmethode worden beschreven

   In 1998 is de OESO met hoge prioriteit een actie gestart om bestaande testrichtlijnen te herzien en nieuwe testrichtlijnen te ontwikkelen voor het screenen en testen op potentiële hormoonontregelaars. Het conceptueel kader van de OESO voor het testen en beoordelen van hormoonontregelende stoffen werd in 2012 herzien. Het oorspronkelijke en het herziene conceptueel kader zijn als bijlagen opgenomen bij de OESO-leidraad voor gestandaardiseerde testrichtlijnen voor de beoordeling van chemische stoffen op hormoonontregeling (Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption) (8). Het conceptueel kader omvat vijf niveaus, die elk overeenkomen met een ander niveau van biologische complexiteit. De in deze testmethode beschreven ER TA-bepalingen zijn ingedeeld op niveau 2: „in-vitrobepalingen die gegevens moeten opleveren over (een) geselecteerde endocriene mechanisme(n)/weg(en)”. Dit is een testmethode voor in-vitrobepalingen op basis van transactivatie (TA), die zijn ontworpen om agonisten en antagonisten van de oestrogeenreceptor (ER) te identificeren.

   De interactie van oestrogenen met ER’s kan de transcriptie van oestrogeengestuurde genen beïnvloeden, wat kan leiden tot de inductie of remming van processen in de cel, waaronder de processen die nodig zijn voor celproliferatie, de normale ontwikkeling van de foetus en de voortplantingsfunctie (9) (10) (11). Verstoring van de normale oestrogene systemen zou kunnen leiden tot schadelijke effecten op de normale ontwikkeling (ontogenese), de reproductieve gezondheid en de integriteit van het voortplantingsstelsel.

   In-vitro-TA-bepalingen zijn gebaseerd op een directe of indirecte interactie van de stoffen met een specifieke receptor die de transcriptie van een reportergenproduct reguleert. Dergelijke bepalingen zijn veel gebruikt voor de beoordeling van de genexpressie die wordt gereguleerd door specifieke kernreceptoren zoals ER’s (12) (13) (14) (15) (16). Ze zijn voorgesteld voor het opsporen van door de ER gereguleerde oestrogene transactivatie (17) (18) (19). Er zijn ten minste twee belangrijke subtypen kern-ER’s, α en β, die door afzonderlijke genen gecodeerd worden. De bijbehorende eiwitten hebben elk hun eigen biologische functies en verschillende weefseldistributies en bindingsaffiniteiten voor liganden (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26). De kern-ERα medieert de klassieke oestrogeenrespons (27) (28) (29) (30) en daarom zijn de meeste modellen die op dit moment worden ontwikkeld voor het meten van ER-activatie of -remming, specifiek voor ERα. De bepalingen worden gebruikt voor het identificeren van chemische stoffen die de ER activeren (of remmen) na binding van een ligand. Het receptor-ligand-complex bindt vervolgens aan specifieke DNA-responselementen en transactiveert een reportergen, wat leidt tot een verhoogde cellulaire expressie van een markereiwit. Er kunnen in deze bepalingen verschillende reporterresponsen worden gebruikt. In op luciferase gebaseerde systemen zet het enzym luciferase het substraat luciferine om in een bioluminescent product dat kwantitatief bepaald kan worden met een luminometer. Andere voorbeelden van veel gebruikte reporters zijn fluorescent proteïne en het gen LacZ, dat codeert voor β-galactosidase, een enzym dat het kleurloze substraat X-gal (5- broom-4-chloor-indolyl-galactopyranoside) kan omzetten in een blauw product dat kwantitatief bepaald kan worden met een spectrofotometer. Deze reporters kunnen snel en goedkoop worden bepaald met behulp van in de handel verkrijgbare testkits.

   De relevantie en de betrouwbaarheid van de STTA-bepaling en de VM7Luc TA-bepaling voor het beoogde doel zijn aangetoond in de valideringsstudies voor deze bepalingen (3) (4) (5) (30). Prestatienormen voor op luminescentie gebaseerde ER TA-bepalingen met borstcellijnen zijn opgenomen in het evaluatieverslag „ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (VM7Luc-ER TA) Test Method: An In Vitro Assay for Identifying Human Estrogen Receptor Agonist and Antagonist Activity of Chemicals” (3). Deze prestatienormen zijn aangepast om te kunnen worden toegepast voor zowel de STTA-bepaling als de bepaling met VM7Luc (2).

   De in deze testmethode gebruikte definities en afkortingen staan in aanhangsel 1.

   Toepassingsgebied en beperkingen voor de TA-bepalingen

   Deze bepalingen worden aangereikt ten behoeve van screening en prioritering, maar kunnen ook mechanistische informatie verschaffen die kan worden gebruikt in een benadering met meervoudige bewijsvoering („weight of evidence”-benadering). De tests berusten op de transactivatie die wordt geïnduceerd door chemische binding aan de ER’s in een in-vitrosysteem. De resultaten mogen dan ook niet rechtstreeks geëxtrapoleerd worden naar de complexe signalering en regulering van het intacte endocriene systeem in vivo.

   Door de ER’s gemedieerde transactivatie wordt beschouwd als een van de voornaamste mechanismen voor hormoonontregeling, hoewel er ook andere mechanismen zijn waardoor hormoonontregeling kan optreden, waaronder i) interacties met andere receptoren en enzymsystemen in het endocriene systeem, ii) hormoonsynthese, iii) metabole activering en/of inactivering van hormonen, iv) verdeling van hormonen naar doelweefsels, en v) klaring van hormonen uit het lichaam. In geen van de bepalingen die onder deze testmethode vallen, worden deze werkingsmechanismen in aanmerking genomen.

   Deze testmethode richt zich op het vermogen van chemische stoffen om van de ER afhankelijke transcriptie te activeren (d.w.z. als een agonist op te treden) en ook te onderdrukken (d.w.z. als een antagonist op te treden). Sommige chemische stoffen kunnen, afhankelijk van het gebruikte celtype, zowel agonistische als antagonistische activiteit vertonen en staan bekend als selectieve oestrogeenreceptormodulatoren (SERM’s). Overwogen kan worden om chemische stoffen met een negatieve respons in deze bepalingen aan een ER-bindingsbepaling te onderwerpen, alvorens te concluderen dat de chemische stof niet aan de receptor bindt. Bovendien geven de bepalingen slechts een waarschijnlijke indicatie over de activiteit van de uitgangsstof, rekening houdend met het beperkte metabole vermogen van de in-vitrocelsystemen. Aangezien bij de validering alleen zuivere stoffen zijn gebruikt, zijn er geen gegevens over de toepasbaarheid voor testmengsels. In theorie is de testmethode echter wel toepasbaar voor het testen van stoffen die uit meerdere componenten bestaan, UVCB’s en van mengsels. Voordat de testmethode wordt gebruikt op een stof die uit meerdere componenten bestaat, UVCB of mengsel om gegevens te genereren voor een beoogd regelgevingsdoel, moet worden nagegaan of, en zo ja, waarom deze methode betrouwbare resultaten oplevert voor dat doel. Zulke overwegingen zijn niet nodig wanneer het testen van het mengsel wettelijk vereist is.

   Ter informatie worden in tabel 1 de resultaten van agonismetests weergegeven voor de 34 stoffen die zijn getest in de beide volledig gevalideerde referentietestmethoden die in deze testmethode worden beschreven. Op basis van de gepubliceerde verslagen, waaronder in-vitrobepalingen voor ER-binding en TA en/of de uterotrofe test, zijn 26 van deze stoffen ingedeeld als definitieve ER-agonisten en 8 als negatief (2) (3) (18) (31) (32) (33) (34). In tabel 2 worden de resultaten van antagonismetests weergegeven voor de 15 stoffen die zijn getest in de beide volledig gevalideerde referentietestmethoden die in deze testmethode worden beschreven. Op basis van de gepubliceerde verslagen, waaronder in-vitrobepalingen voor ER-binding en TA, zijn 4 van deze stoffen ingedeeld als definitieve/waarschijnlijke ER-antagonisten en 10 als negatief (2) (3) (18) (31). Wat betreft de gegevens die zijn weergegeven in tabel 1 en tabel 2 was er 100 % overeenstemming tussen de beide referentietestmethoden over de indeling van alle stoffen, behalve voor één stof (Mifepriston) voor de antagonismebepaling, en elke stof werd correct ingedeeld als ER-(ant)agonist of negatief. Nadere informatie over deze groep chemische stoffen en over de aanvullende chemische stoffen die tijdens de valideringsstudies voor de STTA-bepaling en de VM7Luc-ER TA-bepaling getest zijn, is te vinden in de prestatienormen voor de ER TA (6) (7), aanhangsel 2 (tabellen 1, 2 en 3).

   Tabel 1

   Overzicht van de resultaten van de STTA-bepaling en de VM7Luc-ER TA-bepaling voor stoffen die aan beide agonismebepalingen zijn onderworpen en zijn ingedeeld als ER-agonisten (POS) of negatief (NEG)

   	Stof	CAS RN	STTA-bepaling(4)			VM7Luc-ER TA-bepaling(5)		Bron van gegevens voor indeling(7)
   			ER TA -activiteit	PC10-waarde (M)	PC50-waarde(2) (M)	ER TA-activiteit	EC50-waarde(2),(6) (M)	Andere ER TA-tests(3)	ER Bindmiddel	Uterotroof
   1	17β-Oestradiol(1)	50-28-2	POS	< 1,00 × 10-11	< 1,00 × 10-11	POS	5,63 × 10-12	POS (227/227)	POS	POS
   2	17α-Oestradiol(1)	57-91-0	POS	7,24 × 10-11	6,44 × 10-10	POS	1,40 × 10-9	POS (11/11)	POS	POS
   3	17α-Ethinyloestradiol(1)	57-63-6	POS	< 1,00 × 10-11	< 1,00 × 10-11	POS	7,31 × 10-12	POS (22/22)	POS	POS
   4	17β-Trenbolon	10161-33-8	POS	1,78 × 10-8	2,73 × 10-7	POS	4,20 × 10-8	POS (2/2)	NT	NT
   5	19-Nortestosteron(1)	434-22-0	POS	9,64 × 10-9	2,71 × 10-7	POS	1,80 × 10-6	POS (4/4)	POS	POS
   6	4-Cumylfenol(1)	599-64-4	POS	1,49 × 10-7	1,60 × 10-6	POS	3,20 × 10-7	POS (5/5)	POS	NT
   7	4-tert-Octylfenol(1)	140-66-9	POS	1,85 × 10-9	7,37 × 10-8	POS	3,19 × 10-8	POS (21/24)	POS	POS
   8	Apigenine(1)	520-36-5	POS	1,31 × 10-7	5,71 × 10-7	POS	1,60 × 10-6	POS (26/26)	POS	NT
   9	Atrazine(1)	1912-24-9	NEG	—	—	NEG	—	NEG (30/30)	NEG	NT
   10	Bisfenol A(1)	80-05-7	POS	2,02 × 10-8	2,94 × 10-7	POS	5,33 × 10-7	POS (65/65)	POS	POS
   11	Bisfenol B(1)	77-40-7	POS	2,36 × 10-8	2,11 × 10-7	POS	1,95 × 10-7	POS (6/6)	POS	POS
   12	Butylbenzylftalaat(1)	85-68-7	POS	1,14 × 10-6	4,11 × 10-6	POS	1,98 × 10-6	POS (12/14)	POS	NEG
   13	Corticosteron(1)	50-22-6	NEG	—	—	NEG	—	NEG (6/6)	NEG	NT
   14	Coumestrol(1)	479-13-0	POS	1,23 × 10-9	2,00 × 10-8	POS	1,32 × 10-7	POS (30/30)	POS	NT
   15	Daidzeïne(1)	486-66-8	POS	1,76 × 10-8	1,51 × 10-7	POS	7,95 × 10-7	POS (39/39)	POS	POS
   16	Diëthylstilboestrol(1)	56-53-1	POS	< 1,00 × 10-11	2,04 × 10-11	POS	3,34 × 10-11	POS (42/42)	POS	NT
   17	Di-n-butylftalaat	84-74-2	POS	4,09 × 10-6		POS	4,09 × 10-6	POS (6/11)	POS	NEG
   18	Ethylparabeen	120-47-8	POS	5,00 × 10-6	(geen PC50)	POS	2,48 × 10-5	POS		NT
   19	Oestron(1)	53-16-7	POS	3,02 × 10-11	5,88 × 10-10	POS	2,34 × 10-10	POS (26/28)	POS	POS
   20	Genisteïne(1)	446-72-0	POS	2,24 × 10-9	2,45 × 10-8	POS	2,71 × 10-7	POS (100/102)	POS	POS
   21	Haloperidol	52-86-8	NEG	—	—	NEG	—	NEG (2/2)	NEG	NT
   22	Kaempferol(1)	520-18-3	POS	1,36 × 10-7	1,21 × 10-6	POS	3,99 × 10-6	POS (23/23)	POS	NT
   23	Kepone(1)	143-50-0	POS	7,11 × 10-7	7,68 × 10-6	POS	4,91 × 10-7	POS (14/18)	POS	NT
   24	Ketoconazool	65277-42-1	NEG	—	—	NEG	—	NEG (2/2)	NEG	NT
   25	Linuron(1)	330-55-2	NEG	—	—	NEG	—	NEG (8/8)	NEG	NT
   26	meso-Hexestrol(1)	84-16-2	POS	< 1,00 × 10-11	2,75 × 10-11	POS	1,65 × 10-11	POS (4/4)	POS	NT
   27	Methyltestosteron(1)	58-18-4	POS	1,73 × 10-7	4,11 × 10-6	POS	2,68 × 10-6	POS (5/6)	POS	NT
   28	Morine	480-16-0	POS	5,43 × 10-7	4,16 × 10-6	POS	2,37 × 10-6	POS (2/2)	POS	NT
   29	Noretynodrel(1)	68-23-5	POS	1,11 × 10-11	1,50 × 10-9	POS	9,39 × 10-10	POS (5/5)	POS	NT
   30	p,p’-Methoxychloor(1)	72-43-5	POS	1,23 × 10-6	(geen PC50)(2)	POS	1,92 × 10-6	POS (24/27)	POS	POS
   31	Fenobarbital(1)	57-30-7	NEG	—	—	NEG	—	NEG (2/2)	NEG	NT
   32	Reserpine	50-55-5	NEG	—	—	NEG	—	NEG (4/4)	NEG	NT
   33	Spironolacton(1)	52-01-7	NEG	—	—	NEG	—	NEG (4/4)	NEG	NT
   34	Testosteron	58-22-0	POS	2,82 × 10-8	9,78 × 10-6	POS	1,75 × 10-5	POS (5/10)	POS	NT

   Tabel 2

   Vergelijking van de resultaten van de STTA-bepaling en de VM7Luc-ER TA-bepaling voor stoffen die aan beide antagonismebepalingen zijn onderworpen en zijn ingedeeld als ER-antagonisten (POS) of negatief (NEG)

   	Stof(1)	CAS RN	ER STTA-bepaling(3)		VM7Luc-ER TA-bepaling(4)		Verwachte effecten van de ER STTA(6)	Consensuele indeling door het ICCVAM(7)	Chemische klasse volgens de MeSH(8)	Productcategorie(9)
   			ER TA -activiteit	IC50-waarde(2) (M)	ER TA -activiteit	IC50-waarde(2),(5) (M)
   1	4-Hydroxytamoxifen	68047-06-3	POS	3,97 × 10-9	POS	2,08 × 10-7	matig POS	POS	Koolwaterstof (cyclisch)	Geneesmiddel
   2	Dibenzo[a,h]antraceen	53-70-3	POS	Geen IC50	POS	Geen IC50	POS	PP	Polycyclische verbinding	Laboratoriumstof, natuurlijk product
   3	Mifepriston	84371-65-3	POS	5,61 × 10-6	NEG	—	mild POS	NEG	Steroïde	Geneesmiddel
   4	Raloxifeen HCl	82640-04-8	POS	7,86 × 10-10	POS	1,19 × 10-9	matig POS	POS	Koolwaterstof (cyclisch)	Geneesmiddel
   5	Tamoxifen	10540-29-1	POS	4,91 × 10-7	POS	8,17 × 10-7	POS	POS	Koolwaterstof (cyclisch)	Geneesmiddel
   6	17β-oestradiol	50-28-2	NEG	—	NEG	—	PN	PN	Steroïde	Geneesmiddel, diergeneesmiddel
   7	Apigenine	520-36-5	NEG	—	NEG	—	NEG	NEG	Heterocyclische verbinding	Kleurstof, natuurlijk product, farmaceutisch tussenproduct
   8	Atrazine	1912-24-9	NEG	—	NEG	—	NEG	PN	Heterocyclische verbinding	Herbicide
   9	Di-n-butylftalaat	84-74-2	NEG	—	NEG	—	NEG	NEG	Ester, ftaalzuur	Cosmetisch bestanddeel, industriële chemische stof, weekmaker
   10	Fenarimol	60168-88-9	NEG	—	NEG	—	niet getest	PN	Heterocyclische verbinding, pyrimidine	Fungicide
   11	Flavon	525-82-6	NEG	—	NEG	—	PN	PN	Flavonoïde, heterocyclische verbinding	Natuurlijk product, geneesmiddel
   12	Flutamide	13311-84-7	NEG	—	NEG	—	NEG	PN	Amide	Geneesmiddel, diergeneesmiddel
   13	Genisteïne	446-72-0	NEG	—	NEG	—	PN	NEG	Flavonoïde, heterocyclische verbinding	Natuurlijk product, geneesmiddel
   14	p-n-nonylfenol	104-40-5	NEG	—	NEG	—	niet getest	NEG	Fenol	Chemisch tussenproduct
   15	Resveratrol	501-36-0	NEG	—	NEG	—	PN	NEG	Koolwaterstof (cyclisch)	Natuurlijk product

   COMPONENTEN VAN DE ER TA-BEPALING

   Essentiële componenten van de bepaling

   Deze testmethode is van toepassing op bepalingen waarbij gebruikgemaakt wordt van een stabiel getransfecteerde of endogene ERα receptor en een stabiel getransfecteerd reportergenconstruct gestuurd door een of meer oestrogeenresponselementen. Er kunnen evenwel ook andere receptoren aanwezig zijn, zoals ERβ. Dit zijn essentiële componenten van de bepaling.

   Controles

   Voor elke agonisme- en antagonismebepaling moet de keuze van de gelijktijdige referentiestandaarden worden onderbouwd. Gelijktijdige controles (negatieve controle, oplosmiddelcontrole en positieve controle), voor zover van toepassing, dienen als indicatie dat de bepaling werkt onder de testomstandigheden, en zorgen dat de verschillende experimenten met elkaar vergeleken kunnen worden. Ze maken doorgaans deel uit van de aanvaardbaarheidscriteria voor een bepaald experiment (1).

   Standaard kwaliteitscontroleprocedures

   De standaard kwaliteitscontroleprocedures moeten worden uitgevoerd zoals beschreven voor elke bepaling, om er zeker van te zijn dat de cellijn gedurende meerdere passages stabiel blijft, vrij blijft van mycoplasma (d.w.z. vrij van bacteriële besmetting) en in de loop van de tijd haar vermogen behoudt om de verwachte ER-gemedieerde responsen te geven. De cellijnen moeten bovendien worden gecontroleerd op de juiste identiteit en op andere verontreinigingen (bv. schimmels, gisten en virussen).

   Aantoning van de bekwaamheid van laboratoria

   Alvorens onbekende chemische stoffen te testen met een van de bepalingen die onder deze testmethode vallen, moet elk laboratorium zijn bekwaamheid in het gebruik van de bepaling aantonen. Om zijn bekwaamheid aan te tonen moet elk laboratorium voor de agonismebepaling de 14 stoffen voor bekwaamheidstoetsing testen die zijn opgesomd in tabel 3, en voor de antagonismebepaling de 10 stoffen voor bekwaamheidstoetsing die zijn opgesomd in tabel 4. Deze bekwaamheidstoetsing dient eveneens ter bevestiging van het responsvermogen van het testsysteem. De lijst van stoffen voor bekwaamheidstoetsing is een subset van de referentiestoffen die worden aangegeven in de prestatienormen voor de ER TA-bepalingen (6). Deze stoffen zijn in de handel verkrijgbaar, vertegenwoordigen chemische klassen waarbij doorgaans sprake is van ER-agonistische of antagonistische activiteit, vertonen een geschikt potentiebereik voor de verwachte potentie van de ER-(ant)agonisten (d.w.z. sterk tot zwak) en voorzien ook in negatieve responsen. De stoffen voor bekwaamheidstoetsing moeten ten minste tweemaal, op verschillende dagen getest worden. De bekwaamheid wordt aangetoond door een correcte indeling (positief/negatief) van elke stof. De bekwaamheidstoetsing moet worden herhaald door elke onderzoeker die de bepalingen leert. Afhankelijk van het celtype kunnen sommige van deze stoffen zich als SERM’s gedragen en zowel agonistische als antagonistische activiteit vertonen. In de tabellen 3 en 4 worden de stoffen voor bekwaamheidstoetsing echter ingedeeld op basis van de activiteit waarvan bekend is dat deze het sterkst is, en dat is de activiteit die moet worden gebruikt om de bekwaamheid te beoordelen.

   Als bewijs van de prestaties en ten behoeve van de kwaliteitscontrole moet elk laboratorium historische databanken van agonisten en antagonisten bijhouden met gegevens over de referentiestandaarden (bv. 17β-oestradiol en tamoxifen), de positieve en negatieve controlestoffen en de oplosmiddelcontrole (bv. DMSO). Aanvankelijk moet de databank gegenereerd worden op basis van ten minste 10 onafhankelijke testruns voor agonisten (bv. 17β-oestradiol) en 10 voor antagonisten (bv. tamoxifen). De resultaten van latere analyses van deze referentiestandaarden en oplosmiddelcontroles moeten worden toegevoegd om de databank uit te breiden en de consistentie en prestaties van de bioassay door het laboratorium in de loop van de tijd te waarborgen.

   Tabel 3

   Lijst van (14) stoffen voor bekwaamheidstoetsing voor agonismebepaling⁽⁸⁾

   Nr.(7)	Stof	CAS RN	Verwachte respons(1)	STTA-bepaling			VM7Luc-ER TA-bepaling		Chemische klasse volgens de MeSH(5)	Productcategorie(6)
   				PC10-waarde (M)(2)	PC50-waarde (M)(2)	Testconcentratiebereik (M)	EC50-waarde VM7Luc (M)(3)	Hoogste conc. voor bereikbepaling (M)(4)
   14	Diëthylstilboestrol	56-53-1	POS	< 1,00 × 10-11	2,04 × 10-11	10-14 – 10-8	3,34 × 10-11	3,73 × 10-4	Koolwaterstof (cyclisch)	Geneesmiddel, diergeneesmiddel
   12	17α-oestradiol	57-91-0	POS	4,27 × 10-11	6,44 × 10-10	10-11 – 10-5	1,40 × 10-9	3,67 × 10-3	Steroïde	Geneesmiddel, diergeneesmiddel
   15	meso-Hexestrol	84-16-2	POS	< 1,00 × 10-11	2,75 × 10-11	10-11 – 10-5	1,65 × 10-11	3,70 × 10-3	Koolwaterstof (cyclisch), fenol	Geneesmiddel, diergeneesmiddel
   11	4-tert-Octylfenol	140-66-9	POS	1,85 × 10-9	7,37 × 10-8	10-11 – 10-5	3,19 × 10-8	4,85 × 10-3	Fenol	Chemisch tussenproduct
   9	Genisteïne	446-72-0	POS	2,24 × 10-9	2,45 × 10-8	10-11 – 10-5	2,71 × 10-7	3,70 × 10-4	Flavonoïde, heterocyclische verbinding	Natuurlijk product, geneesmiddel
   6	Bisfenol A	80-05-7	POS	2,02 × 10-8	2,94 × 10-7	10-11 – 10-5	5,33 × 10-7	4,38 × 10-3	Fenol	Chemisch tussenproduct
   2	Kaempferol	520-18-3	POS	1,36 × 10-7	1,21 × 10-6	10-11 – 10-5	3,99 × 10-6	3,49 × 10-3	Flavonoïde, heterocyclische verbinding	Natuurlijk product
   3	Butylbenzylftalaat	85-68-7	POS	1,14 × 10-6	4,11 × 10-6	10-11 – 10-5	1,98 × 10-6	3,20 × 10-4	Carbonzuur, ester, ftaalzuur	Weekmaker, industriële chemische stof
   4	p,p’-Methoxychloor	72-43-5	POS	1,23 × 10-6	—	10-11 – 10-5	1,92 × 10-6	2,89 × 10-3	Koolwaterstof (gehalogeneerd)	Pesticide, diergeneesmiddel
   1	Ethylparabeen	120-47-8	POS	5,00 × 10-6	—	10-11 – 10-5	2,48 × 10-5	6,02 × 10-3	Carbonzuur, fenol	Geneesmiddel, conserveringsmiddel
   17	Atrazine	1912-24-9	NEG	—	—	10-10 – 10-4	—	4,64 × 10-4	Heterocyclische verbinding	Herbicide
   20	Spironolacton	52-01-7	NEG	—	—	10-11 – 10-5	—	2,40 × 10-3	Lacton, steroïde	Geneesmiddel
   21	Ketoconazool	65277-42-1	NEG	—	—	10-11 – 10-5	—	9,41 × 10-5	Heterocyclische verbinding	Geneesmiddel
   22	Reserpine	50-55-5	NEG	—	—	10-11 – 10-5	—	1,64 × 10-3	Heterocyclische verbinding, indool	Geneesmiddel, diergeneesmiddel

   Tabel 4

   Lijst van (10) stoffen voor bekwaamheidstoetsing voor antagonismebepaling

   	Stof(2)	CAS RN	ER STTA-bepaling(3)			VM7Luc-ER TA-bepaling(4)			Verwachte effecten ER STTA(3)	Consensuele indeling door het ICCVAM(7)	Chemische klasse volgens de MeSH(8)	Productcategorie(9)
   			ER TA-activiteit	IC50 (M)	Testconcentratiebereik (M)	ER TA-activiteit	IC50 (5) (M)	Hoogste conc. voor bereikbepaling (M)(6)
   1	4-Hydroxytamoxifen	68047-06-3	POS	3,97 × 10-9	10-12 – 10-7	POS	2,08 × 10-7	2,58 × 10-4	matig POS	POS	Koolwaterstof (cyclisch)	Geneesmiddel
   2	Raloxifeen HCl	82640-04-8	POS	7,86 × 10-10	10-12 – 10-7	POS	1,19 × 10-9	1,96 × 10-4	matig POS	POS	Koolwaterstof (cyclisch)	Geneesmiddel
   3	Tamoxifen	10540-29-1	POS	4,91 × 10-7	10-10 – 10-5	POS	8,17 × 10-7	2,69 × 10-4	POS	POS	Koolwaterstof (cyclisch)	Geneesmiddel
   4	17β-Oestradiol	50-28-2	NEG	—	10-9 – 10-4	NEG	—	3,67 × 10-3	naar verwachting NEG(*)	PN	Steroïde	Geneesmiddel, diergeneesmiddel
   5	Apigenine	520-36-5	NEG	—	10-9 – 10-4	NEG	—	3,70 × 10-4	NEG	NEG	Heterocyclische verbinding	Kleurstof, natuurlijk product, farmaceutisch tussenproduct
   6	Di-n-butylftalaat	84-74-2	NEG	—	10-8 – 10-3	NEG	—	3,59 × 10-3	NEG	NEG	Ester, ftaalzuur	Cosmetisch bestanddeel, industriële chemische stof, weekmaker
   7	Flavon	525-82-6	NEG	—	10-8 – 10-3	NEG	—	4,50 × 10-4	naar verwachting NEG(*)	PN	Flavonoïde, heterocyclische verbinding	Natuurlijk product, geneesmiddel
   8	Genisteïne	446-72-0	NEG	—	10-9 – 10-4	NEG	—	3,70 × 10-4	naar verwachting NEG(*)	NEG	Flavonoïde, heterocyclische verbinding	Natuurlijk product, geneesmiddel
   9	p-n-Nonylfenol	104-40-5	NEG	—	10-9 – 10-4	NEG	—	4,54 × 10-4	niet getest	NEG	Fenol	Chemisch tussenproduct
   10	Resveratrol	501-36-0	NEG	—	10-8 – 10-3	NEG	—	4,38 × 10-4	naar verwachting NEG(*)	NEG	Koolwaterstof (cyclisch)	Natuurlijk product

   Aanvaardbaarheidscriteria voor de testrun

   Of een testrun aanvaard of verworpen wordt, hangt af van de beoordeling van de resultaten voor de referentiestandaarden en de controles die voor elk experiment worden gebruikt. De waarden voor de PC50 (EC50) of IC50 voor de referentiestandaarden moeten voldoen aan de aanvaardbaarheidscriteria voor de gekozen bepaling (voor de STTA-bepaling zie aanhangsel 2, voor de VM7Luc-ER TA-bepaling zie aanhangsel 3) en alle positieve/negatieve controles moeten voor elk aanvaard experiment correct zijn ingedeeld. Het laboratorium moet aantonen de bepaling consistent te kunnen uitvoeren door een historische databank van de referentiestandaarden en controles op te zetten en bij te houden (zie punt 15). Als maatstaf voor de intralaboratoriumreproduceerbaarheid kunnen de standaarddeviaties (SD) of variatiecoëfficiënten (CV) van de gemiddelden van de curve-fittingsparameters voor de referentiestandaarden van meerdere experimenten worden gebruikt. Bovendien moet aan de volgende beginselen in verband met de aanvaardbaarheidscriteria worden voldaan:

   • er moeten voldoende gegevens zijn voor een kwantitatieve beoordeling van de ER-activering (voor een agonismebepaling) of ER-remming (voor een antagonismebepaling) (d.w.z. effectiviteit en potentie);

   • om zeker te zijn van voldoende gevoeligheid moet de gemiddelde reporteractiviteit voor de referentieconcentratie van het referentieoestrogeen hoger zijn dan of gelijk aan de minimale activiteit zoals gespecificeerd in de testmethodes in verhouding tot de activiteit van de vehiculumcontrole (oplosmiddelcontrole). Voor de STTA-bepaling en de VM7Luc-ER TA-bepaling betekent dit viermaal zo hoog als de gemiddelde activiteit van de vehiculumcontrole voor elke plaat;

   • de geteste controles moeten binnen het oplosbaarheidsbereik van de teststoffen blijven en mogen geen cytotoxiciteit vertonen.

   Analyse van de gegevens

   Om te bepalen of een respons positief of negatief is, moet de voor elke bepaling vastgestelde procedure voor gegevensinterpretatie worden gebruikt.

   Als aan de aanvaardbaarheidscriteria (punt 16) wordt voldaan, betekent dit weliswaar dat de bepaling naar behoren functioneert, maar wil dit nog niet zeggen dat een bepaalde testrun kloppende gegevens produceert. Het reproduceren van de resultaten van de eerste testrun is de beste indicatie dat de geproduceerde gegevens kloppen. Als twee testruns reproduceerbare gegevens opleveren (bv. de resultaten van beide testruns wijzen uit dat een teststof positief is), is het niet nodig om een derde testrun uit te voeren.

   Als twee testruns geen reproduceerbare resultaten opleveren (bv. een teststof is positief in de ene en negatief in de andere testrun), of als er meer zekerheid nodig is over de uitkomst van deze bepaling, moeten ten minste drie onafhankelijke testruns worden uitgevoerd. In dat geval wordt de indeling gebaseerd op de twee van de drie resultaten die overeenkomen.

   Algemene criteria voor gegevensinterpretatie

   Er is op vooralsnog geen algemeen erkende methode voor het interpreteren van ER TA-gegevens, maar kwalitatieve (bv. positieve/negatieve) en/of kwantitatieve (bv. EC50, PC50, IC50) beoordelingen van ER-gemedieerde activiteit moeten wel stoelen op empirische gegevens en wetenschappelijk verantwoorde afwegingen. Waar mogelijk moeten positieve resultaten worden gespecificeerd met zowel de grootte van het effect in vergelijking met de vehiculumcontrole (oplosmiddelcontrole) of het referentie-oestrogeen, als de concentratie waarbij het effect optreedt (bv. een EC50, PC50, RPCMax, IC50 enz.).

   Testverslag

   In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

   • Bepaling:

     • de gebruikte bepaling;

     • controle/referentiestandaard/teststof;

     • Bron, partijnummer, uiterste gebruiksdatum, indien beschikbaar;

     • stabiliteit van de teststof, indien bekend;

     • oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel, indien bekend;

     • meting van pH, osmolaliteit en neerslag in het kweekmedium waaraan de teststof werd toegevoegd, indien van toepassing.

   • Stof die uit één component bestaat:

     • fysisch voorkomen, oplosbaarheid in water en aanvullende relevante fysisch-chemische eigenschappen;

     • chemische identificatiegegevens, zoals IUPAC- of CAS-naam, CAS-nummer, SMILES- of InChI-code, structuurformule, zuiverheid, chemische identiteit van onzuiverheden, indien van toepassing en praktisch haalbaar enz.

   • Stof die uit meerdere componenten bestaat, UVCB’s en mengsels:

     • voor zover mogelijk, karakterisering aan de hand van chemische identiteit (zie hierboven), kwantitatief voorkomen en relevante fysisch-chemische eigenschappen van de bestanddelen.

   • Oplosmiddel/vehiculum:

     • karakterisering (aard, leverancier en partij);

     • motivering voor de keuze van het oplosmiddel/vehiculum;

     • oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/vehiculum, indien bekend.

   • Cellen:

     • type en bron van de cellen:

       • is er endogene expressie van de ER? Zo niet, welke reporter(s) werd(en) er getransfecteerd?

       • het/de gebruikte reporterconstruct(en) (waaronder brondiersoort(en));

       • transfectiemethode;

       • selectiemethode voor het handhaven van stabiele transfectie (indien van toepassing);

       • is de transfectiemethode relevant voor stabiele cellijnen?

     • aantal passages (na ontdooiing);

     • aantal passages van cellen bij ontdooiing;

     • methoden om de celculturen in leven te houden.

   • Testomstandigheden:

     • Beperkte oplosbaarheid;

     • Beschrijving van de methoden die zijn toegepast voor de beoordeling van de levensvatbaarheid;

     • mediumsamenstelling, CO2-concentratie;

     • concentraties van de teststof;

     • toegevoegd volume vehiculum en teststof;

     • incubatietemperatuur en vochtigheidsgraad;

     • duur van de behandeling;

     • celdichtheid bij aanvang van en tijdens de behandeling;

     • positieve en negatieve referentiestandaarden;

     • reporterreagentia (productnaam, leverancier en partij);

     • criteria om te bepalen of het resultaat van een testrun positief, negatief of onduidelijk is.

   • Aanvaardbaarheidscontrole:

     • x-voudige inducties voor elke testplaat en of deze aan het minimum voldoen dat op basis van de historische controles voor de bepaling vereist is;

     • daadwerkelijke waarden voor de aanvaardbaarheidscriteria, bv. log10EC50, log10PC50, log10IC50 en Hill-coëfficiënten, voor de gelijktijdige positieve controles/referentiestandaarden.

   • Resultaten:

     • ruwe en genormaliseerde gegevens;

     • het maximale x-voudige-inductieniveau;

     • cytotoxiciteitsgegevens;

     • in voorkomend geval, de laagste effectieve concentratie (LEC);

     • RPCMax, PCMax, PC50, IC50en/of EC50, voor zover van toepassing;

     • indien mogelijk het verband tussen concentratie en respons;

     • statistische analyses, indien uitgevoerd, samen met een maat voor de fout en de betrouwbaarheid (bv. SEM, SD, CV of 95 %-BI) en een beschrijving hoe deze waarden zijn verkregen.

   • Bespreking van de resultaten

   • Conclusie

   LITERATUUR

   1. OESO (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   2. OESO (2015). Report of the Inter-Laboratory Validation for Stably Transfected Transactivation Assay to detect Estrogenic and Anti-estrogenic Activity. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 225), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   3. ICCVAM (2011). ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (BG1Luc ER TA) Test Method, an In Vitro Method for Identifying ER Agonists and Antagonists, National Institute of Environmental Health Sciences: Research Triangle Park, NC.

   4. Pujol P. et al. (1998). Differential Expression of Estrogen Receptor-Alpha and -Beta Messenger RNAs as a Potential Marker of Ovarian Carcinogenesis, Cancer. Res., 58(23): p. 5367-73.

   5. Rogers J.M. and Denison M.S. (2000). Recombinant Cell Bioassays for Endocrine Disruptors: Development of a Stably Transfected Human Ovarian Cell Line for the Detection of Estrogenic and Anti-Estrogenic Chemicals, In Vitro and Molecular Toxicology: Journal of Basic and Applied Research, 13(1): p. 67-82.

   6. OESO (2012). Performance Standards For Stably Transfected Transactivation In Vitro Assay to Detect Estrogen Receptor Agonists (for TG 455). Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 173), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   7. OESO (2015). Performance Standards For Stably Transfected Transactivation In Vitro Assay to Detect Estrogen Receptor Antagonists. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 174), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   8. OESO (2012). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 150), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs.

   9. Cavailles V. (2002). Estrogens and Receptors: an Evolving Concept. Climacteric, 5 Suppl 2: p. 20- 6.

   10. Welboren W.J. et al. (2009). Genomic Actions of Estrogen Receptor Alpha: What are the Targets and how are they Regulated? Endocr. Relat. Cancer, 16(4): p. 1073-89.

   11. Younes M. and Honma N. (2011). Estrogen Receptor Beta, Arch. Pathol. Lab. Med., 135(1): p. 63- 6.

   12. Jefferson W.N., et al. (2002). Assessing Estrogenic Activity of Phytochemicals Using Transcriptional Activation and Immature Mouse Uterotrophic Responses, Journal of Chromatography B, 777(1-2): p. 179-189.